Bacterias transgénicas para el control de enfermedades transmitidas por vectores.

Abstract

Este trabajo de investigación surge por la necesidad de desarrollar nuevas tecnologías para el control vectorial de enfermedades tropicales. La enfermedad de Borreliosis, causada por la bacteria Borrelia turicatae, presenta síntomas muy parecidos a los presentados por otras enfermedades. Esto complica el diagnóstico de la enfermedad y resulta en una subestimación de la incidencia reportada. Actualmente no existe un método estándar para el diagnóstico de la Borreliosis. Por lo tanto, en este trabajo se trata de estandarizar un método de producción y purificación de una proteína recombinanate BipA de B. turicatae. Actualmente no existe un método estándar para el diagnóstico de la Borreliosis, dado esto es necesario desarrollar pruebas diagnósticas para la enfermedad. Por lo tanto esta investigación transformó una cepa especializada de E.coli (BL21(DE3)) y plásmido pET-19B para producción de proteínas recombinantes GlpQ de Borrelia spp. y BipA de B. turicatae. Las bacterias transformadas fueron inducidas y luego, partir de optimización de metodología de lisado, se eligió el lisado enzimático para aumentar rendimiento de liberación de proteína recombinante. Posteriormente se purificó BipAr marcada por histidinas mediante columnas de níquel HisTrap FF (General Electric). Se analizó el rendimiento mediante espectrofotometría 280 nm y la estabilidad en presencia y ausencia de un inhibidor de proteasas (PMSF 1 mM) en la fracción eluida. Se determinó que la estabilidad de la proteína durante el procedimiento de lisis y purificación mejora con la adición de PMSF. La concentración de la proteína purificada fue de 0.1107 mg/ml. Se concluye que la proteína BipAr fue purificada exitosamente. Por otro lado, la enfermedad de malaria es causada por el parásito del género Plasmodium transmitido por la picadura de mosquitos del género Anopheles. En Guatemala esta enfermedad ha sido controlada recientemente con la distribución masiva de pabellones impregnados con insecticidas; pero la eficacia de este método de control está disminuyendo debido al surgimiento de resistencias. El presente trabajo de investigación describe la optimización de métodos para desarrollar una nueva tecnología de control vectorial de malaria, basada en la producción de machos estériles de An. albimanus. Se logró clonar el inserto del gen BOL y del gen ZPG en las cepas de E. coli y se determinó que los insertos no son estables (son tóxicos e inducen reordenamientos en el plásmido pGEMT-AmpRBOL/ ZPG). El método de alimentación para larvas de An. albimanus conteniendo E. coli expresando ARNdh de Arabidopsis thaliana, permite el desarrollo larvario adecuado y no interfiere con el tiempo de eclosión de pupa a adulto ni con la ovipostura. Se encontró que existe más de una pareja de oligonucleótidos de genes control y de espermatogénesis que podrían ser utilizados para monitorear la expresión de los genes BOL y ZPG a través de electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio o PCR tiempo real. El mejor oligonucleótido de genes control para el monitoreo en larvas y pupas de An. albimanus es AaRpS7, mientras que para el monitoreo en adultos el mejor es AaRIB43A2. Se puede decir que el método de alimentación para larvas de An. albimanus con bacteria transgénica sí puede utilizarse en estudios posteriores para evaluar efectividad del silenciamiento de genes a través del fenotipo y cuantificación de reducción de expresión con PCR tiempo real. Sin embargo, es necesario seleccionar regiones más cortas de los genes BOL y ZPG para clonar en las cepas de E. coli. Posteriormente, se podría extrapolar la tecnología para otros genes y otras especies de mosquitos que presenten dichos genes.