Elaboración de un algoritmo para la determinación de parámetros cinéticos de una enzima que presenta inhibición por sustrato.

Abstract

INTRODUCCIÓN. La caracterización de una reacción catalizada por una enzima puede hacerse por medio de un estudio cinético de dicha enzima. La caracterización básica y clásica de una. enzima consiste en la determinación de la ecuación de velocidad por la que se rige y, consecuentemente, de las constantes de velocidad, equilibrio y de inhibición (Km, Vma, y Kb principalmente). La cinética más sencilla se reduce al presupuesto de que las reacciones catalizadas por enzimas se rigen por la ecuación- de Michaelis y Menten (ver anexo de ecuaciones), la cual representa una reacción de saturación, las que producen el gráfico de una hipérbola rectangular. En el pasado, para determinar las constantes cinéticas deseadas, las mediciones experimentales se transformaban de tal manera que se obtenía una linealización de dicha ecuación. Las ecuaciones de Lineweaver-Burk y de Eadie-Hofstee son transformaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten, que son comúnmente utilizadas para determinar Km y V„,„, (ver anexo de ecuaciones). Estas linealizaciones, sin embargo, conllevan mucho error, ya que al transformar los datos no se está tomando en cuenta la transformación que están sufriendo las incertidumbres, por lo que los resultados de tales gráficas son muy inexactos. Al hacer el gráfico de una reacción catalizada por una enzima que presenta un mecanismo de inhibición por sustrato, tal como la acetilcolinesterasa, se observa claramente que ésta no cumple con la ecuación de Michaelis-Menten, pues la curva tiene una forma acampanada cuando se gráfica velocidad versus logaritmo de la concentración del sustrato. Las ecuaciones simples utilizadas en cinética clásica son de poca utilidad en estos casos. Para determinar los parámetros cinéticos de dicha enzima, es necesario recurrir a métodos de análisis sofisticados. Debido a que la ecuación de la velocidad es relativamente compleja y difícilmente podría transformarse a una ecuación lineal, se debe llevar a cabo un ajuste del tipo regresión no lineal. Una regresión no lineal no se puede realizar en forma directa, sino que requiere de un proceso iterativo. Esto significa que involucra una serie de pasos y toma de decisiones de las cuales dependerá la calidad y la confiabilidad de los resultados finales. En el caso particular de la acetilcolinesterasa, se desea comparar los resultados obtenidos de experimentos realizados bajo varias condiciones. No es necesario buscar la ecuación cinética correspondiente a cada conjunto de datos, sino una ecuación común por la cual se observe que se comportan todos los juegos de datos. La caracterización de la acetilcolinesterasa es de mucha importancia a nivel biológico y bioquímico, por tener esta enzima un papel trascendental en el funcionamiento del sistema nervioso de los vertebrados y de los invertebrados, y por ser un blanco fácil de inhibidores irreversibles, entre los que se encuentran una gran parte de plaguicidas y sustancias utilizadas en la guerra química. Esta enzima ha sido de amplio estudio desde hace muchas décadas, y su continua investigación se realiza con la finalidad de elaborar plaguicidas que sean menos tóxicos al ser humano, pero efectivos en contra de la plaga que se desea controlar, o antídotos eficientes contra intoxicaciones provocadas por agentes anticolinesterásicos. Para apoyar el trabajo de los enzimólogos cinetistas, este trabajo de investigación presenta una alternativa a los procesos largos y tediosos que se realizan para la determinación de los parámetros cinéticos en ecuaciones de velocidad no linealizables.