UNIVERS_IDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias Y Humanidades MANUAL DE PRACTICAS PARA MICRODIOLOGIA- BIBLIOTECA DE LA WOVERSIDAD DEL VALE DE GUATEMALA Trabajo presentado por Ana María P. de Mérida (10- ",) en requerimiento parcial previo a obtener el grado de Licenciado en Biología Guatemala 1977 Vo. Bo. Licenciado Ricardo Luján L. Asesor. Tribunal (f) (f) (f) Fecha de aprobación: de Noviembre de 1977. 4 INDICE Página Introducción 1 Reglas para el Laboratorista 2 Instrucciones para Escribir sus Reportes de Laboratorio 4 METODOS DE LABORATORIO 7 I. El Microscopio 8 II. Calibración del Ocular Micrométrico III. Métodos de Inoculación en Microbiología' 18 IV. Preparación de Medios de Cultivo 26 V. Esterilización 29 VI. Presencia de Microorganismos en el Ambiente 33 COLORACIONES 35 VII. Coloraciones Simples 36 VIII. Coloración de Gran 41 IX. Coloración de Ziehl Nielsen 1111 X. Coloración de Cápsulas 47 XI. Coloración de Esporas 50 XII. Coloración de Flagelos 52 BACTERIAS 55 XIII. Movilidad de las Bacterias 56 XIV. Licuefacción de la Gelatina 59 XV. Producción de Catalasa 61 XVI. Metabolismo Bacteriano, Acción sobre Carbohidratos 63 XVII. El Ciclo del Azufre y la Producción de Hidrógeno Sulfurado 66 XVIII. Determinación de un Producto del Metabolismo de Proteínas por la Prueba de Indol 69 XIX. Determinación de Algunos Productos Finales del Metabolismo Anaerobio por la Prueba del Rojo de Metilo 72 iii Página XX. Determinación de Algunos Productos Inter- medios del Metabolismo Anaerobio por medio de la Prueba de Vogues-Proskauer 74- XXI. Utilización de Citrato 77 XXII. El Ciclo del Nitrógeno y la Reducción de Nitratos a Nitritos 79 XXIII. Acción de las Bacterias sobre Algunas Proteínas y Carbohidratos de la Leche 83, XXIV. Cultivo y Aislamiento de Bacterias Anaerobias 85 XXV. Aislamiento e Identificación Presuntiva de Bacterias Anaerobias I 87 XXVI. Aislamiento e Identificación Presuntiva de Bacterias Anaerobias II 89 XXVII. Pruebas de Precipitación y Aglutinación 92 XXVIII. Actividad Antimicrobiana de Algunos Compuestos 96 XXIX. Sinergismo 98 ALGAS 100 XXX. Las Algas 101 XXXI. Colección e Identificación de Algas de dos Habitats Acuáticos 103 HONGOS 106 XXXII. Los Hongos 107 XXXIII. Técnica de Cultivo para Identificación de Hongos 110 XXXIV, Actividad Antimicrobiana de Penicillum Chrysogenum 114 XXXV. PROTOZOARIOS 117 XXXV. Los Protozoarios 118 XXXVI. Los Protozoarios y los Insectos Xilofagos 121 PROYECTOS 123 XXXVII. Curva de Crecimiento en un Medio Líquido 124 XXXVIII. Bacteriología de los Alimentos 127 iv Página XXXIX. Bacteriología de la Leche 131 XL. Examen Bacteriológico del Agua 136 XLI. Bacillus anthracis y los postulados de Koch 142 APEND ICES A. Agares 145 B. Caldos 149 C. Leches 152 D. Medios 153 E• Prueba de Indol 155 F. Colorantes 156 G. Reactivos y Soluciones 159 H. Tabla de Indicadores 161 I• Morfología de las Colonias 163 J. Lista de Materiales 164 BIBLIOGRAFIA 167 LISTA DE FIGURAS Figura Página 1. El Microscopio 9 2. Calibración del Ocular Micrométrico 16 3. Tipos de Asas 19 k. Forma de Tomar una Porción de Cultivo 23 5. Forma de Sembrar en Estrías 24 6. Forma de Sembrar en Tubo 25 7. Esterilización 30 8. , Forma de Hacer un Frotis 38 9. Forma de Fijar un Frotis y Secarlo 39 10. Forma de sembrar para la Prueba de Movilidad 58 11. Esquema de una Matriz de Plexiglass 94 12. Forma de colocar el Tubo de Vidrio y el Portaobjetos dentro de la Caja de Petri 112 13. Forma de Colocar las Piezas para Cultivo en Lámina 113 14. Forma de Sembrar el Hongo,y las Bacterias para la Prueba de Actividad Antimicrobiana de Penicillum chrysogenum. 