Desarrollo de protocolo para evaluación de la enzima metabólica glutatión-S-transferasa GSTE2 en larvas de Aedes aegypti (Linnaeus 1762).

Abstract

Este trabajo de tesis buscó desarrollar un protocolo estandarizado para poder evaluar la expresión de la enzima GSTE2 asociada a la resistencia a un larvicida organofosforado de uso generalizado denominado Temefos, en poblaciones de campo de larvas de Aedes aegypti. Este protocolo se fundamento en la elaboración de diferentes Procedimientos Operacionales Estándar (POE) de las etapas para la evaluación de la resistencia a Temefos en las larvas de Ae. aegypti. La resistencia fenotípica a los insecticidas fue estimada en una población, por medio de bioensayos. Estos bioensayos consistieron en exponer durante 24 horas larvas de tercero y/o cuarto estadío a la dosis diagnóstica de 0.012 ppm Temefos y luego se preservó el ARN de aquellos individuos que presentaron resistencia. Se efectuó la extracción de ARN mediante un método optimizado con TRIzol™ en grupos de 10 larvas de tercer estadío. Seguidamente se realizó un PCR convencional para la estimación de presencia de ADN contaminante utilizando oligonucleótidos (“primers”) de referencia del exón 31, prueba para la mutación F1534C, relacionada a kdr. Después del PCR, se llevó a cabo un tratamiento de las muestras de ARN con el kit RQ1 RNase-Free DNase (Promega) con el fin de eliminar cualquier ADN contaminante. Luego del tratamiento se procedió a hacer otro PCR convencional para confirmar la ausencia de ADN contaminante, de manera a proceder a hacer la síntesis de ADN complementario. El ADN complementario permitió estandarizar los primers (GSTE2F y GSTE2R) mediante una curva de eficiencia, permitiendo estandarizar las condiciones para análisis de expresión génica en futuros estudios. (LA)