UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA 

FACULTAD DE CIENCIAS Y HUMANIDADES 

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA 

EMPLEO DE MA CAD 

GEMINIVIRUS EN Llem 

SUS DIFERENTE 

NOR-ORIEN 

?Ali& IDENTIFICAR 

FIJACIÓN ENTRE 

L SUR Y 

MÓNICA NINNETTE OROZCO FIGUEROA 

Trabajo de Graduación presentado para optar 
al grado académico de 

LICENCIADO EN BIOQUÍMICA 

GL1R;Au 

GUATEMALA 1999 



EMPLEO DE MARCADORES MOLECULARES PARA IDENTIFICAR GEMINIVIRUS EN 
Bemisia mbaci (Gennadius) Y LA RELACION ENTRE SUS DIFERENTES BIOTIPOS EN 

CULTIVOS DEL SUR Y NOR-ORIENTE DE GUATEMALA - 



(0 

Vo.Bo. 

(0 

Licenciada Margarita Palmieri 

Asesora 

Tribunal: 

(O 

Licenciada Margarita Palmieri 

Licenciada Ana María de Mérida 

Fecha de Aprobación: 



A Dios, 
a mis padres, 
a mi hermana y 
a mis abuelitos 



AGRADECIMIENTOS 

Agradezco al Instituto de Investigaciones de la Universidad del Valle por permitirme 

realizar este trabajo de investigación, con un grupo de profesionales. 

Quiero agradecer a la Licenciada Margarita Palmieri por su asesoría y por brindarme la 

oportunidad de trabajar con ella en su laboratorio. Le agradezco enormemente toda su paciencia, 

apoyo y ayuda en la realización de este trabajo. 

Deseo expresar mi agradecimiento a todas las personas que trabajan en el laboratorio de 

virología, las cuales me proporcionaron su ayuda y amistad. A Carolina, Maru, Lourdes, Luis y 

Edgar les agradezco su calidez y generosidad. 

También quiero agradecer a la Licenciada Ana María de Mérida y a Edu por toda su 

bondad y amabilidad Les agradezco mucho el haberme prestado su equipo y sacarme de apuros 

tantas veces. 

A mis compañeros de clase les doy gracias por el apoyo que me brindaron en los 

momentos dificiles y por las alegrías que vivimos juntos durante todos estos años de universidad. 

Finalmente gracias a mis papás por todos sus sacrificios, apoyo, cariño y principalmente 

por toda la fe que tuvieron en mi.  



RESUMEN 

En este estudio se analizaron 732 especímenes de Bemisia tabaci colectados en varias 

localidades de los departamentos de Escuintla y Suchitepequez, en la región sur; y en los 

departamentos de El Progreso, Jutiapa, Jalapa y Zacapa, en la región oriental de Guatemala. Se 

tomaron muestras en cultivos de tomate, chile, tabaco, frijol y cucúrbitas, en general. Las colectas 

se efectuaron en dos temporadas distintas: durante marzo y abril de 1998 y de noviembre a 

diciembre de 1998. 

Se efectuó el diagnóstico de geminivirus por medio del análisis de PCR (Reacción de la 

polimerasa en cadena) con imprimadores específicos, con los cuales se amplificó una secuencia 

situada en el gen que codifica para la cápside de proteína, localizado en el ADN-A del genoma del 

geminivirus. Se detectaron 108 muestras positivas para geminivirus, lo que representa 15% de las 

muestras totales analizadas. 

Por medio de un análisis de varianza, empleando el programa estadístico SPSS, se 

determinó la relación entre la presencia de geminivirus y varios factores como: biotipo de Bemisia 
tabaci que lo transmite, cultivo, región y altitud en donde se encuentran estos cultivos. Se 

concluyó que existen preferencias por parte de los geminivirus hacia ciertos cultivos, biotipos y 

rango de altitudes en donde se efectuaron las colectas. La distribución de geminivirus es similar 

en las regiones sur y oriental y no varía considerablemente antes de la época lluviosa, ni después 

de la misma. 

A las muestras que resultaron positivas por este análisis se les efectuó el análisis de SSCP 

para determinar polimorfismos entre las muestras de geminivirus. Se determinó que si existe 

polimorfismo en la secuencia amplificada por PCR perteneciente al gen que codifica para la 

proteína de cobertura de geminivirus. Estos polimorfismos se traducen como diferentes tipos de 

geminivirus, los cuales se clasificaron en 13 patrones de bandas de SSCP, todos aparentemente 

distintos. Se observó que el patrón 1 era el más frecuente. Se encontró una mayor variabilidad de 

geminivirus en la región oriental que en la sur; ya que en la región oriental se encontraron 7 tipos 

Vnl 



ix 

de virus que no se encontraron en el sur. Se notó que el biotipo no B de Bemista (abad transmite 

una mayor cantidad de tipos de geminivirus que el biotipo B. 



CONTENIDO 

Página 
RESUMEN 	

viii 
I. INTRODUCCION 	

1 
II. ANTECEDENTES 

A. Mosca blanca, Bemisia tabaci (Gennadius) 	 2 
1. Generalidades de la mosca blanca, Bemisia tabaci (Gennadius) 	2 
2. Biotipos de mosca blanca 	 4 

B. Geminivirus 	 6 
1.Genoma 	 6 

2. Enfermedades causadas pcir los geminivirus de mosca blanca 	8 
a) Enfermedades de cucúrbitas 	 8 

b) Enfermedades de la okra (Abelmoschus esculentus) 	 9 

c) Enfermedades de las leguminosas 	 9 

d) Enfermedades de las solanaceas 	 10 
3. Transmisión del geminivirus por B.tabaci 	 10 

4. Diagnóstico y detección 	 11 

a) La técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) 	 11 

i) Secuencias iniciadoras 	 13 

u) Taq ADN polimerasa 	 14 

iii) Deoxiribonucleósidos trifosfatados (dNTP's) 	 14 

v) Soluciones amortiguadoras 	 14 

c) Diagnóstico por PCR 	 15 

b) PCR-SSCP (PCR- single strand conformation polymorphism) 	16 

i) Tinción en plata 	 16 

III. OBJETIVOS E HIPOTESIS 	 18 

IV. MATERIALES Y METODOS 	 20 

V. RESULTADOS Y DISCUSION 	 24 

VI. CONCLUSIONES 	 37 

VII. RECOMENDACIONES 	 40 

VIII. BIBLIOGRAFIA 	 41 



xi 

AP EN DICES 
	 Página 

A. Soluciones utilizadas en metodología y programas de PCR 	44 

B. Lista de Materiales y Equipo 	 47 

C. Patrones de SSCP de las muestras positivas para geminivirus 	49 

D. Cuadros de datos y resultados 	 50 

E. Análisis estadístico SSCP 	 65 



CUADROS Y FIGURAS 

Figura I. Ciclo de vida de la mosca blanca 

Figura 2. Organización genómica de los geminivirus bipartitos 

transmitidos por Bemisia ¿abad 

Cuadro 1. Distribución de patrones de SSCP según cultivo 

Página 

3 

7 

29 

Xii 



GRAFICAS 

Página 

1. Porcentaje de muestras positivas para geminivirus 	 21 
2. Distribución de geminivirus según biotipo de Bemisia tabaci 	 21 
3. Distribución de geminivirus según cultivo 	 23 
4. Distribución de geminivirus según biotipo de Bemisia tabaci en 

diferentes cultivos 	 24 

5. Distribución de geminivirus de acuerdo a región de muestreo 	24 

6. Distribución de geminivirus según biotipo de Bemisia tabaci en 

las regiones sur y oriental de Guateinalá 	 25 

7. Distribución de geminivirus según altitud 	 26 

8. Distribución de geminivirus según biotipo de Bemisia tabaci a 

diferentes altitudes 	 27 

9. Distribución de geminivirus según la época de colecta 	 27 

10. Distribución de patrones de SSCP de las muestras positivas para 

geminivirus 	 29 

I 1. Distribución de patrones de SSCP según biotipo de Bemisia tabaci 	30 

12. Distribución de geminivirus según región de muestreo 	 31 



L 1NTRODUCCION 

La agricultura representa una de las principales fuentes de divisas para Guatemala. 

Debido a ésto es de gran importancia comprender y estudiar las diferentes patologías y plagas que 

afectan a los principales cultivos. Bemisia tabaci, una especie de mosca blanca, representa un 

sedo problema en muchos agrosistemas tanto de la región oriental como de la sur. Este insecto 

no sólo provoca daño mecánico en muchos cultivos sino también es el principal vector de 

geminivirus en varias especies de hortalizas. Los geminivirus causan el aparecimiento de 

síntomas fitopatológicos como clorósis, enanismo y acolochamiento y en casos extremos puede 

causar la muerte de la planta. Se ha investigado poco acerca de la biología y comportamiento de 

este insecto, así como su relación con los geminivirus que transmite. 

En este estudio se pretende detectar e identificar los geminivirus en mosca blanca, lo que 

permitirá comprender mejor la interacción que existe entre virus y vector. Además se determinará 

si existe una relación entre la presencia de geminivirus y el tipo de cultivo que infecta, así como su 

relación con el biotipo de mosca blanca que lo transmite y la altitud y región en la que se 

encuentran los cultivos afectados. 

Para la detección de geminivirus se emplearán imprimadores degenerados que amplifican 

una secuencia específica en el gen que codifica para la proteína de cápside del virus y que se 

encuentra en las moléculas del anillo A del ADN circular del geminivirus. 

Con ésto se pretende comprender un poco más el comportamiento y biología de este 

vector, lo que nos permitirá diseñar medidas más específicas y eficientes para la prevención y 

control del insecto. 



II. ANTECEDENTES 

A. Mosca blanca,  Bemisia tabaci  (Gennadius) 

1. Generalidades de mosca blanca,  Bemisia tabaci  (Gennadius): 

La mosca blanca, Bemisia tabaci (Gennadius), es un insecto perteneciente a la familia 

Aleyrodidae y al orden Hemiptera. Su cuerpo es amarillo pálido y posee alas blancas. Este 

insecto posee un estilete (boca en forma de pico), por medio del cual succiona la savia de las 

plantas, debilitándolas (Salguero, 1594), debido a ésto, causa gran preocupación entre los 

agricultores alrededor del mundo debido a que genera severas pérdidas en la agricultura 

(Traboulsi, 1994). Su presencia se ha reportado en más de 90 países, principalmente en regiones 

tropicales y subtropicales. Provoca daños en los cultivos en varias formas incluyendo daño directo 

debido a la alimentación de los individuos, produce sustancias ricas en azúcares, las cuales pueden 

abonar la superficie de la planta y está asociada con el crecimiento de hongos (fumaginas) sobre el 

follaje y los frutos (Perring; et al. 1991). La transmisión de geminivirus, es el factor más 

complicado, debido a que éstos atacan el sistema vascular, provocando deformaciones severas en 

las hojas y otros órganos de las plantas. Esto reduce significativamente los rendimientos y en el 

peor de los casos se pierde completamente la cosecha debido a que la planta aborta la totalidad de 

las flores y frutos ya desarrollados. Los frutos que se logra cosechar son de mala calidad, 

pequeños y de un color poco atractivo (Calderón, 1995). 

De las 100 especies de mosca blanca identificadas, únicamente tres han sido reconocidas 

como vectores de virus (Brown, 1991). Esta importante plaga ataca a más de 500 especies 

vegetales pertenecientes a 74 familias de dicotiledóneas incluyendo cultivos vegetales, 

agronómicos, ornamentales y malezas (Mehta, et al, 1994). Por ejemplo, se han reportado 96 

especies hospederas para la familia Fabacea, 56 para Compositae, 35 para Malvaceae, 33 para 

Solanaceae, 32 para Euphorbiaceae, 20 para Convolvulaceae y 17 para Cucurbitaceae (Brown y 

Bird, 1992). 



3 

ataban es un insecto primordialmente tropical/subtropical, pero también se ha 

encontrado en climas templados. Bajo condiciones favorables, se pueden completar entre I I a 15 

generaciones en un año, con hembras depositando entre 100 a 300 huevos en un período de tres a 

seis semanas (Brown, 1991). 

El ciclo de vida de la mosca blanca comprende seis estadios: 

a. Huevo 

b. Tres estadios inmaduros "ninfales" o "Iarvarios" 

c. Un cuarto estadio inmaduro 

d. Adulto. 

