Estandarización y optimización de la técnica molecular reacción en cadena de la polimerasa de transcripción reversa (RT-PCR) para la detección del virus del bronceado del tomate (TSWV) en los insectos vectores Thrips de la familia Thripidae (Thysanoptera).

Abstract

Desde su aparición en 1915 el virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV por sus siglas en inglés) ha causado varias pérdidas en cultivos como lechuga, tomate y flores ornamentales, entre un gran rango de hospederos que tiene este virus. Al virus lo transmiten en la naturaleza los insectos diminutos pertenecientes a la familia Thripidae (Thysanoptera) comúnmente llamados trips. Actualmente se utilizan técnicas serológicas y moleculares para detectar el TSWV en tejido vegetal correspondiente a plantaciones con posibilidad de estar infectadas, sin embargo, en muchas ocasiones es más efectiva la detección del virus en el insecto vector que se encuentra dentro de las plantaciones, ya que puede revelar información previo al desarrollo e infección generalizada del cultivo. Con el objetivo de implementar un método de diagnóstico de TSWV en el insecto vector, se realizó la estandarización de la técnica molecular reacción en cadena de la polimerasa de transcripción reversa (RT-PCR por sus siglas en inglés). Durante la estandarización se determinó que el par de iniciadores L1 y L2 propuestos por la OEPP/EPPO (2004) para el diagnóstico de TSWV no eran recomendables para su utilización en la detección de TSWV en el insecto vector, ya que presentó una reacción de amplificación inespecífica de un fragmento del gen constitutivo 18S ribosomal de Frankliniella sp. Debido a este resultado, se estandarizó la prueba de RT-PCR con otro par de iniciadores ya reportados previamente por Naidu et al. (2004) para la detección de TSWV en trips. El proceso de estandarización consistió en determinar el método de extracción más eficiente, el kit de reactivos a utilizar para la RT-PCR, concentraciones adecuadas de reactivos, establecimiento de temperatura óptima de anillamiento, así como la optimización del tiempo requerido para la detección de TSWV. Se concluyó que era mejor utilizar el método de extracción propuesto por Frohlich et al. (1999), y utilizar el .kit de Access RT-PCR Systems (Promega 2009) para la detección de TSWV, realizando la reacción en dos pasos. RR