Abstract:
Los reguladores transcripcionales híbridos han surgido como una ventaja evolutiva
en la levadura de Saccharomyces cerevisiae, ya que han demostrado modular procesos
metabólicos y fisiológicos, como lo es el mecanismo de fermentación y respiración
característico de este organismo. El regulador transcripcional híbrido Nrg1-Rtg3 ha sido
descubierto recientemente como un complejo que mantiene la integridad del ADN
mitocondrial. La presencia de la quimera se determinó mediante un ensayo de coinmunoprecipitación,
sin embargo, aún se requiere de otros métodos para determinar
su estabilidad y regulación en la célula. Por este motivo, el objetivo principal de este
trabajo fue optimizar la técnica de PCR de Extensión Superpuesta (OE-PCR) para
obtener fragmentos de ADN con regiones complementarias al ORF5´y UTR3´de
NRG1 y RTG3 fusionados con proteínas fluorescentes con el fin de generar proteínas
etiquetadas, siendo Nrg1-yECitrine y Rtg3-mCherry. Ambos fragmentos se obtuvieron
empleando diferentes pasos en la técnica de OE-PCR; para Nrg1-yECitrine se
utilizó una sola reacción que integró la superposición y amplificación de los fragmentos,
mientras que, para Rtg3-mCherry se emplearon cuatro reacciones independientes
(dos de superposición y dos de amplificación). Además, se confirmó el fenotipo de
las mutantes sencillas nrg1Δ y rtg3Δ donde se determinó la función principal de la
quimera respecto a lo previamente descrito. Por último, se diseñó un protocolo para la
ligación del constructo a un plásmido multicopia pRS416 y su posterior transformación
en E.coli. Se demostró la validación del protocolo de OE-PCR para el fragmento
de Nrg1-yECitrine, puesto que, se obtuvieron 6 cepas etiquetadas confirmadas mediante
PCR. Para el caso de Rtg3-mCherry, aún no se han obtenido cepas etiquetadas;
se recomienda secuenciar ambos fragmentos para determinar errores en las secuencias
y repetir la transformación en S. cerevisiae. . también, se recomienda un diseño
correcto de oligos quiméricos y anidados, así como determinar la temperatura óptima
de alineamiento de las reacciones. Se espera observar ambas proteínas etiquetadas
mediante microscopía confocal y responder preguntas cómo en qué momento se forma
el híbrido y si su localización subcelular influye en su función de mantener el ADN
mitocondrial. (LA)