La mosca blanca pone sus huevos en el envés de las hojas, de los cuales emerge la ninfa; 

el primero de los tres estadios inmaduros (Salguero, 1994). El primer estadio es móvil, y puede 

desplazarse a lo largo de la superficie de la hoja hasta encontrar un lugar seguro para asentarse y 

alimentarse. El segundo, tercer y cuarto estadios son sésiles (Traboulsi, 1994). Del cuarto estadio 

ninfa( sale la mosca adulta. El desarrollo de huevo a adulto tarda 18 ó 19 días (en clima frío, 

puede tardar más) (Salguero, 1994). Aunque los adultos pueden recorrer pequeñas distancias de 

unos cuantos metros, las moscas generalmente se movilizan dentro de la bóveda de la planta y en 

las plantas vecinas. Pueden dispersarse a lo largo de grandes distancias si son atrapadas por 

corrientes de aire y vientos (Traboulsi, 1994). Cuando sus poblaciones son altas o la planta es 

vieja, vuelan buscando plantas más jóvenes. Los adultos viven unos 11 ó 14 días más. Estos 

insectos se reproducen más fácilmente en época seca (noviembre a mayo) o en invierno, cuando 

las lluvias son muy escasas (Salguero, 1994). 

Aunque los estadios tardíos del vector ataban son capaces de contraer el virus, los 

adultos son los más importantes en la movilización del geminivirus entre las plantas hospederas 

(Brown, 1991). 



NINFA IV 

Figura I: Ciclo de vida de la mosca blanca 

2. Biotipos de mosca blanca: 

El término biotipo fue introducido para denominar a las poblaciones de B. tabaci que 

podían diferenciarse de acuerdo a su habilidad para colonizar un espectro distinto de especies 

vegetales (Brown & Bird, 1992). 

Se ha demostrado la existencia de variabilidad biológica y genética entre colecciones 

internacionales de B. tabaci. Las poblaciones de B.tabaci, que están geográficamente aisladas y 

por consiguiente aisladas reproductivamente, son referidas como biotipos o razas Estas 

poblaciones difieren en su habilidad de utilizar plantas hospederas particulares para propósitos de 

alimentación y reproducción y en características de transmisión de virus, pero son indistinguibles 

al basarse en sus características morfológicas. Aunque la significancia de estas diferencias aún no 

ha sido determinada en términos de epidemiología de enfermedades, se tiene claro que las 

interacciones entre la mosca blanca y la planta hospedera son de gran importancia para la 

transmisión exitosa de los geminivirus (Brown, 1991). 

4 



5 

Se ha determinado que existe gran variabilidad genética en las poblaciones de B.tabaci en 
Centroamérica, lo que ha dado lugar a la diferenciación en biotipos. Se ha reportado la aparición 

de un biotipo "B" en las poblaciones de B.tabaci de los Estados Unidos. A este biotipo "B" se le 

asocian características que lo hacen más perjudiciales que el biotipo "A". Este nuevo biotipo tiene 

un rango de hospederos más amplio que el biotipo A, posee una mayor capacidad de 

alimentación, mayor fecundidad y asociación con alteraciones fitotóxicas. En Centroamérica se 

han determinado, además del biotipo "B", otros previamente clasificados como "C", "D" y "G" 

(Caballero, 1992). 

Los apareamientos individuales entre biotipos A y B no producen crías hembras mientras 

que los cruces entre individuos del mismo biotipo generan tanto machos como hembras. Debido a 

que los machos se desarrollan a partir de huevos no fertilizados y son haploides, las hembras son 

diploides al ser creadas únicamente de huevos que han sido fertilizados. Otra diferencia 

importante es que ambos biotipos transmiten diferentes virus (Perring, et al, 1993). 

El biotipo B, actualmente se ha dispersado casi a nivel mundial. La característica 

predominante de este biotipo es su extraordinaria capacidad de adaptarse a un rango 

extremadamente amplio de especies de plantas hospederas. Se ha descubierto que esta peste es 

resistente a insecticidas pertenecientes a varias clases de químicos de amplio uso, incluyendo DDT 

y metil paration (Brown, 1991). 

El biotipo A y B difieren en varias características genéticas distintivas Cada biotipo tiene 

uno o más alelos únicos en seis loci no encontrados en el otro y muestran diferencias alélicas fijas 

en cuatro loci (Perring, et al, 1993). 

Basados en estudios efectuados con patrones de esterasas, se ha concluido que el biotipo 

B se ha dispersado por toda América Central y probablemente en América del Sur. También se ha 

sugerido que otros biotipos no antes reconocidos pueden existir en estas regiones (Brown, 1993). 



B. GEMINIVIRUS: 

Numerosas enfermedades en plantas en las regiones tropicales y subtropicales son 

causadas por geminivirus, la cual es una familia que contiene aproximadamente 50 miembros. 

(Fields, 1996) Los geminivirus se caracterizan por su diversidad molecular, diferentes geminivirus 

infectan el mismo cultivo en diferentes regiones geográficas del mundo. (Ramírez, 1995) Estos 

han sido clasificados en tres subgrupos basados en la planta hospedera, el insecto vector y su 

estructura genómica. Los geminivirus del subgrupo I infectan plantas monocotiledóneas mientras 

que los del subgrupo II infectan plantas dicotiledóneas. El subgrupo 1 y II poseen genomas 

monopartitos y son transmitidos por Cicadélidos. Los miembros del subgrupo III tienen genomas 

bipartitos y son transmitidos por mosca blanca (Fields, 1996). 

No se han obtenidos análisis estructurales detallados de las partículas de geminivirus, pero 

se cree que consisten en dos icosahedros unidos que contienen 110 subunidades proteínicas (de 

aproximadamente 28 kD) arregladas en 22 capsómeros. Las dimensiones de cada partícula son de 

aproximadamente 20 x 30 nm, La disposición fisica del ADN en la partícula se desconoce aún 

(Fields, 1996). 

1. Genoma: 

Los geminivirus que infectan plantas dicotiledóneas y son transmitidos por B.tabaci 

generalmente tienen el genoma bipartito, constituido por dos moléculas de ADN de hebra simple 

circular (2.6 kb para el monopartito y 5.2 kb para el bipartito) y de tamaño similar pero no 

idénticas (ADN-A y ADN-B). No obstante, se han reportado virus con genoma monopartito 

transmitidos por mosca blanca. El genoma de los geminivirus bipartitos tiene una organización 

común con cuatro genes en el ADN-A denominados ALI, AL2, AL3 y AR I y dos genes en la 

molécula de ADN-B llamados BLI Y BR1. En la mayoría de los geminivirus bipartitos se 

requieren ambas moléculas de ADN para inducir la infección (Ramírez, 1995). 

6 



CR 

BL1 

7 

Se demostró que los genomas de algunos geminivirus causantes de varias enfermedades 

en algunos cultivos poseían una composición y organización genética similar. Para cada uno de 

estos virus, la secuencia de nucleótidos de las dos moléculas de ADN es diferente, excepto por 

una región pequeña del genoma total, que es casi idéntica en las dos moléculas de ADN de un 

mismo virus. A esta región se le denomina "región común" (Morales, 1995). 

El ADN-A codifica para todas las funciones necesarias para la multiplicación del virus y 

la encapsidación del ADN viral. Se ha demostrado que la molécula de ADN-A está asociada con 

la modulación de las concentraciones de la cápside proteica viral, así como con la expresión de los 

síntomas. El ADN-B codifica para las funciones asociadas con el movimiento sistémico viral en 

la planta infectada (Ramírez, 1995). 

El genoma de los geminivirus transmitidos por cicadélidos (sub-grupos I y II) posee sólo 

una molécula de ADN de cadena sencilla. Los geminivirus del sub-grupo III poseen unos seis 

genes potencialmente capaces de modificar proteínas, los cuales están repartidos entre las dos 

moléculas de ADN. Uno de estos genes es el responsable de producir la cubierta proteica del 

ADN viral. La secuencia de aminoácidos de esta proteína es muy similar en todos los geminivirus 

estudiados transmitidos por atabaci, lo cual explica la existencia de un vector común y ésto se 

debe a que la cápside viral es la que determina en gran parte la especificidad de transmisión de un 

virus por una clase de vector (Ramírez, 1995). 
CR 

AR1 

BR 1 

AL3 

Figura 2: Organización genómica de los geminivirus bipartitos transmitidos por mosca blanca 

(Ramírez, 1995) 



2. Enfermedades causadas por los geminivirus de mosca blanca 

Las enfermedades causadas por los geminivirus transmitidos por atabaci se han convertido 

en un problema grave para la producción sostenible de los cultivos en las regiones tropicales y 

subtropicales alrededor del mundo. Además de los geminivirus transmitidos por mosca blanca y 

hasta ahora descritos, se ha estimado que en el Nuevo Mundo aún quedan 40 o más virus sin 

caracterizar (Brown, 1991). Estas enfermedades están caracterizadas por uno o más de los 

siguientes síntomas: amarillamiento severo, mosaico dorado, enrollamiento de hojas y enanismo 

(Green, 1994). 

La epidemiología de los geMinivirus transmitidos por mosca blanca está caracterizada por 

la correlación cercana entre la incidencia de la enfermedad y las poblaciones de mosca blanca las 

cuales muestran fluctuaciones fuertes en cada estación. Este factor ha sido importante en el 

desarrollo de ciertos métodos de control basados en el tiempo de transplante. Hasta ahora no hay 

evidencia de transmisión del geminivirus por semillas (Green, 1994). 

A continuación se resumen nuevas enfermedades de gran importancia causadas por 

geminivirus transmitidos por mosca blanca. 

a) Enfermedades de cucúrbitas 

Hasta la fecha, se han identificado dos geminivirus transmitidos por mosca blanca en 

cucúrbitas: virus del enrollamiento de hoja de la calabaza (SLCV), la cual causa síntomas 

fitotóxicos en pepino, melón, calabaza, sandía y melón silvestre; y el virus de enrollamiento de la 

sandía (WCSV) de la Península arábica. El SLCV fue documentado por primera vez en 

Guatemala, Honduras y Nicaragua entre 1990 y 1992. Este virus causa enrollamiento de hojas y 

enanismo moderado y éstos se desarrollan aproximadamente entre los 10 a 15 días después de la 

infección. Las plantas infectadas producen abundancia de flores que abortan y frutos que no se 

desarrollan adecuadamente (Brown, 1991). 

8 



9 

El complejo formado entre el SLCV y el virus del moteado y enrollamiento de la sandía 

(WCMoV) causa enfermedades severas en los cultivos de Cucurbtta lbetidissima, C. maxima, C. 
pepo y C. moschata. Los síntomas consisten en enrollamiento severo de las hojas, mosaico con 

"ventanas" blanquecinas o amarillas (el tejido de la hoja es tan fino que es casi transparente), 

enanismo y con frecuencia la muerte. Los frutos formados después de la infección pueden ser 

cosechados; no obstante la mayoría de las plantas infectadas producen numerosas flores pero no 
producen frutos (Brown, 1991). 

El complejo viral SLCL/WCMoV causa enrollamiento severo en la sandía. Los síntomas 

incluyen enrollamiento severo, moteado, florecimiento prolífico, enanismo y moteado en el fruto. 

No hay desarrollo completo del fruto si la infección ocurre a una edad fisiológica temprana 
(Brown, 1991). 

b) Enfermedades de la okra (Abelmoschus esculentus) 

El virus de enrollamiento de la hoja de la okra (OLCV) provoca engrosamiento de las 

venas, enrollamiento de las hojas, enanismo y una reducción en la producción. Estos síntomas 

varían según la variedad de la okra. En Guatemala, en donde es un cultivo de exportación 

importante, la enfermedad puede afectar a un 100% de las plantas, y aquellas infectadas en un 

estadio temprano no producen frutos. Hasta la fecha no se conocen variedades resistentes (Brown, 
1991). 

c) Enfermedades de las leguminosas 

Alrededor del mundo se han reportado epidemias a niveles críticos debido a que las 

leguminosas son consumidas por casi todas las culturas basadas en la agricultura como una fuente 

importante de proteína vegetal. Se ha encontrado que, tanto las leguminosas cultivadas como las 

silvestres, sirven como hospederos universales de Biabaci. Hay dos tipos de enfermedades 

causadas por geminivirus en las leguminosas: las enfermedades que muestran síntomas del tipo 

del mosaico dorado y que se denominan enfermedades del mosaico dorado del frijol, y las que 



10 

muestran síntomas de enrollamiento y enanismo severo, las cuales se denominan enfermedades 

del enanismo del frijol (Brown, 1991). 

d) Enfermedades de las solanáceas 

A principios de 1984, las enfermedades causadas por los geminivirus transmitidos por 

mosca blanca en chile, tabaco y tomate se dispersaron a lo largo de la región sur de Estados 

Unidos, México, el Caribe y América Central (Belice, Costa Rica, Guatemala, Nicaragua y 

Panamá). Los síntomas de esta enfermedad incluyen ya sea enrollamiento de las hojas, un 

mosaico amarillo o dorado o un enrollamiento con hojas amarillas, así como enanismo leve o 

severo, pérdidas debido a la baja producción y una calidad del fruto reducida. Las plantas jóvenes 

de tomate y chile infectadas no producen frutos, mientras que las plantas maduras infectadas 

frecuentemente producen abundantes flores pero pocos frutos (Brown, 1991).  

