Estudio de la microbiota bacteriana del tracto digestivo de una muestra de campo y dos cepas de laboratorio: una susceptible y una resistente a deltametrina, de adultos hembra Anopheles albimanus – vector de malaria en Guatemala - mediante el análisis bioinformático de la región hipervariable V3 - V4 del gen 16S ARN ribosomal.

Abstract

La malaria es una enfermedad causada por el parásito del género Plasmodium spp, el cual es trasmitido por la picadura de mosquitos del género Anopheles spp (vector). Se caracteriza por prevalecer en zonas tropicales y con bajos índices de desarrollo, como África y América Latina. Es causante de la muerte de, por lo menos, 1 millón de personas al año, representado una carga para la economía y sistema de salud global (WHO, 2016a). Debido a su incidencia, se han desarrollado múltiples estrategias para prevenir, controlar y eliminar la malaria. Los enfoques se han dirigido al control del mosquito, utilizando principalmente medidas químicas que consisten en el uso de insecticidas de diferentes familias, como por ejemplo piretroides (World Health Organization, 2015a). A pesar del impacto positivo que dicha medida significó para el combate contra la malaria, actualmente se reporta el surgimiento de resistencia contra, al menos, un insecticida en el 62% de los países endémicos de malaria (Hemingway y Ranson, 2000). Esto ha llevado al desarrollo de diversos estudios, donde recientemente se ha comprobado que la microbiota bacteriana del tracto digestivo se encuentra implicada en el desarrollo de resistencia a insecticidas (Nkya et al., 2014; Dada et al., 2018). No obstante, a pesar de este descubrimiento, no se conoce cómo los factores ambientales a los que se expone el vector influencian el moldeamiento de una microbiota bacteriana potencialmente detoxificante. Por ende, la presente investigación surge por la necesidad de entender cómo la microbiota del tracto digestivo de hembras adultas Anopheles albimanus, género poco estudiado, se ve influenciada a la exposición constante, variante y nula del insecticida deltametrina. Evaluando, a partir de los resultados, la posibilidad de que la microbiota bacteriana del tracto digestivo de An. albimanus posea un rol en el establecimiento de la resistencia. El objetivo principal de la investigación fue identificar y analizar la diversidad de la microbiota bacteriana del tracto digestivo en y entre tres grupos de estudio: hembras adultas An. albimanus de campo, colectadas en las localidades El Terrero y Las Cruces, hembras adultas An. albimanus susceptibles a deltametrina y hembras adultas An. albimanus resistentes a deltametrina. Para esto se empleó una metodología que consistió en cinco pasos principales. El primer paso se basó en la crianza de los tres grupos de estudio, la cual se llevó a cabo bajo condiciones ambientales controladas en las instalaciones del insectario del Centro de Estudios en Salud. El segundo paso dio inicio en el momento en el que las larvas empuparon, en ese punto las pupas fueron sexadas, tomando las hembras de tres días de edad adulta para ser disectadas y así obtener el tracto digestivo. Se obtuvo alrededor de 15 a 20 tractos digestivos por grupo de estudio. Con el tejido biológico de partida disponible, se procedió al tercer paso, extracción de ADN genómico con DNAzol®, trabajando cada tejido por individual. El procedimiento de extracción fue optimizado en la fase de lisis y precipitación de ADN. El material genético resultante fue enviado al Laboratorio Nacional de Lawrence Berkeley (California, Estados Unidos). En el cuarto paso, se procedió a la amplificación y secuenciación de última generación de la región hipervariable V3 - V4 del gen 16S ARN ribosomal. Por último, quinto paso, las secuencias obtenidas fueron tratadas y analizadas empelando los paquetes bioinformáticos Clustal Omega, USEARCH y QIIME I. La composición de la microbiota bacteriana del tracto digestivo de hembras adultas An. albimanus fue representada a través de gráficos de abundancia relativa, mientras que el enfoque ecológico fue abordado empleando análisis de diversidad alfa y diversidad beta. Los resultados obtenidos demostraron que la microbiota bacteriana presente en las cepas de laboratorio, cepa resistente a deltametrina y cepa susceptible a deltametrina, presentan una estructura similar. Se comprobó, estadísticamente, que únicamente el género Burkholderia – Paraburkholderia presentó una diferencia significativa en cuanto a la abundancia relativa entre la cepa resistente y la cepa susceptible a deltametrina. Lo cual se atribuyó a la representatividad de dicho género en la cepa resistente. En cuanto a las muestras de campo, se observó una variación en la composición de la microbiota según el sitio de crianza. Las muestras recolectadas en El Terrero mostraron una microbiota dominada por Elizabethkingia; mientras que las muestras recolectadas en Las Cruces mostraron una microbiota con estructura similar a la observada en las cepas de laboratorio. En tanto, al realizar los análisis ecológicos, se mostró que la composición del microbioma bacteriano entre las muestras de campo y las cepas de laboratorio no mostró una variación significativa al evaluar la diversidad alfa. Sin embargo, al determinar la diversidad beta mediante el método UniFrac repesado, se identificó que el 45% de la variación significativa se debía al grado de recambio filogenético entre los géneros bacterianos presentes en la microbiota de las muestras de campo y los géneros bacterianos presentes en la microbiota de las cepas de laboratorio. Resultados que demuestran la influencia directa del sitio de crianza, el ecosistema de interacción dinámica entre raíces de plantas y microorganismos, en el moldeamiento del microbioma bacteriano del tracto digestivo de hembras adultas An. albimanus. RR