Evaluación de técnicas de extracción de ADN y de visualización para marcadores microsatélites en caña de azúcar (Saccharum spp.).

Abstract

Este trabajo contiene los resultados obtenidos en la comparación de cuatro técnicas de extracción de ADN aplicadas a caña de azúcar. Los protocolos fueron evaluados con el objetivo de establecer uno que permitiera la obtención de ADN de alta calidad para ser amplificado con partidores específicos, que por su realización y costo permitiera manipular un gran número de muestras y obtener una excelente visualización para caracterizar las más de 1000 variedades de caña de azúcar descritas en Guatemala. Se extrajo el ADN de tres variedades importantes en Guatemala por cuatro protocolos distintos y se amplificó por PCR usando partidores específicos, inmediato a la extracción y después de almacenamiento a 4°C por 14 y 30 días. Se visualizaron los polimorfismos de secuencia simple repetida (SSR) por electroforesis en gel de poliacrilamida al 5% con tinción de plata, por ser esta una técnica de alta resolución. Se observó que el protocolo propuesto por Wagner et al. (2001), basado en una extracción con NaOH, permite obtener ADN de baja calidad, no estable en almacenamiento a 4°C, por lo que no se puede amplificar. Los protocolos propuestos por Lobos y Seelenfreund (1999), Aljanabi et al. (1999) y da Silva (2003) permiten obtener ADN con buena integridad, pureza y estabilidad a 4°C por 30 días. Con los tres protocolos se observaron patrones de bandas característicos para cada una de las variedades analizadas. La diferencia entre los protocolos se encontró en el costo y realización; el primero resultó ser tedioso y de alto costo, mientras que los protocolos propuestos por Aljanabi et al. (1999) y da Silva (2003) resultaron ser de un costo moderado y pueden ser realizados en un dia. Se concluyó que ambos protocolos son los más eficientes para la caracterización de caña de azúcar, y que la elección de uno depende de los recursos y la disponibilidad de los reactivas. También se evaluó la estabilidad del producto de amplificación en almacenamiento a —20°C de acuerdo a la calidad de visualización de polimorfismos microsatélites. Se concluyó que el producto de amplificación se conserva mejor con Stop Mix y se obtiene una buena visualización después de dos meses de almacenamiento. Se recomienda evaluar la amplificación de ADN de meristemos obtenido por el protocolo propuesto por Wagner et al. (2001) inmediato ala extracción y aplicarlo a hojas de caña. También, aplicar la técnica descrita por da Silva (2003) para análisis AFLP; y utilizar los protocolos propuestos por Aljanabi et al. (1999) y da Silva (2003) para caracterizar variedades de caña de azúcar en estudios futuros. Además, evaluar el efecto del almacenamiento continuo a largo plazo del ADN y del producto de amplificación a —20°C. RR