3. Transmisión de geminivirus por el vector  Remisa tabaci  (Gennadius) 

Los geminivirus son transmitidos de planta a planta por los cicadélidos y mosca blanca. 

Tienen la capacidad de persistir en los insectos vectores por varios días o hasta por toda la vida 

del insecto. No obstante, no se replican en sus vectores. Muchos de estos virus no pueden ser 

manualmente transmitidos, y algunos están restringidos a las células asociadas al floema en el 

sistema vascular de la planta (Fields, 1996). 

La habilidad de la mosca blanca para interactuar exitosamente con la planta hospedera 

durante la alimentación y reproducción es esencial en la transmisión de los geminivirus. Estos 

virus son transmitidos en una manera persistente por el vector. La mayoría de los virus pueden ser 

transmitidos empleando una ingesta de acceso de 24 horas seguido por una ingesta de inoculación 

de 48 horas con un tiempo de latencia intermedio de 12 horas, aproximadamente. Se cree que los 

viriones pasan a través de los estiletes y el intestino medio hacia el intestino posterior donde 

cruzan la membrana plasmática hacia el hemocelo por endocitosis. 	A partir de allí, 

probablemente se muevan a través de la hemolinfa y lleguen a la glándula salival accesoria en 



11 

donde luego son transmitidos hacia la planta hospedera a través de la saliva inyectada por la 

mosca blanca mientras ésta se alimenta (Brown, 1991). 

La replicación y transcripción de los geminivirus ocurre en el núcleo de las células 

infectadas. La transcripción ocurre en ambas hebras del ADN genómico. Los miembros del 

subgrupo 1 pueden usar mecanismos de edición para producir la proteína de fusión involucrada en 

la replicación la cual ocurre mediante el mecanismo del círculo rodante en el núcleo de las células 

infectadas (Fields, 1996). 

4. Diagnóstico y detección: 

En el pasado, el diagnóstico exacto de los virus involucrados en estas enfermedades no era 

posible. Tradicionalmente, los métodos serológicos eran los medios principales para la detección 

y diagnóstico del virus. Este acercamiento tenía un éxito limitado con los virus transmitidos por 

mosca blanca debido a que eran extremadamente dificiles de purificar. 	Algunos sueros 

policlonales producían reactividad cruzada por antígenos heterólogos, mientras que se observaba 

reactividad cruzada con geminivirus cercana o distantemente relacionados al emplear anticuerpos 

monoclonales (Green, 1994). 

El uso de plantas indicadoras ha sido otra técnica de detección y diagnóstico de virus 

vegetales. Sin embargo; en el caso de los geminivirus no ha sido muy utilizada por dos limitantes 

principales. Primero, la transmisión mecánica del geminivirus no es fácil y segundo, el 

establecimiento de colonias de atabaci es bastante complicada (Morales, 1995). 

a) Técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) 

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica empleada para amplificar un 

número de copias de una región específica de ADN, y así producir suficiente ADN que pueda ser 

estudiado adecuadamente (Brown, 1995). Puede ser usada para aislar fragmentos de ADN, marcar 

ADN, donar ADN copia y ADN genómico, secuenciar ADN, mutar secuencias específicas de 

ADN, alterar promotores y cuantificar la cantidad de ADN o ARN (Hoy, 1994). Una gran ventaja 



12 

de esta técnica es que se necesitan pequeñas cantidades de material inicial para poder secuenciar 

individuos pequeños y muestras degradadas (Simon, 1994). Para usar el PCR, es necesario 

conocer las secuencias exactas que flanquean ambos extremos de la región de interés en el ADN 

(puede ser un gen o una secuencia). No es necesario conocer la secuencia de ADN intermedia 

(Brown, 1995). Este tipo de amplificación de ADN es geométrica, produciendo grandes 

cantidades de secuencias específicas de ADN adecuadas para secuenciación, donación o 

preparación de sondas (Hoy, 1994). 

El poder del PCR para amplificar ADN es dramático; teóricamente hasta una molécula 

puede ser amplificada para producir una cantidad de copias. No obstante, este poder crea una 

variedad de problemas con containinación y requiere de una planeación cuidadosa de los 

experimentos de PCR y el uso de controles adecuados (Hoy, 1994). 

El PCR involucra la combinación de una muestra de ADN con oligonucleótidos 

iniciadores, deoxinucleótidos trifosfatados (dNTP's) y una ADN polimerasa en una solución 

amortiguadora (Hoy, 1994). Esta técnica consta de tres pasos: (a) desnaturalización de la doble 

hebra de ADN por calentamiento; (b) unión de secuencias iniciadoras (imprimadores) a sitios 

flanqueando la región a ser amplificada; y (c) extensión del cebador, en el cual las hebras 

complementarias a la región entre los imprimadores son sintetizados bajo la influencia de una 

ADN polimerasa (Taq) la cual es termoestable. Los productos son procesados repetidamente a 

través de los pasos (a)-(c) (Avise, 1994). Debido a que los productos de una ronda de 

amplificación sirven como moldes para el próximo, cada ciclo sucesivo esencialmente duplica la 

cantidad del producto de ADN deseado. El principal producto de esta reacción exponencial es un 

segmento de ADN de doble hebra cuyo extremo está definido por el extremo 5' del cebador y 

cuya longitud está definida por la distancia entre los imprimadores (Sambrooks, 1989). 

Los primeros ciclos del PCR son particularmente críticos para la amplificación eficiente y 

precisa de las secuencias de ADN. Todos los ciclos comienzan con la desnaturalización de la 

hebra molde de ADN para que de esta forma se tenga una hebra simple de ADN. A medida que 

la temperatura es disminuida, los imprimadores se unen a las secuencias complementarias del 

molde de ADN. La unión del imprimador en los primeros ciclos requiere que éstos rastreen el 



13 

molde de ADN para encontrar las secuencias conectas a las cuales se unirán. Debido a que 

mucho del ADN no tendrá la secuencia correcta, la unión en los primeros ciclos puede no ser del 

todo específica como en los ciclos intermedios. En los primeros ciclos, las interacciones de los 

imprimadores con el molde de ADN puede producir productos inespecíficos. El PCR únicamente 

será específico si los dos imprimadores se unen a sitios en la banda complementaria del ADN y 

éstos sitios están a menos de 10 kb de distancia (Hoy, 1994). 

Durante los ciclos intermedios, el producto previamente sintetizado es preferido como 

molde por los imprimadores, por lo que el molde blanco está perfectamente demarcado. 

Finalmente, en los ciclos tardíos, los productos amplificados que se encuentran en altas 

concentraciones se hibridizarán con ellos mismos, bloqueando los sitios complementarios de los 

imprimadores. Se pueden sintetizar secuencias de ADN de hasta 10 kb , no obstante, es más 

dificil de obtener secuencias de 2 kb (Hoy, 1994). 

Entre los componentes de la reacción PCR se encuentran. 

i) Secuencias iniciadoras ("imprimadores") 

Los imprimadores son oligonucleótidos que tienen diferentes secuencias y son 

complementarios a las secuencias encontradas en las hebras opuestas del molde de ADN; 

flanquean el segmento de ADN a ser amplificado (Sambrooks, 1989). Los imprimadores 

determinan la longitud, especificidad, y naturaleza del ADN amplificado producido por el PCR. 

La extensión del ADN ocurre en el OH del extremo 3' del cebador para que los extremos del 

ADN amplificado son definidos por los extremos 5' de los imprimadores. La longitud del ADN 

generado durante el PCR es igual a la suma de las longitudes de los dos imprimadores más la 

distancia en el molde de ADN localizada entre los imprimadores (Hoy, 1994). 

Los imprimadores deben ser de por lo menos 16 nucleótidos y preferiblemente de 20-24 

nucleótidos de longitud. Generalmente, se emplean en concentraciones de 1 Oil en las reacciones 

de PCR. Esto generalmente es suficiente para por lo menos 30 ciclos de amplificación. La 

presencia de mayores concentraciones de oligonucleótidos pueden causar iniciación en sitios 



14 

ectópicos, con la consecuente amplificación de secuencias no deseadas. Inversamente, la reacción 

de PCR es ineficiente cuando la concentración de imprimadores es limitada. (Sambrooks, 1989) 

ii) Taq ADN polimerasa 

La enzima encargada de catalizar esta reacción es una ADN polimerasa termoestable 

purificada de la bacteria termotilica Thennus aquaticus (Taq ADN polimerasa). Esta enzima, la 

cual resiste la incubación prolongada a 95°C, no es inactivada por el paso de desnaturalización 

con calor y no necesita ser reemplazada en cada ronda del ciclo de amplificación (Sambrooks, 

1989). La Tal] ADN polimerasa es una proteína de 94 kDa con un óptimo de temperatura de 

aproximadamente 75-80°C. Puede amplificar más de 60 nucleótidos por segundo a 70 °C con un 

primer de 30 oligómeros. En la mezcla de PCR, la Taq ADN polimerasa retiene 50% de su 

actividad después de 40 minutos a 95°C (Hoy, 1994). 

Existen dos formas de Taq ADN polimerasa: la enzima nativa purificada a partir de la 

Thennus aquaticus y la forma obtenida por ingeniería genética de la enzima sintetizada en E.cuh. 

Ambas formas poseen una actividad de exonucleasa dependiente de la polimerización en una 

dirección 5' 	pero carecen de la actividad de exonucleasa en dirección 3'—>5'. Se requieren 

aproximadamente 2 unidades de enzima para catalizar la reacción de PCR típica. La adición de 

un exceso de enzima puede llevar a la amplificación de secuencias no deseadas (Sambrooks, 

1989). 

iv) Deoxiribonucleósidos trifosfatados (dNTP's): 

Estos compuestos forman la nueva hebra que está siendo sintetizada. Los dNTP's son usados 

en concentraciones saturadoras de 200 p.M para cada dNTP (Sambrooks, 1989). 

y) Soluciones amortiguadoras: 

La solución amortiguadora estándar usada para estas reacciones contiene KCl 50 mM, Tris 

riel 10 mM (pH 8.3) y MgCl2  1.5 mM. Cuando hay una incubación a 72°C, el pH de la reacción 

disminuye por más de una unidad, produciendo una solución amortiguadora cuyo pH es de 

aproximadamente 7.2. La presencia de estos cationes divalentes es critica (Sambrooks, 1989). 



b) Diagnóstico por PCR: 

Por muchos años, el diagnóstico de la enfermedad se ha respaldado principalmente en 

la observación de los síntomas típicos de la enfermedad. En algunos casos, se ha usado la 

visualización de cuerpos de inclusión con microscopía de luz y/o localización ultraestructural de 

los viriones usando espectroscopia electrónica. Ninguna de estas técnicas son específicas y no 

pueden ser utilizadas para diferenciar entre los geminivirus transmitidos por mosca blanca. No 

obstante, el surgimiento de nuevas técnicas ha hecho posible el desarrollo de pruebas que usan 

ácidos nucléicos para detectar e identificar con precisión estos virus (Green, 1994). 

Entre estas técnicas de detección y diagnóstico se encuentra la técnica de hibridización de 

ácidos nucléicos y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta última permite donar y 

secuenciar el ADN obtenido para así comparar su homología con el mismo segmento de otros 

geminivirus ya secuenciados. También, el hecho de haber sido amplificado un segmento de ADN, 

indica que se tiene un geminivirus en la planta investigada, pues las secuencias iniciadoras son 

específicas para una secuencia común a varios geminivirus investigados (Morales, 1995). 

Durante la multiplicación viral los geminivirus producen naturalmente una molécula 

intermedia circular de ADN de doble banda, que se utiliza in vitro como molde para la 

amplificación por PCR. Secuencias virales altamente conservadas dentro de los diferentes 

geminivirus se pueden identificar utilizando imprimadores degenerados para el PCR. Estos 

iniciadores degenerados se han usado para amplificar fragmentos de ADN viral proveniente de 

geminivirus que infectan tomate, frijol, yuca, melón, chile y malezas en todo el mundo. Una vez 

se han producido por PCR, fragmentos de ADN, éstos se pueden utilizar para análisis con enzimas 

de restricción (RFLP), hibridización y secuenciación de ADN (Ramírez, 1995). 

Se emplearán imprimadores que amplifican un fragmento de una secuencia que codifica 

para la proteína de cobertura del virus y que se encuentra en el ADN-A 

15 



c) PCR-SSCP (PCR-single strand conformation poly-morphism): 

En este tipo de análisis, la secuencia blanco es amplificada por el PCR del ADN 

genómico. El producto de PCR es luego desnaturalizado y separado por electroforesis en gel de 

acrilamida, en donde las mutaciones son detectadas como movilidad alterada de hebras simples 

separadas (Hayasi, 1991). 