115 15. Dilución en Serie 129 vi INTRODUCCION Las prácticas de laboratorio son una complementación in dispensable en un curso de Microbiología General. El presen te trabajo pretende asistir al estudiante de tal curso, en su tarea de laboratorio, con lo cual adquiera conceptos básicos, desarrolle una actitud científica y se familiarice con el trabajo práctico. La presentación es en forma de Manual, dividida en siete partes, con un tema principal cada una: la Parte I trata so- bre técnicas generales de laboratorio de Microbiología; la Parte II trata sobre coloraciones; las partes III, IV, V y VI, tratan sobro Bacterias, Algas, Hongos y Protozoarios res pectivamente. La Parte VII es una serie de proyectos a rea- lizarse por el estudiante durante el semestre. Este ordena- miento obedece al propósito de que el estudiante siga sus prácticas en esa secuencia, adquiriendo habilidades en el manejo de microorganismos, desde lo simple a lo complicado, a la voz de ahondar en el conocimiento de sus propiedades y características, también de lo simple a lo complicado. Como una guía, se estima que el curso requiere dos pe- ríodos de tres horas cada uno, con un día de intervalo entre períodos. Se sugiere, con propósitos didácticos, que el es- tudiante prepare por lo menos una práctica. La autora desea agradecer al licenciado Ricardo Luján su asesoría en la presentación de este trabajo y a los docto res Michael y Margaret Dix por sus sugerencias y la cuidado sa lectura del Manual. También deseo agradecer muy especial mente las sugerencias del ingeniero Hugo Romeo Masaya en la redacción y la cuidadosa interpretación de los esquemas del Bachiller Silvetz Ramírez, esperando que ello derive en bone ficio del estudiante y del instructor. REGLAS PARA EL LABORATORISTA En todo laboratorio de Microbiología hay gran cantidad de microorganismos contaminantes y patógenos, ya sea en mues tras clínicas o en cultivos puros. Por ejemplo, Pike et al., (1965) han publicado un sumario de las infecciones adquiri- das por operarios en los laboratorios, durante el período 1950-1965, en los Estados Unidos. Señalan que la vía más frecuente de transferencia del agente infectante son los ae reosoles (Blair, 1971). Es muy importante, por lo tanto, seguir cuidadosamente los procedimientos de asepsia, y adquirir la costumbre de usar la campana de seguridad cuando se manejan organismos altamente infectantes. A continuación se enumeran las reglas que siempre deben observarse: 1. No se debe beber, comer, ni fumar en el laboratorio. 2. No debe llevarse a la boca ningún objeto, tal como lápices, dedos, etcétera, mientras se esté traba- jando. 3. Los objetos usados en otras actividades deben dejar se fuera del laboratorio: libros, bolsas, abrigos, etcétera. 4. Siempre debe usarse una bata blanca para trabajar. 5. Si es derramado un cultivo, el área de derrame de- be cubrirse con toallas de papel y saturarlas con desinfectante (fenol al 5% o Clorox 1:20). 6. Al terminar, se debe limpiar bien la mesa de traba- jo. Ray que recordar que otras personas usan tam- bién el laboratorio. 7. Se debe apagar mecheros, aparatos eléctricos y lu- ces al terminar la práctica y salir del laboratorio. 8. Siempre debe rotularse todo trabajo hecho y el ma- terial utilizado en clase, indicando nombre de la preparación, del operador y la fecha. 9. El material usado, especialmente cultivos en placa y en tubo, debe colocarse en un recipiente y cubrir lo con desinfectante (Formol al 5% o Clorox 1:20). 10. Toda la cristalería usada debe limpiarse con sufi- ciente jabón. 11. Al terminar sus prácticas desinfectase las manos y láveselas bien con jabón. 3 INSTRUCCIONES PARA ESCRIBIR SUS REPORTES DE LABORATORIO Siempre trate de escribir sus reportes en forma tal que cualquier persona pueda comprenderlos; escríbalos a máquina de ser posible, sobre todo si su letra no es clara. A continuación se dan algunas reglas que deben seguirse al escribir sus reportes de laboratorio. 1. Siempre ponga el título del experimento o práctica que realizó. No olvide poner la fecha. 2. Escriba una pequeña introducción explicando el pro- pósito del experimento o práctica realizada y los antecedentes. 3. Un reporte científico generalmente debe contener una parte que describa los materiales y métodos usados. Usted puede omitir esta descripción; bas- tará con que haya referencia a la página del Manual en que se describe la práctica. Si la práctica se realiza con variaciones respecto a lo indicado por el Manual, deberá hacer una descripción completa, o bien indicar las modificaciones. 