Abstract:
INTRODUCCIÓN. La caracterización de una reacción catalizada por una enzima puede
hacerse por medio de un estudio cinético de dicha enzima. La
caracterización básica y clásica de una. enzima consiste en la
determinación de la ecuación de velocidad por la que se rige y,
consecuentemente, de las constantes de velocidad, equilibrio y de
inhibición (Km, Vma, y Kb principalmente).
La cinética más sencilla se reduce al presupuesto de que las
reacciones catalizadas por enzimas se rigen por la ecuación- de
Michaelis y Menten (ver anexo de ecuaciones), la cual representa una
reacción de saturación, las que producen el gráfico de una hipérbola
rectangular. En el pasado, para determinar las constantes cinéticas
deseadas, las mediciones experimentales se transformaban de tal
manera que se obtenía una linealización de dicha ecuación. Las
ecuaciones de Lineweaver-Burk y de Eadie-Hofstee son
transformaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten, que
son comúnmente utilizadas para determinar Km y V„,„, (ver anexo de
ecuaciones). Estas linealizaciones, sin embargo, conllevan mucho
error, ya que al transformar los datos no se está tomando en cuenta la
transformación que están sufriendo las incertidumbres, por lo que los
resultados de tales gráficas son muy inexactos.
Al hacer el gráfico de una reacción catalizada por una enzima que
presenta un mecanismo de inhibición por sustrato, tal como la
acetilcolinesterasa, se observa claramente que ésta no cumple con la
ecuación de Michaelis-Menten, pues la curva tiene una forma
acampanada cuando se gráfica velocidad versus logaritmo de la
concentración del sustrato. Las ecuaciones simples utilizadas en
cinética clásica son de poca utilidad en estos casos. Para determinar
los parámetros cinéticos de dicha enzima, es necesario recurrir a
métodos de análisis sofisticados. Debido a que la ecuación de la
velocidad es relativamente compleja y difícilmente podría
transformarse a una ecuación lineal, se debe llevar a cabo un ajuste del
tipo regresión no lineal. Una regresión no lineal no se puede realizar
en forma directa, sino que requiere de un proceso iterativo. Esto
significa que involucra una serie de pasos y toma de decisiones de las
cuales dependerá la calidad y la confiabilidad de los resultados finales.
En el caso particular de la acetilcolinesterasa, se desea comparar los
resultados obtenidos de experimentos realizados bajo varias
condiciones. No es necesario buscar la ecuación cinética
correspondiente a cada conjunto de datos, sino una ecuación común
por la cual se observe que se comportan todos los juegos de datos.
La caracterización de la acetilcolinesterasa es de mucha
importancia a nivel biológico y bioquímico, por tener esta enzima un
papel trascendental en el funcionamiento del sistema nervioso de los
vertebrados y de los invertebrados, y por ser un blanco fácil de
inhibidores irreversibles, entre los que se encuentran una gran parte de
plaguicidas y sustancias utilizadas en la guerra química. Esta enzima
ha sido de amplio estudio desde hace muchas décadas, y su continua
investigación se realiza con la finalidad de elaborar plaguicidas que
sean menos tóxicos al ser humano, pero efectivos en contra de la plaga
que se desea controlar, o antídotos eficientes contra intoxicaciones
provocadas por agentes anticolinesterásicos.
Para apoyar el trabajo de los enzimólogos cinetistas, este trabajo de
investigación presenta una alternativa a los procesos largos y tediosos
que se realizan para la determinación de los parámetros cinéticos en
ecuaciones de velocidad no linealizables.