La movilidad electroforética de la partícula en el gel es sensible a ambos tamaño y forma. 

En condiciones no desnaturalizantes, el ADN de hebra simple tiene una estructura doblada que 

está determinada por las interacciones intramoleculares, y por consiguiente, por su secuencia. En 

los análisis de SSCP, una secuencia mutada es detectada como un cambio en la movilidad en la 

electroforesis en gel de poliacrilamida causada por su estructura alterada. Se ha encontrado que 

debido a su alto poder de resolución, la electroforesis en gel de poliacrilamida puede distinguir 

casi todas los cambios conformacionales causados por diferencias sutiles en las secuencias en un 

fragmento de varios cientos de bases (Hayasi, 1991). 

En el análisis de PCR-SSCP, es posible detectar cambios en secuencias de varios cientos 

de bases, en contraste con otras técnicas en las cuales los cambios en secuencias relativamente 

cortas (unas cuantas hasta 20 bases) son detectadas. El análisis PCR-SSCP es más sensible a 

errores de replicación que ocurren durante el PCR (Hayasi, 1991). 

i) Tinción en plata: 

La introducción de la tinción con plata de proteínas, ARN y ADN en geles de 

poliacrilamida ha sido un gran avance en la detección de estos compuestos. Una posibilidad 

poderosa para la tinción ultrasensible de las proteínas y los ácidos nucleicos en un rango de 

nanogramos es la reducción química específica de los iones de plata, cuya sensibilidad es 

únicamente superada por el marcaje radioactivo (Blum, 1987). 

16 



17 

Dos fenómenos principales ocuren en la formación de imagen en este tipo de tinción. El 

primero; es la clave en los procesos fotográficos, es la reducción autocatalítica de la plata. Esto 

significa que la reducción del ión de plata a plata metálica es significativamente aumentada 

cuando hay presente algo de plata metálica. Cuando este fenómeno se aplica a la formación de 

imágenes en la unción con plata, significa que la imagen aparecerá en los lugares donde la 

reducción comienza, debido a que aquí el crecimiento de la imagen es mucho mayor que en 

cualquier otro lugar. El segundo principio es que, mientras más fuerte sea el complejo formado 

entre el ion de plata y la molécula, menos reactivo será el ion de plata (Rabilloud, 1994). 



III. OBJETIVOS E HIPOTESIS 

A. OBJETIVOS: 

1. General:  

Detectar la presencia y determinar la variabilidad genética de los geminivirus transmitidos por 

B. tabact en cultivos de las regiones sur y oriental de Guatemala por medio del análisis de la 

reacción en cadena de la polimerasa (PCR), empleando para ello imprimadores específicos. 

2. Específicos: 

I 	Detectar la presencia de geminivirus transmitidos por B. tabaci en los distintos agrosistemas de 

las regiones sur y oriental de Guatemala, empleando para ello la técnica de PCR con 

imprimadores específicos. 

2. Identificar algunos hospederos de B.tabaci, así como de geminivirus, en cultivos de las 

regiones sur y oriental de Guatemala, tales como solanáceas, cucurbitáceas y leguminosas. 

3. Determinar la diversidad genética de los diferentes geminivirus transmitidos por B. tabaci 

presentes en los cultivos de las regiones oriental y sur de Guatemala. 

4. Evaluar la relación existente entre la presencia de geminivirus y diversos factores tales como 

cultivo, biotipo de B.tabaci que lo transmite, altura y región en la que se encuentran los 

cultivos que infecta. 



B. HIPOTESIS: 

I. Existen diferentes tipos de geminivirus transmitidos por B.tahaci en cultivos de las regiones 

sur y oriental de Guatemala. 

2. La presencia de geminivirus depende de la altitud y la región en la que se encuentran los 

cultivos que infecta. 

3. Es posible detectar la presencia de geminivirus en especímenes de Bemisia tabaci empleando 

los imprimadores degenerados 514 y 1048 por medio de la reacción en cadena de la 

polimerasa (PCR).  

19 



VI. MATERIALES Y METODOS 

A. METODOLOGIA: 

1. Captura de especímenes: 

Se efectuaron muestreos en las regiones sur; en los departamentos de Escuintla y 

Retalhuleu; y en la región oriental, en los departamentos de Zacapa, Jutiapa, Jalapa y El Progreso. 

Las capturas se hicieron en plantas escogidas pertenecientes a los géneros solanáceas, 

cucurbitáceas, leguminosas y a la familia de la okra. Las colectas se realizaron en dos épocas: 

antes de la época lluviosa (marzo y abril de 1998) y después de las lluvias (noviembre y 

diciembre de 1998). 

Se analizaron 732 especímenes de adultos de Bemisia fabaci, los cuales fueron colocados 

en viales rotulados luego de ser capturados. La captura se efectuó empleando aspiradores, 

colectando especímenes en las plantas de interés. 	Posteriormente algunos individuos se 

almacenaron en nitrógeno líquido y otros en etanol al 95%, esto se hizo inmediatamente después 

de hacer la colecta en la plantación donde se encontraba alguno de los cultivos a estudiar. Las 

muestras fueron almacenadas en nitrógeno líquido en el laboratorio en la ciudad de Guatemala 

hasta su análisis posterior. 

Se anotó la sintomatología que presentaban los cultivos (enanismo, clorosis, moteado y 

enrollamiento de las hojas) en donde se colectaron las muestras. Además se anotó la altitud, 

longitud, latitud y localización geográfica de las localidades en donde se efectuaron las colectas. 



2. Detección de geminivirus empleando proteina de cobertura e imprimadores 514 y 1048 

2.1 Lisis de la muestra:  

Todo el procedimiento de tisis de la muestra se realiza en frio. Primero se clasifican y 

separan los especímenes hembras de atabaci, separando la cabeza del abdomen. La clasificación 

de acuerdo a la especie se basa en la observación visual de la forma del ocelo del insecto, la cual 

varía de acuerdo a la especie de mosca blanca. Para determinar el sexo de la mosca blanca, se 

observa el extremo inferior del abdomen, en donde al observarse un apéndice en forma de gancho, 

se concluye que es un especímen macho. En caso de no tener suficientes hembras disponibles, se 

toman los machos. Se separa el tórax del abdomen con un estilete y el abdomen de la mosca 

blanca se macera (empleando un niacerador eppendorf estéril sobre una caja petri forrada con 

parafilm) en 10 ul de solución amortiguadora de lisis y luego de haber sido maceradas, se agregan 

otros 20 ul de la misma solución. Se transfiere el volumen total a un tubo de microcentrífuga de 

0.5 ml y se coloca en hielo hasta que se incuba. Las muestras se incuban a 65°C por 15 minutos 

y luego 10 minutos a 95°C. 

2.2 Amplificación del ADN:  

Se prepara la mezcla de reacción para el total de muestras que se van a a analizar. Utilizar 

las cantidades de reactivos y el programa de amplificación especificados en el apéndice A. Se 

colocan 25 µl de la mezcla de reacción y se ponen en el termociclador dejando correr el programa 

de amplificación (el programa se describe en el apéndice A). Los productos de PCR obtenidos se 

guardan de preferencia a -20°C, pero también pueden almacenarse a 4°C. 

2.3 Detección de productos de PCR:  

Se prepara el gel de agarosa al 0.8% (Ver apéndice A). El gel se carga con 6 p.1 de 

muestra más 2 lit de solución amortiguadora de carga. Se corre la electroforesis a 80 V en gel de 

agarosa al 0.8 % y se emplea como solución amortiguadora de cámara el solución amortiguadora 

TAE lx. 

21 



22 

Se saca el gel y se coloca en la solución de Unción de bromuro de etidio (0.05 mg/mi) por 

5 minutos. El gel se transfiere a un recipiente con agua destilada para que se destiña por 15 

minutos. Se torna la fotografia del gel y se identifican las muestras positivas, las cuales muestran 

una banda de aproximadamente 400 bp. 

A las muestras que resultaron positivas se les efectúa un análisis de SSCP (single strand 

conformation polymorphism) para determinar si existen polimorfismos entre ellas. 

3. SSCP (Single strand polymorphism):  

3.1  Preparación del gel:  

Preparar un gel de acrilamida al 8% (ver receta en apéndice A) y dejar polimerizar. 

3.2 Cargar el gel:  

Se colocan 2 pl de producto de PCR y 9 pl de solución amortiguadora de carga 

desnaturalizante en un tubo eppendorff y se mezclan. Los tubos se calientan a 95°C por tres 

minutos y se sacan inmediatamente para colocarlos en hielo. Las muestras se mantienen en hielo 

por lo menos 5 minutos. Se toman 4111 de la muestra y se cargan en el gel SSCP. 

3.3 Corrida del gel SSCP: 

La electroforesis se lleva a cabo a un voltaje máximo, 20 miliamperios y a 4°C. Se 

emplea como solución amortiguadora de cámara TBE 0.5X (receta en apéndice A). Dejar que 

corra hasta que ambas bandas de colorante (azul de bromofenol y xilen-cianol) se salgan del gel. 

3.4 Tinción de plata de los geles de SSCP: 

Se remueven los geles de las placas de vidrio y se colocan en un recipiente con 200 ml de 

ácido acético al 10% (receta en apéndice A). El gel puede almacenarse indefinidamente en esta 

solución antes de proceder al siguiente paso. El gel se lava cuatro veces en 250 ml de agua 

doblemente destilada con dos minutos de agitación por lavado. Luego se transfiere a 200 ml de 

solución de coloración de nitrato de plata y se agita por 30 minutos. 



23 

El gel se remueve de la solución de nitrato de plata, se escurre y se lava con agua destilada 

por no más de 20 segundos. Luego se agregan 250 ml de solución reveladora (justo antes de 

agregarla, se le adicionan 300 ul de formaldehido al 37% y 2 ul de solución de tiosulfato de 

sodio). El gel se coloca en la solución reveladora de carbonato de sodio fria y se agita. Tan 

pronto como las bandas aparezcan (usualmente de 4-6 minutos), agregar la solución fijadora del 

primer paso y agitar hasta que las burbujas desaparezcan. Lavar el gel dos veces con agua 

destilada. 

Los geles se colocan sobre un papel filtro, luego se cubren con acetato y se ponen a secar 

por 1 hora en el secador de geles. 

4. Análisis Estadístico de los resultados: 

Para analizar estadísticamente los resultados, se efectuó un análisis de varianza utilizando 

tablas de contingencia por medio del programa estadístico SPSS. Los datos se agruparon de 

acuerdo a la región, altitud, cultivo y época en donde se realizaron las colectas. También se 

clasificaron de acuerdo al biotipo de Bemisia tabaci al que pertenecían. Con este análisis se pudo 

determinar si existía relación entre las variables que se enumeraron anteriormente. 

B. MATERIALES: Ver apéndice B 



V RESULTADOS Y DISCUSION 

A. MUESTRAS ANALIZADAS 

Se analizaron 732 especímenes de Biabaci provenientes de dos colectas realizadas 

durante los meses de marzo a abril de 1998 y de noviembre a diciembre de 1998. Estos 

especímenes fueron colectados en plantaciones de tabaco, tomate, frijol, chile y cucúrbitas en 

general; situados en varias localidades de los departamentos Escuintla y Mazatenango en la región 

sur; y en los departamentos de El Piogreso, Jutiapa, Jalapa y Zacapa en el oriente de Guatemala. 

B. DETECCION DE GEMINIVIRUS POR PCR 

De las 732 muestras analizadas por medio del diagnóstico con PCR, 108 muestras 

resultaron positivas para geminivirus, lo que representa un 15% del total de las muestras 

analizadas (gráfica 1). De estas 108 muestras, 8 fueron detectadas en individuos de B.tabaci 

pertenecientes al biotipo B, representando un 7% del total de las muestras positivas, mientras que 

el resto fue detectado en especímenes de B.tabaci biotipo no B (gráfica 2). Se efectuó un análisis 

de varianza para determinar la relación entre la presencia de geminivirus y el biotipo de B. tabaci 

que lo transmite. Se determinó que las muestras positivas y negativas se distribuyen más o menos 

con la misma frecuencia entre los distintos biotipos de Bemisia !abad'. Al considerar únicamente 

los casos positivos para geminivirus, se concluyó que la frecuencia con la que aparece el virus no 

es la misma para todos los biotipos, indicando que los geminivirus tienen preferencias por ciertos 

biotipos. Se obtuvo un grado de significancia de F de 0.005, lo que indica que esta diferencia es 

altamente significativa. 

