Diseño de una estrategia para la sobre expresión de genes por intercambio de promotores en S. cerevisiae Esteban Bustamante UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias y Humanidades Diseño de una estrategia para la sobre expresión de genes por intercambio de promotores en S. cerevisiae Trabajo de graduación en modalidad de tesis presentado por Esteban Bustamante para optar al grado académico de Licenciado en Biotecnología Molecular Guatemala, 2024 UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias y Humanidades Diseño de una estrategia para la sobre expresión de genes por intercambio de promotores en S. cerevisiae Trabajo de graduación en modalidad de tesis presentado por Esteban Bustamante para optar al grado académico de Licenciado en Biotecnología Molecular Guatemala, 2024 Vo.Bo.: (f) PhD. Luis Diego Archila Díaz Comité de asesores: (f) PhD. Luis Diego Archila Díaz (f) PhD. José Carlos Campero Basaldua (f) MSc. Jose Miguel Morales Santiago Fecha de aprobación: Guatemala, 17 de Junio del 2024. Agradecimientos A mi casa de estudios Universidad del Valle de Guatemala (UVG), que me ha exigido tanto durante estos últimos años, pero me ha permitido crecer tanto personal como profesionalmente. A la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), que me ha mostrado la realidad de la investigación y el trabajo, es un honor poder decir que realicé mi trabajo de graduación en esa gran universidad. A la Dra. Alicia González Manjarrez, por abrirme las puertas a tu laboratorio, por todo tu apoyo que me permitió culminar mi proyecto de graduación. Agradezco mucho la amabilidad con la que nos recibiste y todo el acompañamiento que nos diste durante nuestra estancia. A mi asesor; Dr. Carlos Campero, porque sin ti este proyecto no hubiese sido posible. Te agradezco inmensamente el apoyo que me diste estando en México, los almuerzos que compartimos, las risas y todo tu apoyo tanto moral como intelectual. A mi asesor; Dr. Diego Archila, por los buenos consejos que me has compartido y por lo aprendido en tus clases. Te agradezco la pasión con la que nos has enseñado, me ayudaste a identificar el camino que quiero seguir. A la Lic. Sheyla Cruz, por tu apoyo con en la realización de este proyecto de graduación. Te agradezco tu amistad y los bonitos momentos que compartimos. Te deseo lo mejor y mucho éxito en tu nuevo proyecto de maestría. A mis compañeros del 301-Ote: Nancy, Cecy, Yael, Edgar, Yamile, David y Antonio, por todos los buenos momentos que compartimos. III Dedicatoria A mis padres; Mónica González y Boris Bustamante; por haberme criado con mucho amor y paciencia. Agradezco inmensamente el esfuerzo que han hecho por darnos la oportunidad de crecer académicamente. Agradezco su guía y enseñanzas para ser una persona con valores, responsable y agradecida. A mis hermanas; Ximena Bustamante y Natalia Gálvez; porque su presencia en mi vida es una luz, siempre me impulsan a seguir adelante. Agradezco su ayuda durante estos años, por todas las veces que me llevaron comida mientras estudiaba y se preocuparon por mí. A mi abuelita, Ana María, y a mi tía-abuela, Otilia; porque siempre que me he sentido solo o perdido, sé que en ustedes encuentro paz y compañía. Son un ejemplo para mi sobre lo que es amar incondicionalmente y agradezco inmensamente su amor. A mi familia; Cecilia, Ana, Julio, Marcos, Marquitos, Ricardo y Sofia; porque ustedes son un pilar muy importante en mi vida. Agradezco el amor que me han dado toda la vida, su acompañamiento, sus enseñanzas y su ejemplo. A mis amigos; quienes siempre han estado conmigo dándome su consejo y compartiendo su alegría. A todas las personas que han formado una parte en mi vida, han dejado una huella en mí que siempre me acompañará. IV Índice Agradecimientos III Dedicatoria Iv Lista de cuadros vII Lista de figuras vIII Resumen Abstract x v V ÍNDICE vi x Resumen El modulador híbrido Nrg1-Rtg3 es un complejo que mantiene la integridad mitocondrial. La pérdida de cualquiera de sus componentes causa graves alteraciones como la pérdida de funcionalidad, ADN mitocondrial y estructura nativa del organelo (Campero, 2023). Para entender el mecanismo de estas alteraciones, Carretero (2023) realizó un ensayo transcriptómico, revelando que la ausencia del modulador induce la sobreexpresión de redes genéticas involucradas en procesos de óxido-reducción, metabolismo de ácidos carboxílicos y transporte de metales de transición. Se diseñó una estrategia para la generación de una cepa mutante sobreexpresando el gen FRE5 usando el promotor TetO7, lo que resultó en un aumento de 37 veces en la expresión del gen FRE5 respecto a la cepa silvestre. Aunque este incremento no afectó el crecimiento en etanol, se propone que la sobreexpresión simultánea de varios genes puede ser necesaria para replicar el daño mitocondrial observado en mutantes petite. La integración del módulo recombinante y la sobreexpresión del gen FRE5 fueron verificadas mediante PCR y qPCR, confirmando un aumento significativo en la expresión. x Abstract The hybrid modulator Nrg1-Rtg3, a complex that maintains mitochondrial integrity. Loss of any of its components causes severe mitochondrial alterations such as loss of functionality, mitochondrial DNA and native structure of the organelle (Campero, 2023). To understand the mechanism of these alterations, Carretero (2023) performed a transcriptomic assay, revealing that the absence of the modulator induces the overexpression of genetic networks involved in oxidation-reduction processes, carboxylic acid metabolism and transition metal transport. A strategy was designed to generate a mutant strain overexpressing the FRE5 gene using the TetO7 promoter, resulting in a 37-fold increase in FRE5 gene expression over the wild-type strain. Although this increase did not affect growth in ethanol, it is proposed that simultaneous overexpression of several genes may be necessary to replicate the mitochondrial damage observed in petite mutants. Integration of the recombinant module and overexpression of the FRE5 gene were verified by PCR and qPCR, confirming a significant increase in expression. xI CAPÍTULO 1 Introducción En el laboratorio de la doctora Alicia González, se investigó el modulador híbrido Nrg1-Rtg3, un complejo que desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la integridad mitocondrial en Saccharomyces. cerevisiae. Se ha observado que las cepas mutantes en los genes NRG1 o RTG3, que codifican los componentes de este modulador, presentan alteraciones mitocondriales severas, como la pérdida de funcionalidad, la disminución del ADN mitocondrial y la alteración de la estructura nativa del organelo. Durante el estudio de las mutantes Nrg1-Rtg3, se determinó que, en ausencia de cualquier elemento del modulador transcripcional híbrido, se vuelven petite. Esto implica que el modulador transcripcional híbrido es clave en el mantenimiento de la integridad del ADN mitocondrial. Esto fue demostrado en el trabajo de Campero-Basaldua et al. (2023). Carretero (2023), demostró que la formación del modulador híbrido Nrg1-Rtg3 es dependiente de la alanina para la formación del complejo, se realizó un análisis por secuenciación de ARN para determinar los genes que se regulan por el complejo híbrido Nrg1-Rtg3. Esta técnica permitió identificar al grupo de genes que constituyen el circuito regulado de manera negativa. El análisis permitió identificar grupos de genes regulados por el complejo, dentro de estos destacan los siguientes Procesos de óxido – reducción. Metabolismo de ácidos carboxílicos. Transporte de metales de transición. 1 CAPÍTULO 2 El análisis bioinformático reveló que estas categorías de genes son las más relevantes, ya que, dentro de la red genética controlada por el modulador híbrido, son los más representados. En este estudio, se enfoca en los clústeres de genes relacionados con el transporte de metales de transición, utilizando como modelo el gen FRE5, que pertenece a dicho clúster. El objetivo es desarrollar una estrategia para generar una cepa mutante que sobreexprese el gen FRE5. Para lograr este objetivo, se reemplazó el promotor endógeno del gen FRE5 por el promotor TetO7, un promotor exógeno fuerte y reprimible por tetraciclina. Se utilizó el Software SnapGene para el diseño in silico de los oligonucleótidos necesarios para generar los módulos recombinantes que permitirían la sustitución del promotor. Esta investigación describe de forma detallada el proceso de diseño de los módulos recombinantes y demuestra su eficacia para obtener una cepa sobreexpresante del gen FRE5. 2 CAPÍTULO 3 Justificación Los reguladores híbridos se forman por la unión de dos reguladores transcripcionales diferentes. Estos reguladores tienen la capacidad de controlar redes genéticas complejas y de mantener la integridad de organelos celulares. Su descubrimiento fue un hito en la biología molecular, ya que permitió explorar nuevas formas de interacción entre reguladores y genes. Además, los reguladores híbridos son un ejemplo de la adaptación de los microorganismos, que aprovechan reguladores existentes para responder a nuevas necesidades regulatorias. Existen diferentes tipos de reguladores híbridos, y uno que actualmente se encuentra en estudio es el complejo formado por Nrg1-Rtg3, que participa en el mantenimiento de la integridad del ADN mitocondrial y con ello en la función de la mitocondria, el organelo responsable de la respiración celular y generación de energía para la célula por excelencia. Se ha demostrado que la ausencia de cualquiera de las subunidades que forman el híbrido impide su función regulatoria, lo que conlleva a la pérdida de funcionalidad, ADN y estructura nativa de la mitocondria. Este caso ilustra el papel crucial que pueden tener los reguladores híbridos en la integridad de los organelos. Un acercamiento para comprender el mecanismo por el cual se genera el daño mitocondrial asociado a la ausencia del regulador híbrido Nrg1-Rtg3 es la sobreexpresión de los genes pertenecientes al clúster regulado por el híbrido y evaluar si existe un daño mitocondrial semejante. Por lo tanto, es importante identificar una estrategia que permita sobre expresar este conjunto de genes de forma eficiente. En el presente proyecto de tesis se busca sobreexpresar un gen mediante el intercambio de promotores, el objetivo de esta investigación fue desarrollar una estrategia que permita sustituir un promotor endógeno por un promotor fuerte reprimible por tetraciclina y que permita una fácil selección de cepas mutantes por medio de resistencia a G418 (geneticina). Asimismo, establecer un protocolo para estandarizar la producción de los módulos para facilitar a los investigadores el estudio del efecto de la desregulación de genes en Saccharomyces cerevisiae. 2 CAPÍTULO 4 Objetivos 3.1. Objetivo general Generar una cepa que sobre exprese al gen FRE5 por medio de la sustitución del promotor endógeno por un promotor exógeno, reprimible por tetraciclina, utilizando módulos de recombinación en la levadura Saccharomyces cerevisiae. 3.2. Objetivos específicos Transformar la cepa DH5α de E. coli con el plásmido pCM325 mediante choque térmico y seleccionar las colonias resistentes a ampicilina. Optimizar las condiciones de PCR para la amplificación del módulo recombinante. Transformar la cepa silvestre R1158 de S. cerevisiae y comprobar la integración del módulo recombinante mediante PCR. Evaluar el fenotipo de la cepa sobreexpresante de FRE5, en glucosa o etanol como única fuente de carbono y amonio como única fuente de nitrógeno. Comprobar la sobreexpresión de FRE5 mediante qPCR y evaluar significancia estadística en el cambio de la expresión del gen FRE5, respecto a la cepa silvestre R1158 de S. cerevisiae. 