Construcción genética de una tecnología bioluminiscente para su uso potencial en el monitoreo de la propagación de bacterias patógenas

Abstract

Las enfermedades de plantas generan pérdidas anuales de hasta 220 mil millones de dólares, según la FAO (2021). Entre los agentes fitopatógenos, Ralstonia solanacearum (RS) se identifica como la segunda bacteria más importante económicamente, afectando a más de 200 especies vegetales y causando pérdidas de hasta el 91% en cultivos de tomate. Esto subraya la necesidad de desarrollar estrategias innovadoras y sostenibles para su control. En este contexto, el uso de genes bioluminiscentes, como el operón luxCDABE, emerge como una herramienta biotecnológica innovadora para monitorear en tiempo real la propagación de patógenos en plantas. El objetivo principal de este estudio fue desarrollar un constructo genético para inducir bioluminiscencia en RS y evaluar su utilidad como herramienta de monitoreo en cultivos de tomate. Se seleccionó el plásmido ilux pGEX(-) por su tamaño razonable (10,873 pb) y alta frecuencia de transformación mediante recombinación homóloga. La transformación genética de RS se realizó por choque térmico, verificándose mediante emisión de bioluminiscencia con microscopía de fluorescencia. Aunque no fue posible confirmar la transformación por PCR, posiblemente debido a la interferencia de ADN cromosomal. Así mismo, se lograron recuperar células viables de RS ILUX de las plantas infectadas mediante centrifugación a 570 rpm durante 5 minutos a 4 °C, se obtuvieron 8 UFC con una desviación estándar de 3.30 y un intervalo de confianza del 95% de ±4.58, sugiriendo consistencia en los resultados. La tinción de Gram confirmó la viabilidad celular, mientras que la emisión de bioluminiscencia en las células recuperadas se verificó al tercer día post inoculación. Por último, se comprobó la emisión de bioluminiscencia de las células de RS ILUX recuperadas del tallo de plantas de tomate, utilizando un microscopio de fluorescencia, lo cual sugirió que es potencialmente aplicable el uso de la herramienta en el monitoreo de la propagación de RS en un cultivo de tomate. Más aún, la tecnología también podría ser aplicable en otros cultivos y en la industria alimentaria

According to the FAO (2021), plant diseases cause annual losses of up to 220 billion USD. Among phytopathogenic agents, Ralstonia solanacearum (RS) is identified as the second most economically significant bacterium, affecting more than 200 plant species and causing losses of up to 91% in tomato crops. This underscores the urgent need to develop innovative and sustainable strategies for its control.

In this context, the use of bioluminescent genes, such as the luxCDABE operon, emerges as an innovative biotechnological tool for real-time monitoring of pathogen propagation in plants. The main objective of this study was to develop a genetic construct to induce bioluminescence in RS and evaluate its usefulness as a monitoring tool in tomato crops. The ilux pGEX(-) plasmid was selected due to its manageable size (10,873 bp) and high transformation frequency via homologous recombination. Genetic transformation of RS was performed through heat shock, and was verified through bioluminescence emission observed under fluorescence microscopy. Although transformation could not be confirmed by PCR, this was likely due to chromosomal DNA interference.

Additionally, viable RS ILUX cells were successfully recovered from infected plants by centrifugation at 570 rpm for 5 minutes at 4 °C. A total of 8 CFU were obtained, with a standard deviation of 3.30 and a 95% confidence interval of ±4.58, suggesting consistency in the results. Gram staining confirmed cell viability, while bioluminescence emission from the recovered cells was verified on the third day post-inoculation.

Finally, bioluminescence emission from RS ILUX cells recovered from tomato plant stems was confirmed using fluorescence microscopy, suggesting that this tool is potentially applicable for monitoring the spread of RS in tomato crops. Moreover, the technology could also be applicable to other crops and to the food industry.