A pesar de que el biotipo B de Bemisia ¡abad es el más agresivo de todos los biotipos, ya 

que infesta un rango mayor de cultivos, se esperaría que la presencia de geminivirus fuera mayor 

en este biotipo, pero solamente se detectó un pequeño porcentaje de geminivirus en los 

especímenes de Bemisia tabaci del biotipo B. 



Gráfica 1: Porcentaje de muestras positivas para geminivirus 

25 

 

15% 

 

  

CIMuestras positivas 

■ Muestras negativas 

85% 

  

Gráfica 2: Distribución de geminivirus según biotipo de 
Bemisia tabaci 

1:IBiotipo B 

■ Biotipo no B 

.01,111/ERGIDAD 



26 

La distribución de muestras positivas para geminivirus según el cultivo en el que se 

hicieron las colectas de mosca blanca se muestra en la gráfica 3. Se determinó que de 76 

especímenes de mosca blanca analizados, colectados en plantaciones de tabaco, 12 muestras 

resultaron positivas, lo cual representa un 15.79% del total de las muestras de tabaco. De 119 

muestras analizadas para el tomate, 33 fueron positivas, representando un 27.13%. De la misma 

forma, de las 107 muestras analizadas para el chile, 27 resultaron positivas, lo que equivale a un 

25.23% de las muestras de chile. De 86 muestras de frijol analizadas, 12 dieron un resultado 

positivo, equivalente a un 13.95% y finalmente, de los 344 especímenes de mosca blanca 

colectados en plantaciones de cucúrbitas en general, 24 resultaron positivas para geminivirus, lo 

que equivale a un 6.98% de las muestras totales de cucúrbitas. 

A partir de los resultados anteriores, se observa que el porcentaje de individuos portadores 

de geminivirus que fueron colectados en plantaciones de tomate y chile (ambos pertenecientes a la 

familia de las solanáceas) es mayor que los de los demás cultivos; lo que podría llevar a concluir 

que los cultivos de tomate y chile son más propensos a ser infectados por geminivirus. Una 

posible explicación a este fenómeno es que los miembros de la familia de las solanáceas proveen 

condiciones más favorables para el desarrollo y supervivencia del virus. De la misma forma, se 

notó que los especímenes de B.rabaci colectados en cucúrbitas, presentan la menor proporción de 

individuos portadores del virus. 

Se determinó por medio del análisis estadístico en SPSS que las muestras positivas y 

negativas se distribuyen de forma similar en los cultivos estudiados. Pero, cuando se consideraron 

únicamente los casos positivos, se observó que sí existían preferencias hacia ciertos cultivos ya 

que las frecuencias con las que aparece el virus no son las mismas para todos. Se observó que los 

cultivos de tomate son los que presentan el mayor porcentaje de muestras positivas para 

geminivirus. La significancia resultante fue de 0.025 lo que indica que esta diferencia es 

significativa. 



Gráfica 3: Distribución de geminivirus según cultivo 

27 

P
O

R
C

E
N

T
A

JE
S

  

100% 
90% 
80% 

70% 
60% 

50% 
40% 

30% 
20% 

10% 
OV 

■ Muestras negativas 

❑ Muestras positivas 

CULTIVO 

En la gráfica 4, se observa la distribución de geminivirus según biotipo de Bemisia tabaci en 

los diferentes cultivos. En el análisis de varianza, se obtuvo un grado de significancia de 0.23, lo 

que indica que la manera en que se distribuyen las muestras positivas y negativas es casi la 

misma entre los biotipos de Bemisia tabaci colectados en los cultivos estudiados. Lo que 

significa que, en este caso en particular, en todos los cultivos siempre se encontraron más 

muestras negativas que positivas, en ningún caso, el porcentaje de muestras positivas era mayor 

que el número de muestras negativas. 

En los cultivos de chile y frijol no se detectaron muestras positivas de geminivirus en 

especímenes de mosca blanca biotipo B. Mientras que, en los cultivos de cucúrbitas fue en donde 

se detectó el mayor porcentaje de geminivirus en Bemisia tabaci biotipo B. Esto podría indicar 

que los distintos biotipos se Bemisia tabaci tienen ciertas preferencias hacia algunos cultivos y 

que el biotipo B tiene una menor capacidad de infección que los otros biotipos de mosca blanca. 

Al parecer, el biotipo B tiene mayor predilección por los cultivos de cucúrbitas, pero éstos a su 

vez presentan los menores porcentajes de geminivirus. 

Para confirmar la hipótesis anterior, se hizo un análisis de varianza el cual indicó que la 

distribución de geminivirus no es equitativa en todos los biotipos en los cultivos estudiados, y que 

efectivamente sí existen ciertas preferencias del geminivirus hacia los biotipos que lo transmiten y 

el cultivo que infecta. 



❑ Biotipo B 

■ Biotipo no B 

Frijol 	Cucúrbitas 

F
R

E
C

U
E

N
C

IA
S

 

35 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

Gráfica 4: Distribución de geminivirus según biotipo de Bemisia 
tabaci en diferentes cultivos 

En la gráfica 5, se observa la distribución de geminivirus de acuerdo a la región de 

muestreo. Al parecer, las muestras positivas y negativas se distribuyen con distinta frecuencia en 

ambas regiones, pero al efectuar el análisis de varianza, se obtuvo que la distribución de muestras 

positivas y negativas en ambas regiones es similar (significancia de 0.941). Lo que significa que, 

estadísticamente, las proporciones entre muestras positivas y negativas son muy parecidas en 

ambas regiones. Siempre se tiene un número mayor de muestras negativas que de muestras 

positivas sin importar la región. Debido a que ambas regiones están aisladas geográficamente y 

tienen diferentes condiciones climáticas, se puede pensar que estas variaciones podrían ser 

relevantes para la supervivencia y adaptación del geminivirus, pero se observó que no hay 

preferencias por parte del virus para infectar los cultivos que se encuentran en las dos regiones.  

28 



Gráfica 5: Distribución de geminivirus de acuerdo a región de 
muestreo 

29 

 

100% 

90% 

80% 

70% 

60% 

50% 

40% 

30% 

20% 

10% 

0% 

    

P
O

R
C

E
N

T
A

JE
S

 

■ muestras 
negativas 

❑ muestras 
positivas 

Sur 
	

Oriental 
REGION 

La gráfica 6 ilustra la distribución de los geminivirus según el biotipo de Bemisia ¡abad 

en ambas regiones de estudio. Aunque en la región oriental hay un mayor número de muestras 

positivas para geminivirus, la proporción de muestras positivas para geminivirus transmitidas por 

el biotipo B no es tan diferente para el sur (1/10) como lo es para el oriente (1/13). Esto se ve 

confirmado con el análisis de varianza el cual indica que no hay preferencias por el biotipo de 

Bemisia tabaci en ambas regiones. Lo que significa que el geminivirus está distribuido casi con la 

misma frecuencia en los biotipos de B. tabaci, tanto en el sur corno en el oriente. 



Gráfica 6: Distribución de geminivirus según biotipo de 
Bemisia tabaci en las regiones sur y oriental de Guatemala 

30 

 

100% 

90% 

80% 

70% 

607 

50% 

40% 

30% 

20% 

107 

0% 

  

P
O

R
C

E
N

T
A

JE
S

  

REGION 

■ Biotipo no B 

❑ Biotipo B 

La gráfica 7 muestra la distribución de geminivirus de acuerdo a la altitud a la que se 

encuentran los cultivos en donde se colectaron las muestras. Se observó que el rango de altitudes 

de los 801 a los 1000 metros sobre el nivel del mar es el que mayor porcentaje de muestras 

positivas presenta. Luego le sigue el rango de los 1001-1200 metros sobre el nivel del mar. En el 

rango de altitudes de 801-1000 metros, se encuentran varias localidades correspondientes al 

departamento de Jalapa en la región oriental, mientras que en el rango de los 201-400 metros, 

están situadas las varias localidades que fueron estudiadas en los departamentos de Escuintla y 

Mazatenango. Esto podría indicar que existen preferencias por parte de la mosca blanca por 

ciertos rangos de altitudes. Se debe considerar un factor muy importante y es que los cultivos 

estudiados no pueden ser cultivados en todos los rangos de altitudes y es por ésto que 

posiblemente algunas altitudes posean mayores porcentajes de virus. 

La distribución de geminivirus según altitud se pudo ver afectada por el tipo de muestreo 

que se efectuó, ya que no se tomó un número fijo de localidades de muestreo para cada rango de 

altitudes. Además, no se tomaron muestras en localidades situadas entre los 601 y los 800 metros, 

ya que en estas altitudes no se encontraron cultivos de interés. Este sesgo se debe tomar en 

consideración a la hora de interpretar los datos estadísticos que se efectuaron con el análisis de 

varianza en el programa estadístico SPSS. 



■ muestras negativas 

1:1 muestras positivas 

31 

Al efectuar el análisis de varianza éste reveló que la distribución de geminivirus no es 

equitativa entre los rangos de altitudes, esta diferencia es significativa (significancia de 0.022). Lo 

que indica que las proporciones entre muestras positivas y negativas para geminivirus no son 

iguales en los rangos estudiados. Además, cuando se consideran sólo los casos positivos para 

geminivirus, se observó que éstos no se distribuyen de igual forma, lo cual indica que sí hay 

preferencia por ciertos rangos de altitudes. 	Esta preferencia también es significativa 

(signi ficancia de 0.0 I 8). 

Gráfica 7: Distribución de geminivirus según altitud 
en donde se encuentran los cultivos 

P
O

R
C

E
N

T
A

JE
S

 

100% 

90% 

80% 

70% 

60% 

50% 

40% 

307 

20% 

10% 

0*/ 

0-200 	201-400 	401-600 	801-1000 
	

1001-1200 

RANGO DE ALTITUD (metros) 

La gráfica a continuación muestra la distribución de geminivirus según el biotipo de 

Bennsia ¡abad a diferentes altitudes. Se observa claramente que las regiones situadas entre los 

201 a los 400 metros sobre el nivel del mar son las que presentan el mayor número de muestras 

positivas de geminivirus transmitidas por el biotipo B. En los rangos de altitudes de los 0-200 

metros y de los 801-1000 metros se detectó geminivirus en biotipo B, pero es un número 

demasiado pequeño en relación del número de muestras positivas totales. 

El análisis de varianza indicó que la distribución de geminivirus según biotipo de B.tabaci 

en los distintos rangos de altitudes es casi la misma, pero se debe tomar en consideración el factor 

de la toma de muestras. 



Gráfica 8: Distribución de geminivirus según biotipo de 
Bemisva tabaci a diferentes altitudes 

60 

so 

 

55 

40 

30 	 O Biotipo B 

■ Biotipo no B 
20 	 8  1 

10 	 

O 

L 
O l II . O 

0-200 	201-400 	401-600 	801-1000 	1001-1200 

RANGO DE ALTITUD (en metros) 

La gráfica 9 muestra la distribución de geminivirus según la época en que se efectuaron 

las colectas de muestras en la región oriental de Guatemala. La distribución de geminivirus antes 

y después de la época lluviosa no varía mucho. En la región oriental, antes de la época lluviosa, el 

porcentaje de muestras positivas para geminivirus es de 20.4%, mientras que en la época posterior 

a las lluvias fue de 18.58%. En el sur se observa que los porcentajes de muestras positivas para 

geminivirus son menores que en el oriente y además también se nota que estos porcentajes no 

varían considerablemente en ambas épocas. Esto indica que aunque las poblaciones de 
Bemisia 

!abad 
disminuyen durante la época lluviosa, las mismas vuelven a alcanzar sus niveles iniciales. 

También podría ser un indicador de que la infección de geminivirus por parte de la mosca blanca 
se mantiene casi constante. 

32 

F
R

E
C

U
E

N
C

IA
S

 



P
O

R
C

E
N

T
A

JE
S

 

100% 
90% 
80% 
70% 
60% 
50% 
40% 
30% 
20% 
10% 

OT 

Gráfica 9: Distribución de geminivirus según la época de colecta 
(Antes y después de la época lluviosa) 

Antes de 	Después 	Antes de 	Después 
la lluvia 	de la 
	

la lluvia 	de la 
(Oriente) 
	

lluvia 
	

(Sur) 
	

lluvia 
(Oriente) 
	

(Sur) 

EPOCA DE COLECTA 

C. DETECCION DE TIPOS DE GEMINIVIRUS POR SSCP (Single strand conformation 

polymorphism): 

Con el análisis de PCR únicamente se determinó la presencia/ausencia de geminivirus en 

las muestras analizadas, el análisis de PCR-SSCP permitió distinguir diferencias a nivel molecular 

entre los diferentes geminivirus detectados. Debido a ésto, a las muestras que resultaron positivas 

para geminivirus mediante el análisis de PCR, se les efectuó un análisis de SSCP. A partir de este 

análisis se obtuvieron 13 patrones de SSCP característicos bajo los cuales se pudieron clasificar 

las muestras positivas. 