3 CAPÍTULO 5 Marco Teórico 4.1. Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo El organismo modelo Saccharomyces cerevisiae también conocido como levadura común, es clasificada como un hongo o moho. S. cerevisiae es un eucariota unicelular, por lo que contiene organelos tales como el núcleo, sistema endomembranal y mitocondria. Las levaduras tienen una rápida división celular, su tiempo de duplicación se encuentra alrededor de los 90 minutos bajo condiciones óptimas. Su proceso de división celular es conocido como gemación, este proceso consiste en la formación de una yema a partir de la membrana de la levadura, al terminarse de separar da origen a un nuevo organismo genéticamente semejante. Debido a que las levaduras son producto de la gemación son genéticamente semejantes debido a que la gemación es un tipo de reproducción asexual (Murakami C. et al, 2009). S. cerevisiae posee un mecanismo de reproducción sexual, este proceso depende de dos perfiles de apareamiento: perfil α y el perfil a. Las células haploides α se unen a las células haploides a por medio de una estructura llamada Schmoo, esto genera una célula diploide a/α que puede replicarse de forma asexual indefinidamente, generando yemas diploides genéticamente semejantes. Bajo condiciones pobres en nitrógeno, las células diploides son inducidas a meiosis, lo que genera un asca que contiene 4 esporas haploides; cuando la espora germina se liberan 4 células haploides (Figura 4.1) (Duina A. et al, 2014). 4 CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 6 Figura 4.1 Simplificación del ciclo de vida de S. cerevisiae. Nota. Adaptada de Duina et al, 2014. Este organismo levaduriforme ha sido un sello distintivo en la historia de la investigación científica. Ha sido utilizado debido a que no está sujeto a múltiples restricciones éticas asociadas a la experimentación con organismos vivos, además proveen una estructura en la que se pueden desarrollar y optimizar métodos analíticos; y es muy sencillo manipular su ciclo de vida en condiciones controladas en el laboratorio (Altmann et al, 2007). Por otra parte, al ser un organismo eucariota se considera representativo de una gran clase de organismos vivos en cuanto al estudio de procesos biológicos altamente conservados (Beck H. et al, 2008). La selección de organismos modelos depende principalmente en la acumulación de experiencia y disponibilidad de técnicas experimentales estandarizadas que no prometan resultados confiables en otras especies. Otro factor determinante es la acumulación de genomas completamente secuenciados y los avances en la genómica comparativa de los mismos (Engel SR, 2014). Esto permite el desarrollo de métodos de biología computacional tales como la comparación de proteínas o el estudio de redes genéticas involucradas en un proceso biológico de interés con el objetivo de establecer algoritmos lo suficientemente efectivos para extrapolar ese comportamiento en el contexto genético de otra especie (Alves R. et al, 2008). CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 7 4.2. Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo para el estudio de la biología mitocondrial La levadura S. cerevisiae ha demostrado ser un excelente organismo modelo para el estudio de funciones celulares básicas conservadas en las células eucariotas, debido a la facilidad de generar mutantes, alta eficiencia en procesos de ingeniería genética y bajo tiempo de duplicación (Altmann, et al, 2007). Dentro de todas las proteínas codificadas por el ADN mitocondrial, pocas son esenciales para la viabilidad celular. Dentro de estas se encuentran algunos factores esenciales para la importación y ensamblaje de proteínas nucleares, el clúster de hierro/azufre y genes asociados a la síntesis de mononucleótidos de flavina. El hecho de que se puedan estudiar diferentes funciones mitocondriales en mutantes KnockDown viables hace a la levadura un organismo ideal para disectar los procesos moleculares requeridos para la biogénesis de una mitocondria competente (Karathia et al., 2011). El genoma mitocondrial de S. cerevisiae se conforma por alrededor de 80,000 pares de bases y codifica al menos 8 proteínas esenciales para el proceso de fosforilación oxidativa. Estas proteínas son Cit b, Cox1, Cox2, Cox3, Atp6, Atp8, Atp9 y Var1. Dentro de este contexto se encuentran levaduras rho+, que se conocen por tener su genoma mitocondrial intacto, mientras que las rho- son aquellas que tienen ADN mitocondrial defectuoso, pero aún poseen y las rho0 son levaduras que carecen de ADN mitocondrial (Contamine & Picard, 2000). Las células rho0 son también conocidas como petite. En estas levaduras, al carecer de ADN mitocondrial, no ocurre el proceso de respiración oxidativa; Y por lo tanto su capacidad metabólica es muy reducida. Esto influye en el tamaño de las colonias que forman, por lo que estas tienden a ser pequeñas (Carnevalli et al. 1968). 4.3. Evento de duplicación genética y la divergencia funcional de genes Saccharomyces cerevisiae fue el primer organismo eucariota cuyo genoma fue completamente secuenciado. Los subsecuentes análisis genómicos revelaron la presencia de bloques de genes duplicados, indicando que esta levadura procede de un linaje cuyo genoma fue duplicado. Los eventos de duplicación genética son fenómenos frecuentes en la evolución, algunos hongos, plantas y vertebrados son descendientes de ancestros que sufrieron duplicación genética. Estos eventos de duplicación han sido asociados con la adquisición de nuevas características que se reflejan la riqueza de una especie (Van De Peer, 2017). Estudios recientes proponen que la conservación selectiva de genes duplicados en S. cerevisiae ha sido esencial para el desarrollo de un metabolismo fermentativo. Para evaluar esta hipótesis, se compararon las duplicaciones del genoma completo con las duplicaciones a pequeña escala, en términos de interacción genética, divergencia en expresión y cambios funcionales (Escalera-Fanjul, 2019). Este análisis permitió determinar genes duplicados del metabolismo central del carbón y transporte de hexosas, que enriquecen el genoma. Este efecto enriquecedor tiende a ser mayor en eventos de duplicación del genoma completo en comparación a duplicaciones de pequeña escala (Kuepfer et al, 2005) CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 8 4.4. Duplicación de genes y evolución de nuevas funciones El proceso de enriquecimiento está asociado principalmente a la subfuncionalización de parejas de genes parálogos, esta diversificación funcional afecta los roles de cada uno de los genes. Uno de los principales ejemplos de este fenómeno son los genes parálogos ENO1 y ENO2 codificantes de fosfopiruvato hidratasas que catalizan la conversión reversible de 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato (Escalera-Fanjul, 2019). En condiciones fermentativas ENO2 es predominante, mientras que en condiciones respiratorias ambas proteínas se encuentran presentes y contribuyen a la gluconeogénesis. Este estudio evidencia que genes parálogos productos de duplicación genética pueden tener una regulación de expresión diferente; así como cinética, especificidad a sustrato y afinidad únicas (Mcalister & Holland, 1982). Según Dariel Márquez (2015), los posibles destinos de los genes duplicados pueden ser Pérdida de función: luego de la redundancia genética una de las dos copias puede perder su función, esto puede ocurrir por la acumulación de mutaciones en la región promotora o en la región codificante. Estas mutaciones pueden generar una proteína con un sitio activo defectuoso, una proteína truncada o pérdida de afinidad a su sustrato. Subfuncionalización: durante el proceso de evolución de los bloques genéticos duplicados tiende a haber acumulación de mutaciones que eventualmente pueden generar la pérdida o ganancia de funciones. Esto puede generar que las copias de los genes puedan complementarse entre sí para cumplir la función del gen ancestral, de esta forma se conservan las dos copias del gen duplicado. Dosis génica: se denomina como incremento en la dosis génica cuando dos copias de un gen son retenidas sin acumular mutaciones suficientes para generar pérdida de función o subfuncionalización. Este fenómeno se asocia con el incremento de la robustez genética y el aumento de la expresión del gen. Neofuncionalización: es el proceso en el que las copias genéticas acumulan mutaciones que resultan en la adquisición de una nueva función, está siendo diferente a la del gen ancestral, lo cual resulta en una ventaja adaptativa. CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 9 Figura 4.2 El destino de los genes duplicados Nota. La duplicación genética conduce en una primera instancia a una redundancia genética, donde a partir de este se pueden generar distintos escenarios de modificación de la funcionalidad de un elemento genético. Las copias genéticas pueden perder fncionalidad, pueden subfuncionalizarse, incrementar la dosis génetica del elemento duplicado y desarrollar nuevas funciones (neofuncionalización). (Márquez, 2019). 4.5. El impacto de la duplicación genética en la evolución de las rutas metabólicas El genoma de la levadura Saccharomyces cerevisiae codifica a aproximadamente 1500 genes llamados “duplicados” que se presentan en el genoma en múltiples copias (Gu et al. 2003). Alrededor de 496 de estos genes con múltiples copias son producto del evento de duplicación genómica ancestral (Kellis et al. 2004). Se han realizado diferentes interpretaciones sobre el efecto de estos genes duplicados, una corriente popular es la asociación de los genes duplicados a la robustez de la red genética; se cree que estos genes duplicados pueden tener una función de respaldo cuando el gen principal sufre de alguna mutación que afecte de forma significativa su funcionalidad (Gu et al. 2003). La corriente de pensamiento más aceptada es la que sugiere que los genes duplicados adquieren o pierden funciones, este proceso es conocido como subfuncionalización. Este proceso permite regresar a un estado de única copia de gen y cada copia puede adquirir una especialización en función, expresión o localización (Kuepfer et al. 2005). Según Wolfe (2004), la duplicación genética incrementa el dosaje genético y sugiere que esto juega un rol central en la adaptación de S. cerevisiae a un metabolismo fermentativo que fue altamente seleccionado durante la domesticación de la levadura. CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 10 Figura 4.3 Compartimentación de genes duplicados de S. cerevisiae. Nota. En la figura se presenta forma en que se compartimentalizan los genes duplicados en el genoma de S. cerevisiae (Kuepfer et al. 2005) En el estudio realizado por Kuepfer et. al. (2005), se buscaba evaluar la hipótesis de que los genes duplicados incrementan la dosis genética y por lo tanto el flujo a través de las rutas metabólicas en las que estos genes duplicados participan. Según los estándares establecidos en el experimento se considera un incremento significativo en el flujo de una ruta metabólica cuando hay un incremento de al menos 5 % de consumo del metabolito