Determinación de la localización subcelular de las proteínas que forman parte del regulador transcripcional híbrido Nrg1-Rtg3 en Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Los reguladores transcripcionales híbridos han surgido como una ventaja evolutiva en la levadura de Saccharomyces cerevisiae, ya que han demostrado modular procesos metabólicos y fisiológicos, como lo es el mecanismo de fermentación y respiración característico de este organismo. El regulador transcripcional híbrido Nrg1-Rtg3 ha sido descubierto recientemente como un complejo que mantiene la integridad del ADN mitocondrial. La presencia de la quimera se determinó mediante un ensayo de coinmunoprecipitación, sin embargo, aún se requiere de otros métodos para determinar su estabilidad y regulación en la célula. Por este motivo, el objetivo principal de este trabajo fue optimizar la técnica de PCR de Extensión Superpuesta (OE-PCR) para obtener fragmentos de ADN con regiones complementarias al ORF5´y UTR3´de NRG1 y RTG3 fusionados con proteínas fluorescentes con el fin de generar proteínas etiquetadas, siendo Nrg1-yECitrine y Rtg3-mCherry. Ambos fragmentos se obtuvieron empleando diferentes pasos en la técnica de OE-PCR; para Nrg1-yECitrine se utilizó una sola reacción que integró la superposición y amplificación de los fragmentos, mientras que, para Rtg3-mCherry se emplearon cuatro reacciones independientes (dos de superposición y dos de amplificación). Además, se confirmó el fenotipo de las mutantes sencillas nrg1Δ y rtg3Δ donde se determinó la función principal de la quimera respecto a lo previamente descrito. Por último, se diseñó un protocolo para la ligación del constructo a un plásmido multicopia pRS416 y su posterior transformación en E.coli. Se demostró la validación del protocolo de OE-PCR para el fragmento de Nrg1-yECitrine, puesto que, se obtuvieron 6 cepas etiquetadas confirmadas mediante PCR. Para el caso de Rtg3-mCherry, aún no se han obtenido cepas etiquetadas; se recomienda secuenciar ambos fragmentos para determinar errores en las secuencias y repetir la transformación en S. cerevisiae. . también, se recomienda un diseño correcto de oligos quiméricos y anidados, así como determinar la temperatura óptima de alineamiento de las reacciones. Se espera observar ambas proteínas etiquetadas mediante microscopía confocal y responder preguntas cómo en qué momento se forma el híbrido y si su localización subcelular influye en su función de mantener el ADN mitocondrial. (LA)