Los diferentes patrones obtenidos a partir del análisis de SSCP se ilustran en el apéndice 

C. En la gráfica 10 se ilustra la distribución de patrones de SSCP de las muestras positivas para 

geminivirus. Se observó que el patrón 1 es el más frecuente (45.28%), seguido por el patrón 3 

(11.32%), el patrón 5 (10.38%), el patrón 7 (6.6%), los patrones 4 y 6 con 5.66%, patrón II 

(4.72%), patrón 2 (3.77%), el patrón 12 (2.83%) y por último los patrones 8, 9, 10 y 13 los cuales 

representan un 0.94% del total. 

33 

■ Muestras negativas 

❑ Muestras positivas 



Gráfica 10: Distribución de patrones de SSCP de las muestras 
positivas para geminivirus 

50 

45 

40 

35 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

0 1 

El cuadro 1 muestra la distribución de patrones de SSCP según el cultivo. El patrón 1, 

además de ser el más común, fue encontrado en muestras de los cinco cultivos estudiados, lo que 

podría indicar que es el virus mejor adaptado, ya que puede existir en un rango amplio de cultivos. 

El patrón 3, el segundo más frecuente, fue encontrado en chile, tomate, frijol y tabaco, pero no se 

encontró en ninguna cucúrbita. El patrón 5, a pesar de ser menos frecuente que el 3, se encontró 

en los cinco cultivos estudiados. El patrón 4 fue encontrado únicamente en frijol y cucúrbitas, el 

patrón 6 en chile y tabaco y el 7 únicamente se encontró en cultivos de chile y cucúrbitas. Se 

observó que los patrones de las muestras analizadas que fueron colectadas en los cultivos de chile 

son los que mayor variabilidad presentan, ya que se encontraron 8 patrones diferentes, de los 

cuales 2 son exclusivos de este cultivo. Esto podría indicar que éste cultivo provee de mejores 

condiciones para que el virus se adapte y sobreviva. El frijol fue el cultivo que presentó la menor 

cantidad de patrones. Todos los cultivos poseían al menos un patrón característico, a excepción 

del frijol. El análisis de varianza indica que la diferencia en la distribución de patrones según el 

cultivo es significativa 

34 

F
R

E
C

U
E

N
C

IA
S

 

48  

11,  

, 	
E

3  

2 	3 	4 	5 
	

6  PATION 8 
	

9 	10 	11 	12 	13 



Cuadro I Distribución de patrones de SSCP según cultivo 

CULTIVO PATRONES ENCONTRADOS 
Chile 1,3,5,6,7,9,10 y 11 
Tomate 1,2,3,5,11 y 12 
Tabaco 1,3,5,6,12 y 13 
Frijol 1,3,4 y 5 
Cucúrbitas 1,4,5,7,8 y 12 

En la gráfica I I se muestra la distribución de patrones de SSCP de geminivirus según el 

biotipo de B. tabaci que lo transmite. Se observó que los patrones 1, 5 y 6 son transmitidos por 

B. /abad tanto del biotipo B como del no B. Estos patrones se encontraron en dos cultivos 

exclusivos: chile y tabaco. El patrón 8 es transmitido sólo por el biotipo B y se encontró 

únicamente en cucúrbitas. Se notó que el patrón 3 es transmitido por B.tabaci biotipo no B y se 

encuentra en un rango amplio de cultivos como lo son el chile, el tabaco, el tomate y el frijol. 

El resto de patrones, correspondientes a distintos geminivirus, son transmitidos por los 

otros biotipos de Beinisia labaci. Esto continua que los distintos biotipos de B.iabaci transmiten 

distintos tipos de geminivirus y que algunos tipos de geminivirus son comunes para los biotipos 

B y no B. Tambien se observó que el biotipo B transmite menos tipos de geminivirus y en menor 

proporción que el biotipo no B. 

Gráfica 11: Distribución de patrones de SSCP según biotipo de 
Bemisia tabaci 

35 

 

45 

40 

35 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

      

       

F
R

E
C

U
E

N
C

IA
S

 

      

     

❑ Biotipo 

■ Biotipo no B 

     

     

     

      

      

       

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 

PATRON DE SSCP 



fI 	 

  

  

  

  

  

  

  

• 

 

F
R

E
C

U
E

N
C

IA
S

 

35 

30 

25 

20 

15 

10 

40 

5 

❑ Sur 

■ Oriental 

36 

En la siguiente gráfica se aprecia la distribución de patrones de SSCP según la región de 

estudio. Se notó que ambas regiones tienen 6 patrones de SSCP en común, lo que significa 6 

tipos de geminivirus en común. A simple vista, se notó que la región oriental tiene la mayor 

variedad de geminivirus, ya que aquí se encontraron todos los patrones de SSCP y en mayores 

proporciones que en el sur; además de encontrarse patrones exclusivos que no se encuentran en la 

otra región. Pero debe tomarse en consideración que en algunos patrones existe sólo una muestra, 

lo que no permite hacer una conclusión concreta. 

El análisis de varianza reveló que las diferencias que pudieran existir en la distribución de 

los patrones no son significativas y ello podría deberse al número tan pequeño de muestras en 

cada patrón. Seria necesario tener ún mayor número de muestras para poder sacar una conclusión 

confiable. 

Gráfica 12: Distribución de patrones de geminivirus según región de 
muestreo 

2 	3 	4 	5 	6 	7 	8 	9 	10 	11 	12 	13 

PATRON DE SSCP 



VI. CONCLUSIONES 

I. De las 732 muestras de Berlina tabaci analizadas, fue posible detectar 108 positivas para 

geminivirus, lo cual representa 15% del total de muestras. 

7% de las muestras positivas para geminivirus fueron detectadas en individuos de B.tabact 

pertenecientes al biotipo B. Las muestras positivas y negativas de geminivirus se distribuyen 

aproximadamente con la misma frecuencia entre los distintos biotipos de Bernisia tabact. La 

frecuencia con la que aparece él virus no es la misma para todos los biotipos, lo que indica 

que los geminivirus tienen preferencias por el biotipo no B. 

3. Se detectó la presencia de geminivirus en los cinco cultivos estudiados, encontrándose un 

mayor porcentaje de muestras positivas en cultivos de tomate y chile. La distribución de 

muestras positivas y negativas para geminivirus es similar en los cultivos estudiados. Existen 

preferencias por parte de los geminivirus hacia ciertos cultivos; en este caso hay una 

predilección por los cultivos de chile y tomate. 

4. Se detectaron muestras positivas para geminivirus en ambas regiones de estudio, 

encontrándose una mayor proporción de muestras positivas en la región oriental. No hay 

preferencias por el biotipo de &muta tabaci que transmite el virus en ninguna de las dos 

regiones. La distribución de frecuencias de muestras positivas para geminivirus en los biotipos 

de B.tabact es casi la misma tanto en el sur como en el oriente. 

5. Se encontró un mayor porcentaje de muestras positivas para geminivirus en un rango de 

altitudes que va de los 801 a los 1000 metros sobre el nivel del mar. La distribución de 

geminivirus no es equitativa entre los rangos de altitudes; esta preferencia es significativa. Al 

considerar sólo los casos positivos para geminivirus se determinó que si hay preferencia por 

ciertos rangos de altitudes, específicamente el rango de los 801-1000 metros sobre el nivel del 

mar. En el rango de los 201-400 metros sobre el nivel del mar fué donde se encontró el menor 



38 

porcentaje de muestras positivas para geminivirus. El análisis estadístico reveló que esta 

preferencia también es significativa. 

6. No existe una diferencia significativa entre la distribución de geminivirus antes de la época 

lluviosa y después de la época de lluvias. 

7. La distribución de geminivirus en los diferentes rangos de altitudes así como en ambas 

regiones de estudio puede ser un reflejo de las distintas prácticas de cultivo que se tienen en 

las distintas regiones del pais. Estas prácticas pueden determinar la manera en que se 

distribuyen y propagan los geminivirus por medio del vector Bemisia ¡abad. 

8. Existe polimorfismo en la secuencia amplificada por PCR perteneciente al gen que codifica 

para la proteína de cobertura de geminivirus. Estos polimorfismos se detectaron en forma de 

patrones de bandas de SSCP (Single strand conformation polymorphism) los cuales se 

clasificaron tentativamente en 13 patrones de bandas aparentemente distintos, cada uno de 

ellos representa un tipo diferente de virus. 

9. De los 13 patrones de bandas de SSCP, el patrón 1 es el más frecuente. 

10 Se encontraron 3 tipos de geminivirus transmitidos tanto por B.tabaci biotipo B como del no 

B (patrones 1,5 y 6), pero se encontró un tipo de virus transmitido únicamente por el biotipo 

B y que es exclusivo de las cucúrbitas (patrón 8). Los patrones 1 y 5 fueron encontrados en 

todos los cultivos estudiados. En los cultivos de chile fue en donde se detectaron el que 

mayor número de patrones de SSCP, además se encontraron 2 patrones exclusivos de este 

cultivo (7 y 10). 

11. Las regiones sur y oriental poseen 6 tipos de geminivirus en común (patrones 1,3,5,6,7 y 11); 

en la región oriental se encontraron 7 tipos de virus que no se encontraron en el sur 

(2,4,8,9,10,12 y 13). 



39 

12. El biotipo no B es más virulífero que el biotipo no B, ya que de los 13 patrones detectados, 

transmite 12 de ellos (no transmite el número 8). El biotipo B únicamente transmite 4 tipos 

de virus (1,5,6, y 8). El virus correspondiente al patrón 8 es transmitido únicamente por el 

biotipo B y se encuentra solamente en cultivos de cucúrbitas. 



VII. RECOMENDACIONES 

I. Efectuar muestreos en los que se hagan colectas en un mismo número de localidades en cada 

región y en cada rango de altitudes. Debido a que no se tienen muestras de cultivos situados 

en un rango de altitudes de los 601 a los 800 metros sobre el nivel del mar, se recomienda 

efectuar colectas en dichas áreas. De esta forma, se obtendrá un rango de estudio más amplio, 

en el que se podrán hacer mejores comparaciones para obtener conclusiones más confiables en 

cuanto a la distribución de los geminivirus, según la altitud en donde se encuentran los 

cultivos de interés. 

2. Secuenciar algunas muestras representativas de cada patrón de SSCP resultante para comparar 

a nivel molecular los polimorfismos que pudieran existir y si tienen alguna significancia. 

3. Efectuar un análisis filogenético para determinar las relaciones existentes entre los 

geminivirus detectados en las regiones estudiadas con geminivirus que hayan sido estudiados 

en otras regiones. Esto podría ayudar a determinar algunos factores que pudieron haber 

influido en el aparecimiento de nuevos geminivirus. 

4. Diseñar programas de control biológico de Bemisia !abata al emplear la información obtenida 

en este estudio. 



VIII. BIBLIOGRAFIA 

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42 



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East". FAO Plant Prot. Bulletin. Vol 42/1-2., 33-58 

43 



APENDICE A 

I. Preparación de solución amortiguadora de lisis para mosca blanca 

CONCENTRACION INICIAL CONCEN 	l RACION FINAL VOLUMEN FINAL (1 ml) 
Tris-HCI 5 mM pH 8.0 5 mM 5 ul 
EDTA 0.5 mM pH 8.0 0.5 mM 1 ul 
Nonident P-40 0.5% 0.5% 5 ul 
Proteinasa K 1.0 mg/ml 1.0 mg/m1 0.001 g 
Agua destilada y estéril 989.0 ml 

2. Mezcla de reacción para detección de geminivirus acs-  PCR 

Reactivo 
(Concentración del Stock) 

Volumen a agregar del 
stock 

Solución amortiguadora 10x 2.5 p.I 
MgC12  25 mM 2.5 1.11 
dNTP's 2.5 mM 1.5 ul 
imprimador 514 0.75 ul 
imprimador 1048 0.75 ul 
Taq ADN polimerasa 0.25 jil 
molde de ADN (muestra) 6.0 ul 
agua destilada desionizada 9.75 ill 

3. Programa de amplificación para detección de geminivirus por PCR 

a) 1 ciclo: 
2 minutos 95°C 

b) 35 ciclos: 
1 minuto a 95°C 
1 minuto a 58°C 
1 minuto a 72°C 

c) 1 ciclo: 
5 minutos a 72°C 



4. Preparación del gel de agarosa.  

Mezclar 0.24 g de agarosa en 30 ml de solución amortiguadora TAE lx. Calentar hasta 

que la agarosa se disuelva. Dejar enfriar la mezcla y verter en el recipiente de la cámara 

electroforética. Dejar reposar por 30 minutos hasta que el gel se haya gelificado. 