inicial. Para esto se analizaron las rutas de carbono, en particular, las enzimas críticas de estas rutas metabólicas para evaluar el porcentaje en que se encuentran genes de una sola copia o genes duplicados, los genes analizados se enlistan en la primera columna de la figura 4.3. Asimismo, se indica si es una proteína con localización mitocondrial o en el citosol. Finalmente, en la última columna se indica si el gen tiene copias generadas en el evento de duplicación genética o si es de copia única. El análisis permitió determinar que las rutas de carbono central en S. cerevisiae se encuentran muy enriquecidas por genes duplicados (Figura 4). CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 11 Figura 4.4 Ocurrencia relativa de genes de una copia Nota. Descripción de la ocurrencia relativa de genes de una copia y genes duplicados en las rutas centrales de carbón (Kuepfer et al. 2005). En la (Figura 4.4) se presenta en porcentaje el total de genes esenciales duplicados (barra negra) y genes de una copia (barra gris) en las rutas centrales de carbono, se observa que, para las rutas del metabolismo de glucosa, galactosa y glicerol, aproximadamente el 50 % de los genes se encuentran duplicados. Mientras que, en la ruta del metabolismo de etanol, alrededor del 75 % de los genes se encuentran duplicados. Asimismo, se cuantificó el número de reacciones realizadas por enzimas provenientes de genes duplicados y que generan un incremento significativo en el flujo de la ruta metabólica. Figura 4.5 El efecto del dojase genético en reacciones altamente activas. Nota. Adaptado de Kuepfer et al. 2005. En la figura 4.5 se puede observar que se analizaron las 4 fuentes de carbono principales que utiliza S. cerevisiae, se determinó que cuando se utiliza glucosa galactosa, glicerol o etanol como fuente de carbono entre 30 y 48 genes duplicados participan en la ruta y generan un incremento significativo en el flujo de la ruta metabólica. Estas observaciones han permitido ampliar el entendimiento de la función de los genes duplica- dos, ahora se sabe que los genes duplicados principalmente tienden a subfuncionalizar tal y como se describió con los ejemplos de las isozimas ENO1 y ENO2. Y pueden afectar el dosaje genético generando que las enzimas críticas de diferentes rutas metabólicas incrementen de forma significativa el flujo neto de la ruta metabólica. Estos diferentes mecanismos ejemplifican el efecto de las duplicaciones genéticas en la evolución de las rutas metabólicas. Las enzimas aminotransferasas de alanina (ALTs) catalizan la transaminación reversible entre alanina y alfa-cetoglutarato para formar piruvato y glutamato. En S. cerevisiae el sistema de isozimas ALT es considerado la ruta metabólica principal para la biosíntesis y catabolismo de alanina. Durante CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 12 el crecimiento en condiciones de escasa glucosa, el catabolismo de alanina constituye la ruta clave para realizar la gluconeogénesis ya que el piruvato puede ser convertido muy fácilmente a oxalacetato a través de la actividad del piruvato carboxilasa (Peñaloza-Ruiz, et al. 2012). La ruta metabólica descrita se resume en la (Figura 4.6). Figura 4.6 Rutas metabólicas involucradas en el metabolismo de alanina en S. cerevisiae. Nota. Adaptado de Peñaloza-Ruiz et al. 2012. En el estudio realizado por Peñalosa-Ruiz, et al. (2012) se determinó que a pesar de que las enzimas Alt1 y Alt2 son productos del evento de duplicación genética y tienen una identidad aminoacídica del 65 %, únicamente Alt1 presenta actividad aminotransferasa, en contraste Alt2 se desconoce su función. Asimismo, se describió que la expresión de Alt1 y Alt2 es modulada por el factor de transcripción Nrg1 y la concentración intracelular de alanina. Se determinó que la expresión de ALT1 es inducida por alanina, lo que es congruente con su rol dentro del catabolismo de alanina. En cambio, la expresión de ALT2 es reprimida por la alanina indicando un rol principalmente biosintético. Márquez Gutiérrez (2015), con el propósito de describir la función de ALT1 y el fenotipo de las levaduras mutantes en alt1∆, realizó microscopía electrónica utilizando el marcador MitoTracker (Figura 4.7A). Se determinó que en la cepa mutante de alt1, la mitocondria se encuentra fisionada, pero esta conserva su potencial de membrana. Esto sugiere que la proteína Alt1 participa en un mecanismo en la preservación de la integridad del ADN mitocondrial. Se determinó la relación ADNmt/ADNn para evaluar daño al genoma mitocondrial (Figura 4.7B y 4.7C). Se determinó que en la mutante alt1∆, la concentración de ADN mitocondrial es menor, se desconoce el mecanismo por el cual ALT1 participa en el mantenimiento de la integridad del ADN mitocondrial, pero se sugiere que este proceso puede estar asociado a una función “Moonlight”. CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 13 Figura 4.7 La cepa mutante ALT1 muestra daño mitocondrial y disminución en la concentración de ADNmt. Nota. Adaptado de Márquez Gutiérrez, 2015. 4.6. Función Moonlight de Alt1 Según los resultados obtenidos en el laboratorio de la doctora Alicia González, se planteó la hipótesis de que la proteína Alt1 además de ser una enzima que cataliza la transaminación de alanina, esta puede poseer una función alterna de protección del ADN mitocondrial. La aconitasa es un ejemplo de una proteína que forma parte del ciclo de Krebs con y cumple una función Moonlight de protección de ADN mitocondrial. En la (Figura 4.8), se presenta un diagrama de función Moonlight de la aconitasa y representa la hipótesis que propone que la proteína Alt1 podría forma parte de la estructura de los nucleoides mitocondriales. CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 14 Figura 4.8 La función Moonlight de Alt1 Nota. Alt1 podría proveer un papel en la remodelación de lo nucleoides mitocondriales en S. cerevisiae. Figura adaptada de (Chen, 2005). Una perspectiva producto de la investigación realizada por Marquez et al. es demostrar que la proteína Alt1 es parte del complejo de remodelación de los nucleoides mitocondriales, esta hipótesis es congruente con la observación que en la mutante alt1∆, la integridad del ADN mitocondrial se ve comprometida y la mitocondria se fisiona. 4.7. Reguladores transcripcionales híbridos en S. cerevisiae La levadura Saccharomyces cerevisiae, es un modelo de estudio ampliamente utilizado para la descripción de las regulaciones transcripcionales en respuesta a estímulos como la limitación a nutrientes. Es bien descrito que la limitación a fuentes de nutrientes resulta en complejas adaptaciones fisiológicas en la levadura, las cuales se han descrito como programas transcripcionales (Hernández, et al., 2011). Los programas transcripcionales consisten en la activación o represión de un conjunto de genes, cuyos productos influyen en el establecimiento de una correcta respuesta fisiológica. Los cambios en el perfil de expresión dependen de factores de transcripción, estos se componen de un dominio de interacción al ADN y el dominio activador. El dominio de interacción el ADN es el que permite a la proteína interactuar con secuencias de ADN consenso (Tong Ihn Lee, et al., 2002). Uno de los complejos regulatorios más estudiados en S. cerevisiae es el complejo Hap. Este se compone de las subunidades Hap2, Hap3 y Hap5 que al interactuar forman el dominio de interacción con el ADN, mientras que la subunidad Hap4 es el dominio activador. En conjunto, forman el complejo Hap 2-3-4-5; el cual tiene un rol muy relevante en la regulación de la respiración celular, la producción de especies reactivas de oxígeno y la homeostasis del hierro intracelular (Mao & Chen, 2019). En la figura 4.9 se ejemplifica el proceso de formación del complejo Hap 2-3-4-5 en S. cerevisiae y su contraste con el regulador NF-YA-B-C humano. CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 15 Figura 4.9 Formación del complejo Hap2-3-4-5 Nota. En la figura se describe el proceso de formación del complejo Hap2-3-4-5 (Mao & Chen, 2019). Otro factor de transcripción ampliamente estudiado es Gln1-Gln3, este regulador transcripcional es relevante en el estudio de S. cerevisiae en fuentes pobres de nitrógeno como prolina. En estas condiciones este complejo participa en la activación de genes codificantes para enzimas involucradas en el catabolismo de las fuentes de nitrógeno pobres. En presencia de fuentes ricas de nitrógeno, la ruta de señalización TOR promueve la asociación de los factores de transcripción Gln3 y Gat1 con la proteína citoplasmática Ure2, promoviendo su retención en el citoplasma. Además, se ha observado que al transferir las levaduras a un medio pobre en nitrógeno se promueve la disociación de este complejo, esto permite la traslocación de Gln3 hacia el núcleo para ejercer su rol de activador transcripcional (Hernández et al. 2011). 4.8. Hap 2-3-5-Gln3, el primer regulador híbrido descrito En el laboratorio de la doctora Alicia González se describió por primera vez el modulador transcripcional híbrido Hap 2-3-5-Gln3. Este se caracteriza por el uso de las subunidades Hap2-3-5 que constituyen el dominio de interacción con el ADN y el dominio de activación Gln3. Asimismo, en el trabajo de Hernández et. al, se describe como este modulador híbrido activa la expresión de los genes GDH1 y ASN1 en condiciones pobres de nitrógeno. Además, se demuestra que los moduladores Hap 2-3-4-5 y Gln1-Gln3 por sí mismos no afectan en la expresión de dichos genes (Hernández et al. 2011). CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 16 4.9. Regulador negativo de los genes reprimidos por glucosa, Nrg1. En S. cerevisiae, la expresión de un gran conjunto de genes es reprimida durante el crecimiento en glucosa (Gancedo, 1992), este fenómeno se denomina represión catabólica por glucosa (Ronne, 1995). Los genes reprimibles por glucosa pueden ser divididos en tres grupos principales: 1. Genes encargados del metabolismo de otras fuentes de carbono. 