Evaluación de cebadores para la amplificación del gen ITS1 de Leishmania spp. para caracterización de especies causantes de Leishmaniosis cutánea en Guatemala.

Abstract

La leishmaniosis cutánea es una enfermedad causada por la infección por parásitos del género Leishmania spp., los cuales son transmitidos a mamíferos y roedores por flebótomos. La caracterización molecular de este parásito para fines epidemiológicos ha sido ampliamente abordada con el gen its1 como blanco molecular, pero este método no se ha evaluado para cepas de Guatemala. Además, estudios previos realizados en Guatemala en los que se tipificaron los parásitos con el gen hsp70 no fueron capaces de diferenciar entre especies de parásitos del mismo subgénero. Por eso, el objetivo de este estudio fue evaluar el método de PCR de punto final con cebadores previamente reportados para la amplificación del gen its1 de Leishmania spp. para la identificación de especies responsables de la leishmaniosis cutánea en Guatemala. Para esto se trabajó con 25 muestras de raspados de lesiones colectadas entre 1987 y 2016 en los departamentos de Petén, Izabal, Alta y Baja Verapaz, previamente positivas para hsp70. Se variaron los componentes de la mezcla de reacción, la concentración de ADN y las condiciones de las reacciones de PCR anidada, semi-anidada, de gradiente y Touchdown. De estas variantes, solamente una (Touchdown PCR para its1) presentó la amplificación de una de las muestras, pero, al no amplificar las demás muestras ni los controles positivos, no puede concluirse que sea exitosa. Se realizó un análisis de homología de los cebadores por alineamiento múltiple de secuencias de las regiones its1 de las cepas previamente reportadas para las especies de interés que resultó en bajos porcentajes de identidad de los cebadores analizados, por lo que se concluye que los cebadores R221/R332 y LITSR/L5.8S no son aptos para la caracterización molecular de las cepas de Leishmania spp. causantes de leishmaniosis cutánea en Guatemala, probablemente debido a la diversidad genética de las mismas. Se recomienda realizar un análisis por PCR del mismo gen pero utilizando cebadores que abarquen una región mayor, como el set IR1/IR2, y clonar y secuenciar su producto con el objetivo de identificar posibles variaciones puntuales.