5. Preparación de gel de acrilamida:  

a) Para 50 ml. de solución de acrilamida. Mezclar 10.5 ml de solución stock de acrilamida, 6 ml 

de TBE 5X y 33. 5 ml de agua destilada. Filtrar la solución al vacío para degasificar. 

Solución amortiguadora TBE 50X: 

540 g Tris base 
275 g ácido bórico 
200 ml EDTA 0.5M pH8 
8985 ml agua destilada estéril 

b) Agregar 50 ul de TEMED, mezclar, luego agregar 50 ul de persulfato de amonio 25% (p/v). 

c) Verter la solución a las placas de electroforesis, luego colocar los peines y esperar de 1 a 1 y 

1/2 horas para que polimerice. 

d) Remover los peines y lavar los pozos con TBE 0.5X. 

6. Preparación solución TBE 5X: 

Para 10 litros de solución mezclar: 

540 g de Tris base 

275 g de ácido bórico 

200 ml de EDTA 0.5M pH 8 

8985 ml de agua destilada 

7. Solución TAE 50X:  

Para 1 litro de solución mezclar: 

242 g de Tris base 

57.1 ml de ácido acético 

100 ml de EDTA 0.5M pH 8 

45 



8. Solución EDTA 0.5M p_LI 8: 

Para 2 litros de solución mezclar: 

372.2 g de EDTA 

40 g de NaOH 

2000 ml de agua destilada 

9. Preparación de ácido acético al 10% 

Para 100 ml de solución: 

Mezclar 10 ml de ácido acético concentrado en 90 ml de agua destilada. 

46 



APENDICE B 

A. Materiales y Equipo 

1. Reactivos: 

Reactivo Marca Especificaciones 
Tris-HC1  Sigma Grado reactivo 
Nonident P-40  Sigma Grado reactivo 
EDTA  Sigma Grado reactivo 
Proteinasa K  Sigma Grado Biolgía Molecular 
deoxinucleótidos trifosfatados  Promega Grado Biología Molecular 
Cloruro de Magnesio  Promega Grado Biología Molecular 
Solución amortiguadora 10x 
para PCR  

Prbmega Grado Biología Molecular 

Taq ADN polimerasa  Promega Grado Biología Molecular 
Acido bórico  J.T. Baker Grado reactivo 
Agarosa Sigma Grado Biología Molecular, uso 

rutinario 
Acrilamida  Merck Grado Biología Molecular 
Bis-acrilamida  Merck Reactivo pureza electroforesis 
Nitrato de plata  Merck Grado reactivo 
Acido acético  Merck Grado reactivo 
Carbonato de sodio  Merck Grado reactivo 
TEMED  Bio-Rad Grado reactivo 
' Persulfato de amonio Sigma Grado reactivo 
Tiosulfato de sodio  J.T. Baker Grado reactivo 
Glicerol  Merck Grado reactivo 
Aceite mineral  Sigma Grado Biología Molecular 
Bromuro de etidio  Fisher Biotech Reactivo pureza electroforesis 
Formaldehido al 37%  Merck Grado reactivo 
Imprimador 514 para proteína 
de cobertura de geminivirus 

GIBCO BRL Secuencia: 
5' GCCC (AT) TGTA (TC) AG 
(AG) AAGCC (AC) AG 3' 

Imprimador 1048 para 
proteína de cobertura de 
geminivirus 

GIBCO BRL Secuencia: 
5' GG (AG) TT (ATG) GA 
(GA) GCATG (TCA) 
GTAACATG 3' 



2. Equipo: 

Equipo Marca Especificaciones 
Modelo PTC-100 Termociclador  MI Research, Inc. 

Fuente de poder  Sigma-Aldrich Techware PS 251-1 
Cámara de electroforesis 
horizontal 

Sigma Chemical Co. Mod. E 0638; 250 V DC; 
límites de operación: 250V 
DC, 15W, 60 mA, 50°C 

Cámara de electroforesis 
vertical  

Bio-Rad Mini Protean 11 

Secador de geles  Bio-Rad 
Bloque térmico  Thermolyne 
Estufa con agitador magnético Thermolyne Nuova II 
Micropipetas Pipetman Gilsam 2, 10, 20 pi 
Micropipetas Oxford 100 y 1000 ul 
Balanza analítica Mettler Modelo AE163 
Estereoscopio Heerbrugg Modelo M3Z 
Cámara de fotos UV Fotodyne Polaroid Modelo MP-ST 

3. Materiales: 

Probetas 10, 50 y 100 ml. 
Beakers 50, 100, 250 y 500 ml. 
Agitadores magnéticos 
Papel encerado 
Morteros eppendorff 
Tubos eppendorff de 0.5 y 1.5 ml 
Cajas Petri 
Bulbos para pipetas 
Filtros Nalgene 
Cronómetros 
Gradillas para tubos eppendorff 
Puntas para micropipeta de 0.5-20, 40-200 y 50-1000 ol 
Parafilm 
Erlenmeyers 125 ml 
Asas de montaje 
Espátulas 

— Recipientes para tinción 
Frascos Wheaton de 125, 250 , 500 y 1000 ml 
Pipetas Pastear 

— Papel encerado 

48 



11 	0 

Cr) 

EN 

E O 

GO 

Er) 



APENDICE D 
Cuadros de datos y resultados 

Muestra  Codigo Cultivo Región Biotipo Presencia Patrón Altitud 1 ETa42 Tabaco Oriente no 8 Positivo 1 5 2 ETa42 Tabaco Oriente no 8 Positivo 6 5 3 ETa42 Tabaco Oriente no 8 Negativo O 5 
4 ETa42 Tabaco Oriente no B Negativo 0 5 5 ETa42 Tabaco Oriente no 8 Positivo 1 5 6 ETa42 Tabaco Oriente no B Positivo 13 5 
7 ETa42 Tabaco Oriente no 8 Positivo 3 5 
3 ETa42 Tabaco Oriente no B Negativo 0 5 
9 ETa42 Tabaco Oriente no 8 Negativo 0 5 

10 ETa42 Tabaco Oriente no 8 Positivo 12 5 
12  EF39 Frijol Oriente no 8 Negativo 0 5 
13  EF39 Frijol Oriente no B Negativo 0 5 
14 EF39 Frijol Oriente no B Negativo 0 5 
15 EF39 Frijol Oriente no 8 Negativo O 5 
16 EF39 Frijol Oriente no 8 Negativo 0 5 
17 EF39 Frijol Oriente no B Negativo 0 5 
18 EF39 Frijol Oriente no 8 Negativo 0 5 
19 EF39 Frijol Oriente no 8 Positivo 1 5 
20 EF39 Frijol Oriente no B Positivo 3 5 
41 EM02 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 
42 EM02 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
55 EM105 Cucúrbita Oriente E Positivo 12 2 
56 EM105 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
57 EM105 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 
58 EM105 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
59 EM105 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
60 EM105 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 
61 EM105 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
62 EM105 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 
63 EM105 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 
64 EM105 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 
65 ETo52 Tomate Oriente no 8 Positivo 2 5 
66 ETo52 Tomate Oriente B Positivo 6 5 
67 ETo52 Tomate Oriente no B Negativo 0 5 
68 ETo52 Tomate Oriente no 8 Positivo 12 5 
69 ETo52 Tomate Oriente no 8 Negativo 0 5 
70 ETo52 Tomate Oriente no 8 Negativo 0 5 
71 ETo52 Tomate Oriente no 8 Negativo 0 5 
72 ETo52 Tomate Oriente no 8 Negativo 0 5 
73 ETo52 Tomate Oriente no B Negativo 0 5 
74 ETo52 Tomate Oriente no B Negativo 0 5 

103 SCu95 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 2 
104 SCu95 Cucúrbita Sur B Negativo 0 2 
105 SCu95 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
106 SCu95 Cucúrbita Sur B Negativo 0 2 
107 SCu95 Cucúrbita Sur 13 Negativo 0 2 
108 SCu95 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
109 SCu95 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
110 SCu95 Cucúrbita Sur no 8 Positivo 5 2 
111 SCu95 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
112 SCu95 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 

Rangos de 
altitud 
1 = 0-200 metros 
2 = 201-400 metros 
3 = 401-600 metros 
4 = 601-800 metros 
5 = 801-1000 metros 
6 = 1001:H200 metros 



Muestra  Codigo Cultivo Región Biotipo Presencia Patrón Altitud 
113 SCu95 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 114 SCu95 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 121  8381 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 
122 SC79 Chile Sur no 9 Negativo 0 1 
123 SC79 Chile Sur no 8 Positivo 6 
124 SC79 Chile Sur no B Positivo 
125 SC79 Chile Sur no 8 Negativo 0 
126 SC79 Chile Sur no B Negativo 0 1 
127 SC79 Chile Sur no B Positivo 1 1 
128 SC79 Chile Sur no B Negativo 0 1 
129 SC79 Chile Sur no 18 Negativo 0 1 
130  SC79 Chile Sur no B Positivo 3 
131 SC79 Chile Sur no B Negativo 0 1 
132 SC79 Chile Sur no B Negativo 0 1 
133 SC79 Chile Sur no B Negativo 0 
134 SC79 Chile Sur no B Negativo 0 1 
135 SC79 Chile Sur no 8 Negativo 0 
136 SC79 Chile Sur no B Positivo 5 1 
137 SC79 Chile Sur no B Negativo 0 1 
138 SS80 Cucúrbita Sur 8 Positivo 1 
139 SS80 Cucúrbita Sur no 9 Negativo 0 1 
140 SS80 Cucúrbita Sur B Negativo 0 1 
141 SS80 Cucúrbita Sur no 9 Negativo 0 
142 SS80 Cucúrbita Sur no 8 Positivo 5 
143 SS80 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 
144 SS80 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
145 SS80 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 
146 SS80 Cucúrbita Sur B Negativo 0 1 
147 SS80 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 1 
148 SF78 Frijol Sur no 8 Negativo 0 1 
149 SF78 Frijol Sur no 8 Negativo 0 1 
150 SF78 Frijol Sur no B Negativo 0 1 
151 SF78 Frijol Sur no B Negativo 0 1 
152 SF78 Frijol Sur no B Negativo 0 1 
153 SF78 Frijol Sur no 8 Negativo 0 1 
154 SF78 Frijol Sur no B Negativo 0 1 
159 SCu82 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 2 
160 SCu82 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 2 
161 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
162 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
163 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
164 SCu82 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 2 
165 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
166 SCu82 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 2 
167 SCu82 Cucúrbita Sur no 8 Positivo 5 2 
168 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
169 STa85 Tabaco Sur no 9 Negativo 0 1 
170 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 
171 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 
172 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 1 
173 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 1 
174 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 
175 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 1 
176 STa85 Tabaco Sur no 8 Negativo 0 1 

Rangos de 
altitud 
1 = 0-200 metros 
2 = 201-400 metros 
3 = 401-600 metros 
4 = 601-800 metros 
5 = 801-1000 metros 
6 = 1001-1200 metros 



Muestra  Codigo Cultivo Región Biotipo Presencia Patrón Altitud 
177 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 1 
178 ST285 Tabaco Sur no 8 Negativo 0 1 
179 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
180 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
181 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo  0 1 
182 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
183 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
184 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 
185 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
186 SM92 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 1 
187 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
189 STo96 Tomate Sur no B Negativo 0 1 
190 STo96 Tomate Sur no 8 Negativo 0 
191 STo96 Tomate Sur no 8 Negativo 0 1 
192 STo96 Tomate Sur no 8 Negativo 0 1 
193 STo96 Tomate Sur no 8 Negativo 0 1 
194 STo96 Tomate Sur no E Negativo 0 1 
195 STo96 Tomate Sur no B Positivo 1 1 
196 STo96 Tomate Sur no 8 Negativo 0 1 
197 STo96 Tomate Sur no B Negativo 0 
198 STo96 Tomate Sur no B Negativo 0 
209 ETo52 Tomate Oriente no B Negativo 0 5 
210 ETo52 Tomate Oriente no 8 Negativo 0 5 
211 ETo52 Tomate Oriente no 8 Negativo 0 5 
212 ETo52 Tomate Oriente no 8 Positivo 1 5 
213 ETo52 Tomate Oriente no B Positivo 1 5 
214 ETo52 Tomate Oriente no E Positivo 1 5 
215 ETo52 Tomate Oriente no 8 Negativo 0 5 
216 ETo52 Tomate Oriente no 2 Negativo 0 5 
217 ETo52 Tomate Oriente no B Positivo 1 5 
218 ETo52 Tomate Oriente no 9i Negativo 0 5 
219 EC41 Chile Oriente no 8 Negativo 0 5 
220 EC41 Chile Oriente no B Negativo 0 5 
221 EC41 Chile Oriente no B Negativo 0 5 
222 EC41 Chile Oriente no 8 Negativo 0 5 
223 EC41 Chile Oriente no B Negativo 0 5 
229 ES104 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 
230 ES104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
231 ES104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
232 85104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
233 85104 Cucúrbita Oriente B Positivo 1 2 
234 ES104 Cucúrbita Oriente B Positivo 1 2 
235 E5104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
236 8'5104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
237 85104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
238 E5104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
239 EF49 Frijol Oriente no 8 Negativo 0 5 
240 EF49 Frijol Oriente no B Negativo 0 5 
241 EF49 Frijol Oriente no B Negativo 0 5 
242 EF49 Frijol Oriente no 8 Negativo 0 5 
243 EF49 Frijol Oriente no 8 Negativo 0 5 
244 ES54 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 5 
245 ES54 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 5 
246 ES54 Cucúrbita Oriente no B Negativo i 0 5 