2. Genes codificantes a enzimas específicas de la gluconeogénesis 3. Genes involucrados en el ciclo de Krebs y la respiración. El factor de transcripción Nrg1 es un represor inducido por glucosa que se caracteriza por tener estructura similar a dedos de zinc que interactúa con secuencias de ADN ricas en GC. Algunos genes regulados por este factor de transcripción son: GAL1, GAL4, SUC2, MAL; que participan en el catabolismo de galactosa, sucrosa y maltosa (Park et. al. 1999). La actividad de Nrg1 es regulada por su estado de fosforilación y su localización subcelular. En condiciones altas en glucosa, la proteína Nrg1 es hipofosforilada lo que le permite reprimir la transcripción. Por el contrario, en condiciones de baja concentración de glucosa, Nrg1 tiende a fosforilarse y a translocarse hacia el citoplasma. El estado de fosforilación de Nrg1 depende del complejo quinasa Snf1/Snf4, el cual pertenece a la familia altamente conservada de proteínas quinasas SNF1/AMPK que son requeridas en los procesos de homeostasis energética y adaptación al uso de fuentes de carbono no preferenciales como el etanol, sucrosa, maltosa y galactosa (Hedbacker, 2008). En la figura 4.10 se observa que Nrg1 se une a la secuencia del promotor UAS1-1 (Upstream Activating Sequence), de esta forma es posible reclutar los co-reguladores como Tup1 (Park et al. 1999). Figura 4.10 Represión por Nrg1 del gen STA1. Nota. La inhibición del gen STA1 mediada por Nrg1 implica el reclutamiento de proteínas remodeladoras como el complejo Ssn6-Tup1 y de represores como Sfl1 que en conjunto tienen un efecto desestabilizador de la transcripción. (Kim et al. 2004). CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 17 4.10. Regulador de la respuesta retrógrada, (Rtg3). S. cerevisiae puede monitorear y responder a cambios del estado mitocondrial mediante su inducción en la expresión de genes nucleares. Esta respuesta es mediada por la respuesta retrógrada (Rtg). Esta ruta de señalización tiene un rol homeostático y de respuesta a estrés que permite ajustar rutas biosintéticas y actividades metabólicas, cuando ocurre disfunción mitocondrial (Ruiz, 2012). Los elementos claves que permiten modular la expresión de genes nucleares son: Rtg1p - Rtg3p: factor de transcripción heterodimérico Rtg2p: proteína citoplasmática que funciona en la sensibilidad al nitrógeno y el catabolismo. Cuando la regulación retrógrada es inducida la proteína Rtg3p es parcialmente desfosforilada, lo que permite que Rtg1p – Rtg3p sea traslocada hacia el núcleo (Rothermel et al, 1997). En células respiratorias competentes, Rtg1 y Rtg3 se encuentra en su forma de factor de transcripción heterodimérico ubicado en el citoplasma. En contraste, las células con disfunción mitocondrial (por ejemplo, células sin ADN mitocondrial), el complejo se encuentra localizado predominantemente en el núcleo (Sekito et al, 2000). Figura 4.11 Regulación de la activación de la ruta retrógrada. Nota. Este mecanismo de activación depende de las proteínas Mks1, TORC1 y Bmh1/2. Estas regulan de manera negativa ya que impiden que Rtg2 lleve a cabo su función de fosfatasa sobre Rtg3, mientras que la proteína Grr1, regula de manera positiva la ruta, promoviendo la ubiquitinación de Mks1, y por extensión su degradación. (Liu et al. 2006). CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 18 4.11. Regulador transcripcional híbrido, ( Nrg1-Rtg3) Recientemente en el laboratorio de la doctora Alicia González se evaluó la expresión de los genes ALT1 y ALT2 en cepas mutantes nrg1∆, y rtg3∆. Se observó en un medio con fuente pobre de nitrógeno la expresión de ALT1 no es inducida, pero si la de ALT2. Por otra parte, cuando se suministra alanina al medio se induce la expresión de ALT1 y se reprime la de ALT2. Por otra parte, al realizarse el mismo experimento en cepas mutantes nrg1∆ y rtg3∆, se observa que no se reprime la expresión de ALT2 (Márquez Gutiérrez, 2015). Esto sugirió que la expresión de ALT2 requiere de ambas subunidades, este experimento fue un primer acercamiento para demostrar que Nrg1-Rtg3 forman un modulador híbrido (Figura 4.12). Figura 4.12 Análisis Northern blot de ARN Nota. En la figura se presenta el análisis del ARN obtenido de la cepa silvestre y cepas mutantes (Campero – Basaldua, 2023). Seguidamente, se demostró que Nrg1-Rtg3 son capaces de formar un complejo por medio de co-inmunoprecipitación. Este experimento se realizó utilizando dos fuentes de nitrógeno pobres y suplementando con diferentes concentraciones de alanina. En la Figura 4.13 se observa que, a mayor concentración de alanina, hay mayor formación de complejo; esto sugiere que la alanina es un coinductor del complejo Nrg1-Rtg3 (Carretero, 2023). Figura 4.13 Co-inmunoprecipitación del complejo Nrg1-Rtg3 Nota. La condición de crecimiento fue en medio con Prolina y GABA (Figura adaptada de (Campero – Basaldua, 2023)) CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 19 4.12. Análisis de la red genética regulada por el regulador híbrido Nrg1-Rtg3 Carretero (2023), demotró que la formación del modulador híbrido Nrg1-Rtg3 y el rol de la alanina en la formación del complejo, se realizó un análisis por secuenciación de ARN para determinar los genes que se regulan por el complejo híbrido Nrg1-Rtg3. Esta técnica permitió identificar al grupo de genes que constituyen el circuito regulado de manera negativa por el complejo El análisis permitió identificar grupos de genes regulados por el complejo, dentro de estos destacan: Procesos de óxido – reducción. Metabolismo de ácidos carboxílicos. Transporte de metales de transición. El análisis bioinformático reveló que estas categorías de genes son las más relevantes, ya que, dentro de la red de genes controlada por el modulador híbrido, estos son los más representados. En las (Figuras 4.14 – 4.16) se presentan los mapas de calor de los grupos destacados que son regulados por el modulador híbrido. Figura 4.14 Mapa de calor de los genes involucrados en el transporte de metales de transición Nota. Adaptado de Carretero, 2023. CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 20 Figura 4.15 Mapa de calor de los genes involucrados en el proceso de óxido – reducción. Nota. Adaptado de Carretero, 2023. Figura 4.16 Mapa de calor de los genes involucrados en el metabolismo de ácidos carboxílicos. Nota. Adaptado de Carretero, 2023. CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 21 4.13. Cepas mutantes nrg1∆ y rtg3∆, su relación con el fenómeno petite y perspectivas de trabajo. Durante el estudio de las mutantes Nrg1-Rtg3, se determinó que, en ausencia de cualquier elemento del modulador transcripcional híbrido, estas se vuelven petite. Esto implica que el modulador transcripcional híbrido es clave en el mantenimiento de la integridad del ADN mitocondrial. Y en ausencia de este, las mitocondrias tienden a perder su ADN y a fisionarse; esto fue demostrado en el trabajo de Campero-Basaldua et al. (2023). En los incisos a y b de la (Figura 4.17) se puede observar la determinación de la relación ADN mitocondrial/ ADN nuclear, estos resultados demuestran que las mutantes nrg1∆ y rtg3∆ carecen de ADN mitocondrial. Además, en el inciso c se observa que en una cepa WT las mitocondrias tienen su estructura nativa en forma de redes que se extienden por toda la célula y tienen un tamaño normal. Mientras que, en las mutantes, la mitocondria se fisiona y las colonias son de menor tamaño. Estos resultados demuestran que el regulador híbrido tiene un rol clave en la homeostasis mitocondrial. Figura 4.17 Microscopía electrónica de S. cerevisiae. Nota. En la figura se presenta la microscopía electronica de S. cerevisiae WT y Nrg1-Rtg3 mutante. Figura adaptada de (Campero-Basaldua, 2023). 4.14. Estrés oxidativo El oxígeno es una molécula altamente reactiva que puede ser parcialmente reducida para formar diferentes agentes reactivos conocidos como especies reactivas de oxígeno (ROS). Estas especies reactivas tienen un alto potencial para dañar constituyentes celulares incluyendo: ADN, lípidos y proteínas (Desikan et al. 2007). Las especies reactivas de oxígeno normalmente son generadas por medio de una reducción secuencial del oxígeno molecular (Desikan et al. 2007). Cuando el oxígeno molecular es parcialmente CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 22 reducido se forma el ion superóxido que con la adición de un átomo de hidrógeno tiende a formar el radical perhidroxilo con un gran potencial de reacción. Por otra parte, cuando el radical superóxido reacciona con hidrógeno molecular y se reduce, se forma peróxido de hidrógeno (Pineda et al. 2008). El peróxido de hidrógeno puede someterse a la reacción de Fenton con iones ferrosos para formar el radical hidroxilo, este radical es el más reactivo de todas las especies reactivas de oxígeno. Este tiende a generar una serie de reacciones en cadena que incrementa rápidamente el estado oxidativo intracelular (Pineda et al. 2008). En la (Figura 4.18) se puede observar la serie de reacciones productoras de especies reactivas del oxígeno. Figura 4.18 Química de las especies reactivas de oxígeno. Nota. Adaptado de Desikan et al. 2007. 4.15. Principales orígenes de las especies reactivas del oxígeno Las especies reactivas de oxígeno puede ser producidas endógenamente por medio de procesos metabólicos, el proceso metabólico que produce la mayor cantidad de ROS es la cadena transportadora de electrones. Este proceso se da principalmente en el complejo I y III de la cadena oxidativa; el complejo al realizar la oxidación de NADH a NAD+ para transportar protones al espacio intermembranal, puede producir radicales superóxidos debido al potencial redox de la reacción. Por otra parte, el complejo III es el otro gran productor de ROS, al participar el citocromo oxidasa se genera un alto potencial redox que produce radicales superóxidos, este proceso se resume en la (Figura 4.19). La identificación de que la cadena transportadora de electrones es uno de los productores endógenos de ROS más importantes, derivó el planteamiento de la paradoja del oxígeno. Esta establece que necesitamos oxígeno para existir, pero durante la serie de reacciones requeridas para la producción de ATP hay una alta probabilidad de liberación de ROS al medio, lo que se asocia con el envejecimiento (Hagen et al. 1995). CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 23 Figura 4.19 La paradoja del oxígeno Nota. Adaptado de Mani, 2015. 4.16. Sistemas de defensa ante estrés oxidativo Las células poseen sistemas de defensa tanto enzimáticos como no enzimáticos para defender los constituyentes celulares y para mantener el estado redox. El principal mecanismo de defensa no enzimático es el glutatión (GSH), este es un tripéptido que consiste en tres aminoácidos: glutamato, cisteína y glicina. Esta molécula actúa como un buscador de radicales, su grupo sulfidril tiene la capacidad de reaccionar con moléculas oxidantes para producir glutatión reducido (Xiangyang et al. 2016). El glutatión es la molécula antioxidante más abundante en las células, consecuentemente su rol en el mantenimiento del estado redox es muy importante. En S. cerevisiae los genes involucrados en la biosíntesis de GSH son: GSH1 y GHS2, se ha observado que en mutantes KnockDown de estos genes son deficientes para glutatión y presentan hipersensibilidad a peróxido de hidrógeno (Xiangyang et al. 2016). La principal limitante del mecanismo del glutatión para el control del estrés oxidativo es el NADPH, ya que la reacción de reducción utiliza como cofactor a esta molécula. La producción endógena de NADPH depende principalmente del GABA shunt. El GABA shunt es una ruta alterna al ciclo de Krebs, este mecanismo consiste en la utilización de alfa-cetoglutarato para la producción de GABA. Asimismo, la ruta metabólica convierte el GABA en succinato lo que permite la reintegración al ciclo de Krebs (Peng et al. 2016). La reacción que convierte el semialdehído succínico en succinato para la reintegración al ciclo de Krebs es la más relevante en el contexto del estrés oxidativo ya que la enzima semialdehído succínico deshidrogenasa utiliza como cofactor NAD+ y produce NADH y succinato. Esto resalta la relevancia del mantenimiento de los procesos mitocondriales, ya que la pérdida de la función mitocondrial indirectamente resulta en la pérdida de mecanismos de defensa ante el estrés oxidativo (Peng et al. 2016). A nivel mitocondrial un mecanismo de defensa enzimático es la actividad de la enzima superóxido dismutasa (Sod2p), esta cumple un rol muy importante en la protección de la oxidación del ADN mitocondrial por parte de ROS. Esta enzima cataliza la conversión del radical superóxido en peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular. Esta es una de las reacciones más rápidas catalizadas por una enzima, esto permite una rápida y eficaz respuesta a los cambios en el equilibrio oxidante del ambiente mitocondrial (García et al. 1995). CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 24 4.17. Daño por estrés oxidativo A pesar de que el daño molecular inducido por concentraciones subletales de especies reactivas de oxígeno no ha sido completamente estudiado, se ha determinado que los principales efectos son la oxidación de las proteínas y la peroxidación de lípidos. El incremento en la concentración de peróxido de hidrógeno disminuye la relación GSH/GSSG, lo que significa que el mecanismo principal de antioxidantes se ve afectado (Izawa, S. et al., 1995). Esto también genera que los niveles de proteínas con puentes disulfuro y tioles incremente (Jamieson, D. J. 1998). Además, el peróxido de hidrógeno oxida los residuos de metionina a metionina sulfóxido, este grupo químico tiende a desestabilizar a las proteínas generando proteólisis. Esto resulta en la liberación de sulfoxidos de metionina libres en el medio, incrementando aún más el estado oxidativo intracelular (Morano, K.A., Grant, C.M., 2012). El ADN mitocondrial también es objeto de daño oxidativo tras la exposición a peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilos generados por la reacción de Fenton. Se ha observado que el incremento leve de ROS mitocondriales tiende a generar mutaciones, la acumulación de estas mutaciones puede generar disfunción mitocondrial. Pero el incremento significativo de ROS en la mitocondria tiende a generar el fenotipo petite que se caracteriza por carencia de ADN mitocondrial (Moradas-Ferreira et al, 2000) (Contamine. et al. 2000) (Yazgan, et al. 2012). Finalmente, las ROS también tienen la capacidad de reaccionar con lípidos por medio de la reacción de lipoperoxidación. En este caso, el radical hidroxilo reacciona con los lípidos insaturados de la membrana formando lípido peróxido, la acumulación de lípidos peróxidos en la membrana tiende a disminuir la estabilidad de la membrana, en la figura 4.20 se puede observar la serie de reacciones que conforman la lipoperoxidación. Considerando que este mecanismo, tiende a propagarse; el incremento de ROS intracelulares puede generar una cascada de reacciones que terminen destruyendo la integridad de la membrana celular o en el caso de estrés oxidativo mitocondrial, se puede generar fisión mitocondrial (Robles et al, 2013). Figura 4.20 Mecanismo de lipoperoxidación Nota. Adaptado de Marnett, 1999. CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 25 4.18. Metabolismo del hierro y su relación con el estrés oxidativo El hierro es una molécula con un gran potencial oxidativo, por lo que a nivel celular existen diferentes mecanismos de transporte, almacenamiento y transformación a formas no reactivas que cumplen un rol fisiológico. Siendo un ejemplo de ello la biogénesis de proteínas con centro Hierro- Azufre en S. cerevisiae (Schilke, B. et al, 1999). Esta ocurre principalmente en la mitocondria, se encarga de la incorporación del hierro y azufre libres a proteínas como grupos prostéticos. Cuando los átomos de azufre y hierro se encuentran en coordinación con una proteína, reducen su potencial oxidativo hacia las moléculas del medio. Pero está bien descrito que el hierro puede ser liberado de los centros Hierro-azufre por el estrés oxidativo generado por las especies reactivas de oxígeno, lo que puede causar en la acumulación de hierro en las mitocondrias (Gomez et al, 2014) Asimismo, se a descrito que la funcionalidad del citocromo b se ve afectada debido a que es una enzima con grupo prostéticos heme y el hierro libre tiende a disrumpir la estabilidad de las proteínas con estos grupos prostético. Adicionalmente, se ha reportado que el superóxido dismutasa mitocondrial puede ser saturada con hierro en vez de manganeso cuando la homeostasis de hierro se ve interrumpida. Por lo que la inactivación del superóxido dismutasa derivada del incremento intramitocondrial de hierro libre puede resultar en un factor importante en la acumulación de ROS (Moradas-Ferreira, et al, 2000). El modelo de generación mitocondrial de especies reactivas de oxígeno dependiente de la concentración de hierro libre intramitocondrial (Figura 4.21) propuesto por Campos-García et al. (2014), establece que un incremento en la concentración de iones Fe+2 en el interior de la mitocondria, tiende a generar especies reactivas de oxígeno por medio de la reacción de Fenton. Este primer evento genera una cadena de reacciones en las que los ROS reaccionan con proteínas con centros de hierro- azufre y generan la libración de más iones de Fe+2. Además, estas tienden a afectar la estabilidad del complejo III de la cadena transportadora de electrones, estas tienden a dimerizarse y formar el supercomplejo III/IV. Cuando se forma el supercomplejo, se interrumpe la funcionalidad de la cadena transportadora de electrones y este se convierte en un generador de especies reactivas de oxígeno. CAPÍTULO 4. MARCO TEÓRICO 26 Figura 4.21 Modelo de generación mitocondrial de especies reactivas de oxígeno Nota. Dependiente de la concentración de hierro libre intramitocondrial (Campos-García, et al. 2014). 4.19. Técnicas para el estudio del daño mitocondrial Una de las estrategias más comunes para el análisis del daño mitocondrial es la secuenciación de ARN, este ensayo permite determinar que genes se están expresando en alguna condición que genere daño mitocondrial o en alguna cepa que presente el daño mitocondrial de forma constitutiva (Lasserre, 2015). Este ensayo tiene la ventaja que permite identificar las redes genéticas asociadas al fenómeno y evaluar si estos genes se están reprimiendo o sobreexpresando en la condición. La microscopía de fluorescencia es una estrategia muy relevante ya que permite observar la estructura de la mitocondria durante el daño. Generalmente se utiliza el marcador fluorescente MitoTracker el cual tiende a acumularse en las mitocondrias activas debido a su potencial de membrana (Garipler, G. 2014). Esta estrategia tiende a utilizarse para comprender cuando el daño mitocondrial generado genera fisión al organelo o cuando se pierde el potencial de membrana mitocondrial debido a la perdida de la función respiratoria. La medición de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), para este ensayo se utiliza MitoSOX las cuales son sondas fluorescentes que detectan específicamente las especies reactivas de oxígeno dentro de las mitocondrias. Generalmente, el análisis con MitoSOX se complementa con la medición de la respiración celular por medio de respirometría de alta resolución (Kener, K. B. 2018). Para esto se utiliza el Oxygraph, el cual se utiliza para medir el consumo de oxígeno y evaluar la función mitocondrial. CAPÍTULO 5 Metodología 5.1. Diseño, enfoque y tipo de investigación El diseño experimental de la presente investigación es de carácter puro enfocado en el diseño e implementación de un protocolo para la manipulación genética y molecular de células de la levadura Saccharomyces cerevisiae. 5.2. Población y muestra Las células con las que se trabajó el presente proyecto corresponden a células de levadura Saccharomyces cerevisiae que se mantienen crío conservadas a -70℃ en el laboratorio 301-Ote de la Doctora Alicia González Manjarrez del Instituto de Fisiología Celular UNAM. Los plásmidos manipulados se mantuvieron en el área común de “Banco de plásmidos” del laboratorio y los oligos se solicitaron a la Unidad de Biología Molecular (UBM) del mismo instituto. 26 CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 27 5.3. Variables Tabla 5.1 Variables de la investigación Variables Definición Tipo Unidades de medición Producto de PCR punto final Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), cuyo principal objetivo es enriquecer copias de algún gen específico a partir de un ADN in vitro. Cuantitativa y Cualitativa ng / µ L Medio de cultivo Conjunto de nutrientes necesarios para fomentar el crecimiento y desarrollo de microrganismos Cuantitativa y Cualitativa OD600nm Expresión Emisión de fluorescencia, observada mediante un termociclador en tiempo real, resultado de la excitación de un fluoróforo contenido en una reacción de PCR Cuantitativa Veces de cabio expresado como 2−∆∆Ct 5.4. Hipótesis 5.4.1. Hipótesis nula La sustitución del promotor endógeno del gen FRE5 por el promotor fuerte bacteriano TetO7 por medio de recombinación homóloga, permitirá la sobreexpresión del gen FRE5 en S. cerevisiae. 5.4.2. Hipótesis alternativa La sustitución del promotor endógeno del gen FRE5 por el promotor fuerte bacteriano TetO7 por medio de recombinación homóloga, no permitirá la sobreexpresión del gen FRE5 en S. cerevisiae. 5.5. Cepas Las cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas para la generación de una mutante sobreexpresante del gen FRE5 y la cepa de Escherichia coli utilizada para la generación del plásmido pCM325 se listan en la tabla 5.2. CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 28 Tabla 5.2 Cepas empleadas en el estudio Cepa Genotipo Fuente R1158 Silves- tre (WT) R1158 ura3-, leu2-, met15- R1158 (CTM -URA3 TA-Tet07) Peñalosa 2012 et. al. PTetO7FRE5 R1158 ura3-, PTetO7FRE5, TA-Tet07). leu2-, (CTM met15-, -URA3 Este estudio DH5α θ80lacZδM15 δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) gal- phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 Thermo 2020 Scientific, La cepa R1158, es un fondo de Saccharomyces cerevisiae cuya principal característica es que tiene integrado en su genoma por medio de recombinación homóloga, la secuencia que contiene el gen de URA3, con su respectivo promotor-terminador y la secuencia del trans activador de Tet07, mismo que será usado como blanco para modular la expresión con tetraciclina. La cepa DH5α es un fondo de Escherichia coli que se caracteriza por tener el marcador λ80dlacZδM15 que proporciona α- complementación del gen β-galactosidasa a partir de pUC o vectores similares para permitir la detección de colonias azules/blancas en placas de agar bacteriano que contengan Bluo-Gal o X- Gall. 5.6. Plásmido pCM325 El plásmido pCM325 se caracteriza por tener un origen de replicación bacteriano, así como un gen de resistencia a ampicilina, estos elementos permiten que este plásmido pueda ser transformado a una cepa bacteriana como E. coli DH5α para replicar el plásmido. Además, posee un origen de replicación eucariota y un gen de resistencia al antibiótico G418 (Geneticina). Como se presenta en la (Figura 5.1), el gen de resistencia a G418 se encuentra adyacente al promotor fuerte TetO7, por lo que el módulo de recombinación debe contener tanto al promotor fuerte TetO7 como al gen de resistencia KanR, para poder seleccionar las cepas transformantes luego de la recombinación. CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 29 Figura 5.1 Mapa del plásmido pCM325 Nota. Elaboración propia 5.7. Diseño de oligos para producción de módulo recombinante a partir del plásmido pCM325 La estrategia de transformación fue diseñada utilizando el Software ApE (Davis, 2022). Consiste en la sustitución del promotor endógeno del gen FRE5 por un promotor fuerte-inducible TetO7 es inducible por tetraciclina que se encuentra en el plásmido pCM325 (Figura 5.1, Anexo 3), esta sustitución, permitirá que se sobreexprese el gen endógeno de interés. El módulo de recombinación que contiene al promotor fuerte TetO7 y el gen de resistencia a Geneticina, se encuentra en el plásmido pCM325. Por lo que a partir de la secuencia