Muestra  Codigo Cultivo Región Biotipo Presencia Patrón Altitud 
247  ES54 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 _ 5 
248 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 
249 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 
250 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 
251 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 1 
252 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 1 
253 STa85 Tabaco Sur no B Negativo 0 
254 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
255 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
256 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
257 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
258 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
259 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
260 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
261 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 
262 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 
263 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
264 SCu82 Cucúrbita Sur no 9 Positivo 7 2 
265 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
266 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
267 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
268 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 
269 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
270 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
271 SCu82 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 2 
272 SCu82 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 2 
283 STo96 Tomate Sur B Negativo 0 1 
284 STo96 Tomate Sur no B Negativo O 1 
285 STo96 Tomate Sur B Negativo 0 1 
286 STo96 Tomate Sur B Positivo 1 1 
287 STo96 Tomate Sur no 8 Negativo 0 1 
288 STo96 Tomate Sur no B Negativo 0 1 
289 STo96 Tomate Sur no B Positivo 1 1 
290 STo96 Tomate Sur no 8 Negativo 0 
291 STo96 Tomate Sur no 8 Negativo 0 1 
292 STo96 Tomate Sur no 8 Negativo 0 
293 SF78 Frijol Sur no B Negativo 0 1 
294 SF78 Frijol Sur no B Negativo 0 1 
295 SF78 Frijol Sur no B Negativo 0 
296 SF78 Frijol Sur no 8 Negativo 0 1 
297 SM92 Cucúrbita Sur 8 Negativo 0 1 
298 SM92 Cucúrbita Sur B Negativo 0 
299 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 
300 SM92 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 1 
301 SM92 Cucúrbita Sur B Negativo 0 
302 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
303 SM92 Cucúrbita Sur B Negativo 0 1 
304 SM92 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 1 
305 SM92 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 1 
306 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
307 SM92 Cucúrbita Sur B Negativo 0 1 
308 EM105 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 
309 EM105 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 
310 EM105 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 



Muestra  Codigo Cultivo Región Biotipo Presencia Patrón Altitud 311 EM105 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 _ 2 312 EM105 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 313 EM105 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 _ 2 314 EM105 Cucúrbita Oriente B Negativo O 2 315 EM105 Cucúrbita Oriente B Negativo O 2 316 EM105 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 317 EM105 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 318 SS80 Cucúrbita Sur no B Positivo 1 1 
319 SS80 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 
320 SC79 Chile Sur no B Positivo 3 1 
321  SC79 Chile Sur no B Positivo 1 
322 SC79 Chile Sur no B Negativo 0 1 
323  SC79 Chile Sur no B Negativo 0 1 
324  SC79 Chile Sur no B Positivo 11 1 
325  SC79 Chile Sur no 8 Negativo 0 1 
326  SC79 Chile Sur no B Positivo 5 
327  SC79 Chile Sur no 8 Positivo 1 
328 SC79 Chile Sur no B Positivo 1 1 
329  SC79 Chile Sur no 8 Positivo 7 1 
330 STo87 Tomate Sur no B Negativo 0 2 
331  EPe48 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 5 
332 EPe48 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 5 
333  EPe48 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 5 
334  EPe48 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 5 
335  EPe48 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 5 
336 EPe48 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 5 
337 EPe108 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
338  EPe108 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 
339  EPe108 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 
340  EPe108 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 
341  EPe108 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
342 EPe108 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 
343 EPe108 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 
344 EPe108 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
345 EPe108 Cucúrbita Oriente B Positivo 8 2 
346 EPe108 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
347 EC53 Chile Oriente no B Negativo 0 5 
348 EC53 Chile Oriente no 8 Positivo 7 5 
349 EC53 Chile Oriente no 8 Positivo 7 5 
350 EC53 Chile Oriente no B Positivo 7 5 
351 EC53 Chile Oriente no B Positivo 7 5 
352 EC50 Chile Oriente no B Negativo 0 6 
353 EC50 Chile Oriente no 8 Negativo 0 6 
354 ECSO Chile Oriente no B Negativo 0 6 
355 EC50 Chile Oriente no B Negativo 0 6 
356 ECSO Chile Oriente no B Negativo 0 6 
357 ECSO Chile Oriente no B Negativo 0 6 
358 ECSO Chile Oriente no B Negativo 0 6 
359 EC50 Chile Oriente no 8 Negativo 0 6 
360 ECSO Chile Oriente no B Negativo 0 6 
361 EC50 Chile Oriente B Negativo 0 6 
362 ES51 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 6 
363 ES51 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 6 
364 ES51 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 6 



Muestra  Codigo Cultivo Región Biotipo Presencia Patrón Altitud 365 ES51 Cucúrbita Oriente no 13 Negativo O 6 366 ES51 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 	6 367 ES51 Cucúrbita Oriente no B Negativo O 	
_ 
6 366 ES51 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 	6 369 ES51 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 6 370 ES51 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 6 371 ES51 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 6 372 ES104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 373 ES104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 374 ES104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 375 ES104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 376 ES104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 377 ES104 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 378 ETa42 Tabaco Oriente no B Positivo 1 5 

379 ETa42 Tabaco Oriente no B Positivo 1 5 380  ETa42 Tabaco Oriente no 13 Negativo 0 5 381  ETa42 Tabaco Oriente no B Positivo 6 5 
382  ETa42 Tabaco Oriente no B Negativo 0 5 383  ETo26 Tomate Oriente no B Positivo 1 2 
384  ETo26 Tomate Oriente no B Positivo 5 2 
385  ETo26 Tomate Oriente no B Positivo 1 2 
386  ETo26 Tomate Oriente no B Positivo 1 2 
387  ETo26 Tomate Oriente B Positivo 1 2 
388  ETo47 Tomate Oriente no B Positivo 1 6 
389  ETo47 Tomate Oriente no B Positivo 1 6 
390  ETo47 Tomate Oriente no B Positivo 1 6 
391  ETo47 Tomate Oriente no B Positivo 11 6 
392  ETo47 Tomate Oriente no B Positivo 1 6 393  ETo47 Tomate Oriente no B Negativo 0 6 394  ETo47 Tomate Oriente no 8 Positivo 11 6 
395  ETo47 Tomate Oriente no B Positivo 11 6 
396 ETo47 Tomate Oriente no B Positivo 1 6 397  ETo47 Tomate Oriente no B Positivo 11 6 
398  ETo52 Tomate Oriente no B Positivo 1 5 
399  ETo52 Tomate Oriente no B Positivo 3 5 
400  ETo52 Tomate Oriente no B Negativo 0 5 
401  ETo52 Tomate Oriente no B Negativo 0 5 
402  ETo52 Tomate Oriente no 3 Positivo 2 5 
403  ETo52 Tomate Oriente no B Positivo 3 5 
404  ETo52 Tomate Oriente no B Positivo 3 5 
405  ETo52 Tomate Oriente no B Positivo 2 5 
406  ETo52 Tomate Oriente no 3 Negativo 0 5 
407  ETo52 Tomate Oriente no B Positivo 2 5 
408  EC41 Chile Oriente no B Positivo 1 5 

 	409 EC41 Chile Oriente no B Positivo 1 5 
410  EC41 Chile Oriente no B Negativo 0 5 
411 EC41 Chile Oriente no B Positivo 9 5 
412 EC41 Chile Oriente no B Positivo 3 5 
413 EC41 Chile Oriente B Negativo 0 5 
414  EPe103 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 
415  EPe103 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
416  EPe103 Cucúrbita Oriente 	no B Negativo 0 2 
417 EPe103 Cucúrbita Oriente 	no B Negativo 0 2 
418 EPe103 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 



Muestra  Codigo Cultivo Región Bio ipo Presencia Patrón Altitud 
419 EPe103 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0  420 EPe103 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 421 EPe103 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 422 EPe103 Cucúrbita Oriente no 9 Negativo 0 2 423 EPe103 Cucúrbita Oriente no B Ne ativo 0 2 
424 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
425 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
426 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
427 EM106 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 
428 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
429 EC41 Chile Oriente no E Negativo 0 5 
430 EC41 Chile Oriente no 8 Negativo 0 5 
431 ETa46 Tabaco Oriente no 8 Negativo 0 5 
432 ETa46 Tabaco Oriente no 9 Negativo 0 5 
433 ETa46 Tabaco Oriente no B Negativo 0 5 
434 ETa46 Tabaco Oriente no B Negativo 0 5 
435 ETa46 Tabaco Oriente no B Positivo 3 5 
436 ETa46 Tabaco Oriente no 8 Negativo 0 5 
437 ETa46 Tabaco Oriente B Negativo 0 5 
438 ETa46 Tabaco Oriente no 8 Negativo 0 5 
439 ETa46 Tabaco Oriente B Negativo 0 5 
440 ETa46 Tabaco Oriente no B Negativo 0 5 
441 ETa46 Tabaco Oriente no 8 Negativo 0 5 
442 ETa46 Tabaco Oriente no B Negativo 0 5 
443 ETa46 Tabaco Oriente no B Negativo 0 5 
444 ETa46 Tabaco Oriente no B Negativo 0 5 
445 ETa46 Tabaco Oriente no 8 Negativo 0 5 
446 EF49 Frijol Oriente no 8 Negativo 0 5 
447 EF49 Frijol Oriente no 13 Negativo 0 5 
448 EF49 Frijol Oriente no 8 Negativo 0 5 
449 EC53 Chile Oriente no B Negativo 0 5 
450 EC53 Chile Oriente no B Negativo 0 5 
451 ES43 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 5 
452 ES43 Cucúrbita Oriente no E Negativo 0 5 
453 ES51 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 6 
454 E55 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 6 
455 ES51 Cucúrbita Oriente no E Negativo 0 6 
456 ES51 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 6 
457 ES51 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 6 
458 ES51 Cucúrbita Oriente no 9 Negativo 0 6 
459 ES51 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 6 
460 ES51 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 6 
461 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
462 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
463 SM92 Cucúrbita Sur no 8 Ne•ativo 0 1 
464 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
465 SM92 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 
466 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
467 SM92 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 1 
468 ETa42 Tabaco Oriente no B Negativo 0 5 
469 ETa42 Tabaco Oriente no 8 Negativo 0 5 
470 ETa42 Tabaco Oriente no 8 Negativo 0 5 
471 ETa42 Tabaco Oriente no B Negativo 0 5 
472 ETa42 Tabaco Oriente no B Negativo 



Muestra  Codigo Cultivo Región Biotipo Presencia Patrón Altitud 
473 SM92 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 
474 SM92 Cucúrbita Sur no 8 Negativo 0 1 
475 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 
476 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 
477 SM92 Cucúrbita Sur no B Negativo 0 1 
478 EF39 Frijol Oriente no 8 Negativo 0 5 
479 EF39 Frijol Oriente no 8 Negativo 0 5 
480 EF39 Frijol Oriente no 8 Negativo 0 5 
481 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
482 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
483 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
484 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
485 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
486 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
487 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
488 EM106 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
489 EM106 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 
490 EM106 Cucúrbita Oriente 5 Negativo 0 2 
491 EPe406 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 
492 EPe406 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
493 EPe406 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 , z 
494 EPe406 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
495 EPe406 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
496 EPe406 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
497 EPe406 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 
498 

I 
EPe406 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 

499 EPe406 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
500 EPe406 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 n z. 
501 EPe406 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
502 EPe406 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
503 EPe406 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
504 EPe406 Cucúrbita Oriente no B Negativo 0 2 
505 EPe406 Cucúrbita Oriente no 8 Negativo 0 2 
506 EM410 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
507 EM410 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
508 EM410 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 
509 EM410 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
510 EM410 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
511 EM410 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
512 EM410 Cucúrbita Oriente 8 Negativo 0 2 
513 EM410 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
514 EM410 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
515 EM410 Cucúrbita Oriente B Negativo 0 2 
516 ETo408 Tomate Oriente 8 Negativo 0 2 
517 ETo408 Tomate Oriente B Negativo 0 2 
518 ETo408 Tomate Or