del plásmido (Anexo No. 1) se seleccionaron 20 pares de bases rio arriba al módulo de interés como Primer Forward y 20 pares de bases rio abajo para el Primer Reverse. Se utilizó el Software OligoAnalyzer (Owczarzt et. al., 2008) para evaluar el potencial de formación de estructuras secundarias, así como la temperatura de anillamiento y %GC. Los oligonucleótidos diseñados para la amplificación del módulo de recombinación se presentan en la tabla 5.3, los sitios de unión de los primers se representan en la figura 5.2. Tabla 5.3 Variables de la investigación Nombre Secuencia 5´3´ Primer forward (módulo de recombinación) CGTACGCTGCAGGTCGACGG Primer reverse (módulo de recombinación) CATAGGCCACTAGTGGATCTG CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 30 Figura 5.2 Esquema ilustrativo que muestra los sitios de unión de los oligos para plásmido pCM325 Nota. Elaboración propia 5.8. Diseño de secuencias de recombinación para integración del módulo recombinante en el genoma de S. cerevisiae Para identificar en qué cromosoma se encontraba la secuencia codificante del gen FRE5 se consultó YeastGenome.org; esta base de datos recopila toda la información de genoma secuenciado de S. cerevisiae. Luego de identificar el cromosoma que contiene el gen de interés, de NCBI, se obtuvo la secuencia codificante del gen FRE5 con código de referencia: NC_001147.6 y se identificó la secuencia promotora del gen FRE5 de S. cerevisiae a partir de la secuencia del cromosoma XV con código de referencia: NC_001147.6. Se identificó la secuencia codificante del siguiente gen en el cromosoma utilizando el visualizador de secuencias de NCBI, se determinó que el gen rio arriba al gen FRE5 se encuentra separado por al menos 509 pares de bases. Por lo que la secuencia de recombinación que anida con la región no codificante 5´del gen FRE5 debe encontrarse a no más de 450 pares de bases del gen FRE5. Para el diseño de las secuencias de recombinación se utilizaron 50 pares de bases de la secuencia codificante del gen de interés como oligo reverso y 50 pares de bases de la región no codificante (UTR5´) del gen FRE5 UTR5´. Los oligos utilizados para producción de los módulos de recombinación son el resultado de la unión de los oligos de la tabla 5.5 que están dirigidos al plásmido pCM325 con las secuencias de recombinación. Se utilizó el Software OligoAnalyzer (Owczarzt et. al., 2008) para evaluar el potencial de formación de estructuras secundarias, así como la temperatura de anillamiento y %GC. En la ( Figura 5.3). se presenta la estrategia experimental para la sustitución de promotores. CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 31 Figura 5.3 Estrategia experimental para la sustitución de promotores Nota. A) Se observa el plásmido pCM325, el oligo Pf que corresponde a Fw Ptet-FRE5 y el Pr corresponde a Rv Ptet-FRE5, la secuencia de estos se presenta en la tabla 5.5. B) Representación gráfica del módulo de recombinación producto de la reacción de PCR representada en el inciso A). C) Diagrama de los sitios de recombinación homóloga entre el genoma de S. cerevisiae y el módulo de recombinación. D) Integración del módulo de recombinación al genoma de S. cerevisiae. 5.9. Diseño de oligos para confirmación de la integración del módulo recombinante al genoma de S. cerevisiae. Se diseñaron 4 oligos para la confirmación de la integración del cassette de sobreexpresión. Para esto se seleccionaron 20 pares en el UTR 5´ como oligo Fw., 20 pares de bases en el UTR 3´ como oligo Rv., y 20 pares bases en sentido Fw y el mismo en sentido Rv sobre la intersección entre el módulo de recombinación y la región codificante del gen FRE5. Los oligonucleótidos diseñados para la producción del módulo, recombinación del módulo y confirmación de la transformación se presentan en la tabla 5.5. En la (Figura 5.4). se presenta una representación gráfica del diseño de los oligos y sus sitios de recombinación y en la ( Tabla 5.4) se muestra el tamaño esperado de la banda. CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 32 Figura 5.4 Sitios de amplificación PCR de confirmación. Nota. P1, P2, P3 Y P4, representan el oligo en la posición donde alineara al momento de comprobar la cepa sobre expresada. Los oligos utilizados en esta reacción se presentan en la table 5.5; P1 corresponde a Fw UTR 5´ FRE5, P2 a Rv UTR 3´FRE5, P3 a Fw OPtet-FRE5 y P4 a Rv OPtet- FRE5. Tabla 5.4 Oligos diseñados y pareados que se usarán en la comprobación de la cepa sobre expresada. Oligos Nombre de banda Tamaño esperado Fw UTR 5´ FRE5 - Rv UTR 3´FRE5 5´-3´ mutante 4806 Fw UTR 5´ FRE5 - Rv UTR 3´FRE5 5´- 3´ WT 2804 Fw UTR 5´ FRE5 – Rv OPtet-FRE5 5´- KanConf Rv 441 Fw OPTetO7-FRE5 – Rv UTR 3´FRE5 KanConf Fw – 3´ 3842 Tabla 5.5 Oligonucleótidos usados para realizar el cambio de promotor del gen FRE5. Nombre Secuencia Tm °C %GC Fw PTetO7- FRE5 TTCCTTCACATACATCAAAAAATATGGGATAGCGGGGTGCGGAACAAACA CGTACGCTGCAGGTCGACGG 87.7 50 Rv PTetO7- FRE5 GAACCTGGTGCCAAATACACCAACAGCAGCACTAATCTAGCGAAAAGCAT CATAGGCCACTAGTGGATCTG 87.0 48 Fw UTR 5´ FRE5 CAGATAGAACCAAAGCGGAAG 59.5 48 Rv UTR 3´ FRE5 TAACAGTAAGGGTGAGGTGT 56.4 45 Fw OPTetO7- FRE5 GTGGCCTATGATGCTTTTCG 58.4 50 Rv OPTetO7- FRE5 CGAAAAGCATCATAGGCCAC 58.4 50 CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 33 5.10. Medio de cultivo para S. cerevisiae y comprobación de fenotipo petite Para el estudio del fenotipo de las cepas de S. cerevisiae utilizadas en este estudio, se partió de un pre- inóculo en medio rico con extracto de levadura 1 %, peptona de caseína 2 % y glucosa 2 % (YPD). Posteriormente, las cepas fueron cultivas es medio mínimo (MM) el cual contiene sales 1X, trazas 1X y vitaminas 1X, como fuente de carbono se utilizó glucosa al 2 % o etanol al 2 % (el etanol se agregó al medio previo a inocular con la cepa para reducir el efecto de evaporación de la fuente de carbono) y como fuente de nitrógeno se utilizó sulfato de amonio 40mM. Para compensar las auxotrofías de la cepa R1158 se utilizó histidina 100 mg/L, metionina 100 mg/L y leucina 100 mg/L. Para el caso de la cepa cuya transformación genera una resistencia a Geneticina, se prepararon los medios selectivos con geneticina G418 a una concentración final de 200 mg/L. Para realizar una evaluación rápida y cualitativa del fenotipo de las cepas, se realiza inoculación por goteo de las cepas a evaluar en placas con medo mínimo con etanol con una incubación de 48 horas. Mientras que para la obtención de la cinética de crecimiento se inocularon tres réplicas biológicas en medio mínimo con fuente de carbono dextrosa o etanol. La densidad óptica inicial de las curvas de crecimiento fue de OD600nm de 0.05 en todos los casos; se evaluó el cambio en la densidad óptica del cultivo a OD600nm cada 2 horas cuando la fuente de carbono fue dextrosa y cada 3 horas omitiendo las primeras 16 horas cuando la fuente de carbono fue etanol. Se tomaron lecturas hasta la fase estacionaria, utilizando los puntos se determinó la velocidad especifica de crecimiento y el tiempo de duplicación de las cepas. 5.11. Medio de cultivo de E. coli para producir plásmido pCM325 Para el cultivo de E. coli DH5α se utilizó medio LB. Para preparar un litro de medio se requiere: 5 g de extracto de levadura, 10 g de peptona, 10 g de NaCl, y 12 g de agar. Estos componentes son homogenizados y aforados en 1 L de agua destilada. Y colocados en la autoclave para su esterilización. En el caso de la preparación de medio selectivo para E. coli se utilizó la misma receta de medio LB y se suplementó con 1 mL de Ampicilina para tener una concentración final de antibiótico de 100 mg/L. El medio de cultivo de E. coli DH5α se utilizó para el crecimiento de la cepa transformada con el plásmido pCM325 para la posterior extracción del plásmido. 5.12. Transformación por choque térmico de bacterias calciocompetentes La transformación de las bacterias calciocompetentes se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos usados en el laboratorio. Se utilizó un stock de bacterias calciocompetentes DH5α previamente preparadas para hacerlas quimio competentes y 500 ng del plásmido pCM325. Se colocó 500 ng del plásmido en el stock de células calciocompetentes a transformar y se homogenizó mediante pipeteo. La mezcla fue incubada en hielo durante 30 minutos, después fueron sometidos a un choque térmico a 42 °C durante 2 minutos y reposada en hielo durante al menos 2 minutos. Seguidamente, se agregó 800 µL de medio LB para promover la recuperación celular y se incubaron a 37 °C por 2 horas a 300 rpm. Transcurrido el tiempo, se recuperaron las células por centrifugación a temperatura ambiente por 1 minuto a 3500 rpm, el sobrenadante fue descartado y las células fueron resuspendidas en el remanente del tubo. Como control negativo de no resistencia al antibiótico se plaqueó las células calciocompetentes DH5α sin plásmido en placa LB con ampicilina. Como control positivo de viabilidad se plaqueó CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 34 células calciocompetentes DH5α sin plásmido en placa LB sin ampicilina. Finalmente, se plaqueo las bacterias en las concentraciones: 100 y 10−1; en medio selectivo LB con ampicilina. Las placas fueron incubadas a 37 °C durante 24 horas y se realizó un re-cultivo de las colonias aisladas, para purificar las cepas transformantes. 5.13. Purificación de plásmido pCM325 Con el objetivo de obtener una solución pura del plásmido pCM325 para utilizarse como molde en las reacciones de PCR para la producción del módulo recombinante. La purificación del plásmido pCM325 se realizó de acuerdo con el protocolo de QIAprep Miniprep Handbook (2005). Se inoculó 10 mL de medio LB y Ampicilina con bacterias calciocompetentes DH5α seleccionadas por su resistencia a ampicilina y se incubaron durante 16 horas a 37 °C y con 250 rpm de agitación. Las bacterias fueron recolectadas mediante centrifugación a 8000 rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se resuspendió el paquete celular de bacterias utilizando 250 µL de buffer P1 y fue transferido a un tubo de microcentrífuga. Se agregó 250 µL del buffer P2 y se mezcló el contenido del tubo por inversión. Luego, se agregó 350 µL del buffer N3 y se mezcló el contenido por inversión. La mezcla fue centrifugada por 10 minutos a 13,000 rpm a temperatura ambiente, 800 µL del sobrenadante fue transferido a una columna y se centrifugó a 13,000 rpm, el remanente fue descartado. La columna fue sometida a dos lavados independientes utilizando el buffer PE y buffer PB. Se agregó 500 µL de cada buffer, se dejó incubar durante 1 minuto y se centrifugó a 13,000 rpm por un minuto. El residual nuevamente fue descartado y la columna fue sometida a una centrifugación final a 13,000 rpm durante 1 minuto. Para la elusión del ADN, se adicionó 50 µL de agua a 30 °C, se incubó durante 5 minutos para garantizar el mayor rendimiento y se centrifugó a 13,000 rpm durante 1 minuto. 5.14. Comprobación de la purificación del plásmido pCM325 Con el objetivo de comprobar si el plásmido purificado mediante el protocolo de purificación es pCM325 Se comprobó la identidad del plásmido por medio de su linealización utilizando la enzima de restricción SalI según el protocolo de Thermo Scientific (2012). Se utilizó suficiente volumen de ADN para que la concentración de ADN fuera de 1 µg/µL en un volumen final de 20 µL. Se agregó 2 µL de Buffer O 10X, 1 µL de SalI y se aforó a 20 µL con agua libre de nucleasas. Se homogenizó la mezcla mediante agitación y se incubó a 37 °C por 30 minutos. Se visualizó el producto digerido por medio de electroforesis de ADN y por el peso de la banda se determinó que el peso del plásmido purificado correspondía al plásmido pCM325. Se cuantificó el plásmido purificado utilizando el equipo NanoDrop. 5.15. Purificación de plásmido pCM325 a partir de banda de gel. Utilizando una navaja se cortó la anda de ADN de interés del gel de agarosa, se pesó el trozo de gel y por cada 100 mg de gel se adicionaron 100 µL de buffer QG en un tubo eppendorf de 2 mL. El tubo fue incubado a 50 °C durante 10 minutos, hasta observar que el gel estuviera completamente disuelto en el buffer. Seguidamente, se agregó el mismo volumen de isopropanol que de buffer QG. La solución fue trasladada a una columna QIAquick y se centrifugó a 10,000 rpm durante 1 minuto, el remanente fue descartado. Para lavar la columna, se añadió 0.75 mL de buffer PE a la columna CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 35 QIAquick y se centrifugó a 10,000 rpm durante 1 minuto. Se descartó el remanente y se centrifugó nuevamente la columna a 13,000 rpm durante 1 minuto. Para eluir el ADN, se colocó la columna en un eppendorf de 2 mL nuevo y se añadió 50 mL de buffer EB, la muestra fue centrifugada a 13,000 rpm durante 1 minuto. La concentración de ADN se determinó utilizando el equipo NanoDrop. 5.16. Optimización de la producción de módulos de recombinación La reacción de PCR para la amplificación de la región de interés del plásmido pCM325 fue realizada adaptando el protocolo de (PCRBiosistems, 2018). Para la desnaturalización inicial se utilizó la temperatura y tiempo estándar. Para optimizar las condiciones de la reacción en los ciclos de amplificación se realizó un gradiente de temperatura variando la temperatura de alineamiento en saltos de 0.5 °C. Para la elongación se utilizó la temperatura estándar y 3 minutos de duración dado que la velocidad de síntesis de la polimerasa es 1000 pb/min y el producto de la reacción es de 2332 pb. Se utilizó las muestras de plásmido pCM325 purificado como molde para las reacciones de PCR, los oligonucleótidos empleados en la reacción se encuentran en el cuadro No. 5. El Mix de reacción utilizado fue el que se describe en la (Tabla 5.6) y en la (Tabla 5.7) se describen los parámetros de la reacción. Tabla 5.6 Preparación del mix de reacción gradiente de temperatura Reactivo 50 µL reacción Concentración final 5x PCRBIO buffer 10.0 µL 1x Primer forward (10 µM) 2.0 µL 400 nM Primer reverse (10 µM) 2.0 µL 400 nM DNA pCM325 x µL Variable PCRBIO HiFi Pol (2u/| µL) 0.5 µL H2O grado PCR Aforar a 50 µL Tabla 5.7 Condiciones de amplificación en el termociclador. Ciclos Temperatura Tiempo Paso 1 95 °C 1 minutos Desnaturalización inicial 30 95 °C 30 segundos Desnaturalización 30 60.0 °C – 76.0°C (8 pasos) 1 minuto Alineamiento 30 72 °C 3 minutos Elongación 1 72 °C 3 minutos Elongación final CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 36 Los productos de PCR fueron visualizados mediante electroforesis de ADN y se confirmó el producto por el peso de la banda. El módulo de recombinación tiene una longitud de 2332 pb, mediante la comparación de la banda con la escalera molecular 1kb plus de Invitrogen, se confirmó la identidad del producto. 5.17. Producción de módulos de recombinación para sustitución de promotor endógeno por promotor TetO7 Para la producción final del módulo de recombinación se utilizó el protocolo optimizado. Se utilizaron las muestras de plásmido pCM325 purificado como molde para las reacciones de PCR, los oligonucleótidos empleados en las reacciones se encuentran en la tabla 5.5. El mix de reacción utilizado se describe en la (Tabla 5.8) y las condiciones de amplificación en la ( Tabla 5.9.) Tabla 5.8 Preparación del mix de reacción final Reactivo 50 µL reacción Concentración final 5x PCRBIO buffer 10.0 µL 1x Primer Forward (10 µM) 2.0 µL 400 nM Primer Reverse (10 µM) 2.0 µL 400 nM DNA pCM325 x µL Variable PCRBIO HiFi Pol (2u/µL) 0.5 µL H2O grado PCR Aforar a 50 µL Tabla 5.9 Condiciones de reacción de PCR final. Ciclos Temperatura Tiempo Paso 1 95 °C 1 minutos Desnaturalización inicial 30 95 °C 30 segundos Desnaturalización 30 63.2°C (8 pasos) 1 minuto Alineamiento 30 72 °C 3 minutos Elongación 1 72 °C 3 minutos Elongación final Los productos de PCR fueron visualizados mediante electroforesis de ADN y se confirmó el producto por el peso de la banda. El módulo de recombinación tiene una longitud de 2332 pb, mediante la comparación de la banda con la escalera molecular 1 kb plus de Invitrogen, es posible confirmar la identidad del producto. El módulo producido fue cuantificado utilizando el equipo NanoDrop. 5.18. Transformación de levaduras con acetato de litio La transformación de la cepa R1158 se llevó a cabo adaptando el método descrito (Hernández et al., 2011). Para la generación de la cepa PTET-FRE5; se utilizaron los módulos de recombinación respectivos para la sustitución de cada promotor endógeno. Se preparó un cultivo overnight de la cepa R1158, las células fueron concentradas por centrifugación a 3,000 rpm. La pastilla celular se inoculó en medio YPD y se incubó hasta alcanzar un OD600nm de 0.5. Las células fueron recuperadas por centrifugación a 3000 rpm y tratadas con soluciones recién preparadas de TE/LioAC y PGE/TE/LioAC. CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 37 Se prepararon los siguientes tratamientos: Tubo 1: 100 µL de células Tubo 2: 100 µL de células + 10 µL de DNA acarreador Tubo 3: 100 µL de células + 10 µL de DNA acarreador + los microlitros necesarios del módulo de recombinación para tener 5 µg de módulo total. Se plateó en cajas Petri: Control positivo de viabilidad: 100 µL del tratamiento del Tubo 1 en medio mínimo. Control negativo de resistencia a geneticina: 100 µL del tratamiento del Tubo 2 en medio mínimo + geneticina. Concentrado: 100 µL del tratamiento del Tubo 3 en medio mínimo + geneticina. Dilución 1:10 del tratamiento 3: 100 µL de la dilución en medio mínimo + geneticina. Dilución 1:100 del tratamiento 3: 100 µL de la dilución en medio mínimo + geneticina. Se utilizó placas con Medio mínimo y geneticina para seleccionar las transformantes ya que el módulo de recombinación obtenido del plásmido pCM325 confieren resistencia al antibiótico geneticina (G418). 5.19. Selección de cepas mutantes Para la selección de cepas mutantes se utilizó medio mínimo + geneticina 200 mg/mL. Las placas fueron inoculadas a partir de una colonia aislada y fueron incubadas a 30 °C durante 48 horas. Este proceso fue realizado 2 veces para asegurar la pureza de la colonia de interés. 5.20. Extracción de ADN genómico La extracción de ADN genómico de levadura se llevó a cabo adaptando el método descrito y montado en el laboratorio de la Dra. González, desarrollado de la siguiente manera: se preparó un cultivo de una colonia de la cepa silvestre (WT) y de un par de colonias candidata PTET-FRE5 en 10 mL de medio YPD líquido y se µL incubo durante 16 horas a 30 °C, se colectaron las células por centrifugación a 3000 rpm por 5 minutos. Las células fueron resuspendidas en 0.5 mL de agua bidestilada estéril y se transfirió a un tubo Eppendorf de 1.5 mL. Seguidamente, se centrifugó la suspensión a 14,000 rpm por 1 minuto y se eliminó el sobrenadante. A la pastilla celular se le adicionó 200 µL de una solución de lisis que contenía 2 % Tritón X-100, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0 y 1 mM Na-EDTA; adicionalmente 200 µL de TE a pH 8.0 y 200 µL de una solución fenol:cloroformo:alcoholisoamílico (25:24:1) (FCA) fría y recién preparada. Finalmente se agregó 0.3 g de perlas de vidrio y se sometió a vortex la mezcla durante 4 minutos para lisar las células. El lisado fue centrifugado a 14,000 rpm durante 5 minutos y se transfirió la fase acuosa a un tubo Eppendorf limpio. A la fase acuosa se le agregó 400 µL de FCA y se homogenizó la mezcla con vortex durante 15 segundos, y se centrifugó a 14,000 rpm durante 5 minutos y se transfirió la fase acuosa a un tubo Eppendorf limpio, este proceso se realizó dos veces para incrementar la pureza del ADN. CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 38 Después de los dos pasos de extracción con FCA, a la fase acuosa se agregó 1 mL de etanol al 100 % + 10 µL de acetato de amonio 4 M y se homogenizó mediante inversión suave 6 veces. Se centrifugó la mezcla a 14,000 rpm por 2 minutos y se eliminó el sobrenadante. La pastilla que resultó de la centrifugación fue resuspendido en 400 µL de TE + 10 µL de RNAsa (10 mg/mL) y se incubó a 37 °C por 30 minutos. Tras la incubación se agregó 10 µL de acetato de amonio 4 M + 1 mL de etanol al 100 % y se homogenizó mediante inversión suave 6 veces. Se centrifugó la mezcla a 14,000 rpm por 2 minutos y se eliminó el sobrenadante. Se dejó secar la pastilla mediante secado a temperatura ambiente y se resuspendió el pellet en 100 µL de agua destilada. Se cuantificó el ADN utilizando el equipo NanoDrop. Además, se visualizó el ADN extraído para evaluar su integridad, por medio de electroforesis de ADN en gel de agarosa 1 %. 5.21. PCR para confirmar que el módulo recombinante se integró en el genoma de S. cerevisiae. Las PCR de confirmación fueron realizadas adaptando el protocolo de (PCRBiosistems, 2018). Se utilizó las muestras de ADN extraídas como molde para las reacciones de PCR, los oligonucleótidos empleados en las reacciones se encuentran en la (Tabla 5.5) respectivamente y la reacción se realizó según el siguiente esquema: Figura 5.5 Sitios de amplificación PCR de confirmación. Nota. Los oligos utilizados en esta reacción se presentan en la (Tabla 5.3); P1 corresponde a Fw UTR 5´ FRE5, P2 a Rv UTR 3´FRE5, P3 a Fw OPTetO7FRE5 y P4 a Rv OPTetO7FRE5. Elaboración propia. Tabla 5.10 Preparación del mix de reacción Reactivo 50 µL reacción Concentración final 5x PCRBIO buffer 10.0 µL 1x Primer Forward (10 µM) 2.0 µL 400 nM Primer Reverse (10 µM) 2.0 µL 400 nM DNA x µL 100ng PCRBIO HiFi Pol (2u/ µL) 0.5 µL H2O grado PCR Aforar a 50 µL Nota. Elaboración propia. Tabla 5.11 Condiciones de reacción de PCR para confirmación. Ciclos Temperatura Tiempo Paso 1 95 °C 1 minutos Desnaturalización inicial 30 95 °C 30 segundos Desnaturalización 30 Tm 1 minuto Alineamiento 30 72 °C 3 minutos Elongación 1 72 °C 3 minutos Elongación final CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 39 La temperatura de alineamiento de la reacción de PCR se determinó promediando las Tm individuales de los dos primers de cada reacción, la Tm para cada reacción se presenta en la (Tabla 5.12). Los productos de PCR fueron visualizados mediante electroforesis de ADN y se confirmó el producto por el peso de la banda. Las bandas esperadas son: Tabla 5.12 Tamaño del amplicon esperado en la PCR Nombre de banda Tamaño esperado Tm °C 5´-3´ mutante 4806 46.5 5´- 3´ WT 2804 46.5 5´- KanConf Rv 441 49.0 KanConf Fw. – 3´ 3842 47.5 Nota. Elaboración propia. 5.22. Extracción de ARN El ARN total se extrajo siguiendo el método de Struhl et al., 1981. El RNA de levadura total se preparó a partir de células cultivadas en 100 mL de medio mínimo suplementado con los requerimientos de aminoácidos necesarios de cada cepa y geneticina para el caso de la cepa sobre expresada a una OD600nm de 0.3 (Fase exponencial). Una vez alcanzado el OD600nm indicado, se recolectaron las células por centrifugación a 3000 rpm por 5 minutos y lavadas con dietilpirocarbonato (DEPC) al 0.1 % v/v. La extracción se hizo siguiendo el protocolo de Trizol Reagent, siguiendo las indicaciones del proveedor comercial. El ARN total extraído se trató con DNAsa (5 µg de RNA) por Kit RQ1 de Promega y se convirtió en ADNc por el kit Thermo Scientific: RevertAid H Minus First Strand cDNA Syntesis Kit, cat: K1631. Protocolo enlistado en la sección de anexos. La integridad del ADNc fue evaluada por medio de electroforesis de ADN y por una reacción de PCR de punto final para el gen ACT1. Se extrajo el ARN de las cepas: PTetO7FRE5 (3 réplicas biológicas) R1158 silvestre (3 réplicas biológicas) 5.23. PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). Los oligonucleótidos para el análisis de qPCR se diseñaron utilizando Primer3Plus (Untergasser et al., 2007) y fueron analizados con los programas DINAMelt (Markham et al., 2005) y Mfold (Zuker, M. 2003). Los oligonucleótidos utilizados se enumeran en la (Tabla 5.14). El análisis de qPCR se realizó utilizando el equipo Corbett life Science Rotor Gene 6000. Se utilizó el colorante de detección SYBR Green (2 x KAPA SYBR FAST qBioline y Platinum SYBR Green de Invitrogen). Se preparó 3 réplicas experimentales de cada muestra biológica, la reacción de PCR en tiempo real se realizó utilizando el programa y las condiciones descritas en la ( Tabla 5.13). CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA 40 Tabla 5.13 Condiciones de reacción de qPCR. Ciclos Temperatura Tiempo Paso 1 98 °C 1 minutos Desnaturalización inicial 30 98 °C 30 segundos Desnaturalización 30 58°C 20 segundos Alineamiento 30 72 °C 30 segundos Elongación 1 72 °C 1 minuto Elongación final Nota. Elaboración propia. Tabla 5.14 Oligonucleótidos empleados para el análisis de qPCR Gen Secuencia 5´3´ FRE5 Fw. CGGTAAAAACAGCACAATGA Control 18S Rv. GTATGCATGGTAGGTGTATC Nota. Elaboración propia 5.24. Análisis estadístico qPCR Utilizando los datos de Ct´s (ciclo de threshold) de la qPCR recolectados con el equipo Corbett life Science Rotor Gene 6000 de las 3 réplicas experimentales de: PTet-FRE5 (3 réplicas biológicas) y R1158 cepas silvestre (3 réplicas biológicas); se realizó un análisis de doble delta Ct (Kenneth et al., 2001) utilizando el Software GraphPad Prisma. Se realizó una prueba t de student para evaluar si la media de la expresión de la cepa sobreexpresante del gen FRE5 es estadísticamente significativa a la expresión de la cepa R1158 silvestre. CAPÍTULO 6 Resultados 6.1. Diseño de oligonucleótidos para amplificación del módulo recombinante y cambio de promotor Con el objetivo de generar una cepa sobreexpresante del gen FRE5 por medio de la sustitución del promotor endógeno por un promotor inducible por tetraciclina en la cepa silvestre de Saccharomyces cerevisiae R1158, se decidió utilizar el plásmido pCM325. Este plásmido fue seleccionado debido a que posee un origen de replicación bacteriano, así como un gen de resistencia a ampicilina que le permite ser transformado a la cepa bacteriana E. coli DH5α para replicar el plásmido. Por otra parte, el plásmido posee un origen de replicación eucariota, un gen de resistencia al antibiótico G418 (Geneticina) y el promotor fuerte bacteriano inducible por tetraciclina TetO7. Se diseñaron oligos que flanquean al módulo de resistencia al antibiótico G418 y al promotor TetO7, permitiendo así la amplificación específica de las regiones que permitirán la sobreexpresión del gen FRE5 y la selección de las mutantes. La cepa R1158 se caracteriza por tener integrado en su genoma la secuencia que codifica al trans activador de TetO7, por lo que esta estrategia de sobreexpresión es específica para esta cepa de S. cerevisiae. En la tabla 6.1, se presentan las secuencias de los oligonucleótidos para la producción del módulo recombinante a partir del plásmido pCM325 y en la figura 6.1 se muestran los sitios de unión de los oligos sobre el plásmido pCM325. Utilizando el Software OligoAnalyzer (Owczarzt et. al., 2008), se evaluó el potencial de formación de estructuras secundarias, se determinó la temperatura de anillamiento y %GC; estos parámetros fueron comprobados para minimizar la formación de estructuras secundarias, seleccionar oligos con un %GC adecuado para lograr una buena hibridación y determinar la temperatura de fusión para configurar el programa de PCR. 41 CAPÍTULO 6. RESULTADOS 42 Tabla 6.1. Oligonucleótidos para el plásmido pCM325. Nombre Secuencia Primer Forward módulo de recombinación TTCCTTCACATACATCAAAAAATATGGGATAGCGGGGTGCGGAACAAACA CGTACGCTGCAGGTCGACGG Primer Reverse módulo de recombinación GAACCTGGTGCCAAATACACCAACAGCAGCACTAATCTAGCGAAAAGCAT CATAGGCCACTAGTGGATCTG Nota. En la tabla se presentan los oligos diseñados para la amplificación del módulo recombinantes a partir del plásmido pCM325. Elaboración propia. Figura 6.1 Producción de módulo recombinante a partir de plásmido pCM325. Nota. En la figura se presenta la región del plásmido pCM325 que será amplificada utilizando los oligos de la tabla 6.1, el producto de amplificación contiene el promotor TetO7 y el gen de resistencia a Geneticina con su respectivo promotor y terminador. Elaboración propia. CAPÍTULO 6. RESULTADOS 43 Figura 6.2 Amplificación del módulo recombinante Nota. En la figura se presenta el gel de electroforesis de la amplificación del módulo recombinante para la sustitución del promotor de FRE5. Se utilizó la escalera molecular de 1 kb de Jena Bioscience (México). Elaboración propia. En la (Figura 6.2) se observa la producción del módulo recombinante a partir del plásmido pCM325, el producto FRE5 corresponde a la reacción esquematizada en la figura 6.1, se observa que la implementación de los oligos diseñados es efectiva para producción del módulo recombinante. Para el diseño de las secuencias de recombinación que permitirán la integración del módulo que contiene el módulo de resistencia al antibiótico G418 y al promotor TetO7; en el genoma de S. cerevisiae, sobre el promotor endógeno del gen FRE5 del cromosoma XV. Se emplearon secuencias de recombinación que consisten en 50 pares de bases de la secuencia codificantes del gen FRE5 y 50 pares de bases de la región no codificante (UTR 5´) del gen FRE5. Para que el módulo de recombinación tenga la capacidad de integrarse al genoma en el sitio objetivo, las secuencias de recombinación deben encontrarse en los extremos del módulo, en la figura 5.3 se presenta un diagrama donde se describe la integración del módulo recombinante en el sitio de interés. Para esto se unieron las secuencias que anidan en el plásmido pCM325 con las secuencias que anidan en el promotor endógeno del gen FRE5 del cromosoma XV. Estos oligos se presentan en la (Tabla 6.2) y se nombran como: Fw Ptet-FRE5 y Rv Ptet-FRE5. Cuando se realizan modificaciones a nivel genómico de algún organismo, se debe corroborar mediante PCR que la integración del módulo se dio de forma apropiada y en el sitio de interés. Para esto se deben diseñar oligos que flanqueen todo el constructo que se modificó y oligos que únicamente puedan anidar si el módulo de integró en la orientación deseada. Se diseñaron oligos que anidan en la región UTR 5´, UTR 3´ y sobre la intersección entre el módulo de recombinación y la región codificante del gen FRE5. Todos los oligos diseñados fueron analizados utilizando el Software Oligo- Analyzer (Owczarzt et. al., 2008), se evaluó el potencial de formación de estructuras secundarias, se determinó la temperatura de anillamiento y %GC; los oligos de confirmación se presentan la tabla 6.2 y se nombran como: Fw UTR 5´ FRE5, Rv UTR 3´FRE5, Fw OPtet-FRE5 y Rv OPtet-FRE5. En la (Figura 6.3) se observa la amplificación de la región codificante del gen FRE5 y su respectivo promotor, para las cepas mutantes se espera una banda con una longitud de 4806 pares de bases mientras que en la cepa silvestre se espera una banda con una longitud de 2804 pares de bases. Se observa que los oligos diseñados fueron efectivos para la amplificación de la región de interés. CAPÍTULO 6. RESULTADOS 44 Tabla 6.2 Oligonucleótidos usados para realizar el cambio de promotor del gen FRE5. Nombre Secuencia Tm °C %GC Fw PTetO7- FRE5 TTCCTTCACATACATCAAAAAATATGGGATAGCGGGGTGCGGAACAAACA CGTACGCTGCAGGTCGACGG 87.7 50 Rv PTetO7- FRE5 GAACCTGGTGCCAAATACACCAACAGCAGCACTAATCTAGCGAAAAGCAT CATAGGCCACTAGTGGATCTG 87.0 48 Fw UTR 5´ FRE5 CAGATAGAACCAAAGCGGAAG 59.5 48 Rv UTR 3´ FRE5 TAACAGTAAGGGTGAGGTGT 56.4 45 Fw OPTetO7- FRE5 GTGGCCTATGATGCTTTTCG 58.4 50 Rv OPTetO7- FRE5 CGAAAAGCATCATAGGCCAC 58.4 50 Nota. Elaboración propia Figura 6.3 PCR para la confirmación de la integración del módulo recombinante en las colonias candidatas. Nota. En la figura se presenta el gel de electroforesis de ADN de la reacción de PCR realizada para confirmar la integración del módulo recombinante. Para las cepas mutantes se espera una banda de 4806 pares de bases, mientras que para cepas silvestres se espera una banda de 2804 pares de bases. Elaboración propia. CAPÍTULO 6. RESULTADOS 45 6.2. Producción y purificación del plásmido pCM325 Con el propósito de producir plásmido pCM325 para obtener un stock de trabajo del plásmido, se realizó la transformación por choque térmico de las bacterias calcicompetentes E. coli DH5α, utilizando 500 ng del plásmido pCM325. En la (Figura 6.4) se puede observar los resultados de la transformación. Figura 6.4 Transformación de E. coli con plásmido pCM325. Nota. En el inciso a) se puede observar el control negativo de la transformación, este consistió en la inoculación de las bacterias calciocompetentes E. coli DH5α sin el plásmido pCM325 en una placa con medio LB con ampicilina, no se observó crecimiento en la placa comprobando así que nativamente las bacterias E. coli DH5α no tienen resistencia al antibiótico ampicilina. En b) se puede observar el control de viabilidad, se plaqueó bacterias E. coli DH5α en placa con medio LB sin ampicilina y se observa que hay un crecimiento normal. En los incisos c – e, se observa el crecimiento de las bacterias E. coli DH5α, en diluciones 1:10 y 1:100, transformadas con el plásmido pCM325 en placas con medio LB con ampicilina. Elaboración propia. CAPÍTULO 6. RESULTADOS 46 El crecimiento en placas suministradas con el antibiótico indica que la transformación fue exitosa. A partir de la placa inoculada con la dilución 1:100 de las bacterias transformadas, se realizó un re- cultivo de las colonias aisladas para purificar las cepas transformantes. A partir de cuatro colonias aisladas del re-cultivo de las bacterias transformadas con el plásmido pCM325, se realizó la purificación del plásmido utilizando un kit de MiniPrep basado en columnas de purificación de plásmidos y se utilizó un cultivo líquido de cada colonia transformante. La comprobación del plásmido purificado se realizó utilizando la enzima de restricción SalI, esta enzima de restricción tiene un sitio único de corte en todo el plásmido, lo que genera la linealización del plásmido. Este proceso fue realizado con el propósito de comprobar la identidad del plásmido purificado por el peso de la banda en una electroforesis de ADN. Figura 6.5 Linealización del plásmido pCM325 con la enzima de restricción SalI Nota. Elaboración propia. En la (Figura 6.5) se presenta la visualización del producto digerido por medio de una electroforesis de ADN. En el último carril se visualiza la escalera molecular de 1kb de Jena Bioscience (México). En los 4 carriles restantes se visualiza el producto digerido de las cuatro colonias aisladas