4. Los resultados que obtenga deben ser consignados en forma clara y concisa; cuando convenga para mayor claridad, debe incluir cuadros, gráficas o dibujos. Los dibujos deben ser siempre a lápiz y no a colores. SIEMPRE DIBUJE LO QUE VE Y TRATE DE HACER UN DIBUJO CLARO, 5. Incluya una breve discusión sobre el experimento y sus resultados. Anote la interpretación de sus re- sultados; si estos no fueran lo que usted esperaba, discuta las diferentes posibilidades por no haber obtenido estos resultados. Es aconsejable consul- tar algunas fuentes de información para el trabajo e incluir referencias bibliográficas correspondien- tes. 6. Toda referencia bibliográfica debe tener como míni- mo lo siguiente: Si es un libro Autor Año Título (subrayado) Número de edición Casa Editora Lugar Ejemplo: Nason, Alvin, 1975. Biología Editorial Limusa, México. Si es una revista Autor Año Título del artículo Nombre de la revista (abreviado) Tomo Volumen (subrayado) Número Páginas Ejemplo Donalson, D.M. and Tew, J.G. 1977 Beta-lysin of Platelet Origin Bact. Rev. (2) : 501-513. 7. Responda el cuestionario al final de cada ejercicio. 8. Haga un resumen de su reporte 9. Si hay alguien que le ha asesorado en su trabajo, incluya agradecimientos. 10. Si su reporte incluye cuadros o diagramas, siempre pongale a estos un titulo. 5 11. En resumen, todo reporte debe contener lo siguiente: I. Titulo, autor y fecha II. Introducción III. Materiales y Métodos IV. Resultados V. Discusión VI. Resumen y conclusiones VII. Agradecimientos VIII. Literatura citada 6 METODOS DE LABORATORIO 7 PRACTICA I EL MICROSCOPIO El microscopio es un instrumento óptico que nos permite ver objetos invisibles al ojo humano desnudo. Existen varios tipos de microscopios de acuerdo a la fuente de luz que usen, o bien al tipo de oculares. En las prácticas contenidas en este Manual se usará exclusivamente un microscopio óptico binocular. (Fig. No.l). La técnica del empleo del microscopio se llama micros- copia. Hay varios tipos de microscopio., según el tipo de trabajo que debe realizarse; por ejemplo, existe la micros- copia de campo obscuro y la microscopla de contraste de fa- ses, ambas muy usadas en Microbiología. La primera es apro- piada para observar objetos muy pequehos y la segunda para observar especímenes transparentes. Para una descripción detallada de las diversas partes de un microscopio y de los principios físicos de su función consulte las siguientes fuentes: Blair, J.E. et al., 1970. Lynch, M.J. et al., 1972. Davis, B.D. et al., 1973. Objetivo de la Práctica Familiarizar al estudiante con las partes, el manejo, el transporte, el cuidado y la limpieza del microscopio. Materiales para la Práctica 1. Microscopio. 2. Una preparación. 3. Portaobjetos y cubreobjetos. 4. Papel para limpiar lentes. 5. Aceite de inmersión. 6. Xileno. 7. Kleenex. 8 FIG N.1 9 EL MICROSCOPIO PARTES OPTICAS Y MECÁNICAS Porta Objetivos Rotativo Condensa- dor Palanca del Diafragma Fuente de luz Botón sl del Tran famador Diafragma del Campo y Puntero Brazo Objetivó I Objeto Platina Tornillo del Con- densador. Micromé- frica Tornillo Macramé- trico. Base Transfor- mador "Cortesía de American Optical Corp.". Imagen Distando de 250mrr Imagen Retinal 'Tubo Inclinable del ocular Observador 10 Procedimiento para la Práctica Tome el microscopio que le ha sido asignado (siempre usará el mismo microscopio para todas sus prácticas). Lleve- lo a su mesa de trabajo SIGUIENDO ESTRICTAMENTE LAS SIGUIEN- TES INSTRUCCIONES: a. Tome el BRAZO del microscopio con su mano dere cha y coloque su mano izquierda en la BASE del microscopio. b. Colóquelo en la zona de la mesa que queda pró- xima a usted, cuidando que quede por lo menos a unos 10 cros. de la orilla, para evitar cual- quier caída accidental. c. Si el microscopio que usa tiene una fuente de luz, colóquela en el lugar adecuado y oprima el botón o mueva la palanca para encenderla. Si no tiene lámpara, coloque la fuente de luz enfrente del microscopio y mueva el espejo plano, hasta que la luz de la fuente se vea atravez del OCULAR. d. Examine el lente objetivo. Generalmente el microscopio tiene en posición el LENTE OBJETI- VO SECO DEBIL (10Z); si en el curso de la pf'ac tica necesita cambiarlo, al finalizar debe de- jar en posición ese mismo objetivo. e. Examine el brazo del microscopio. En 61 halla rá dos tornillos: el MACROMETRICO y el MICROME TRICO. El primero sirve para ajustar la ima- gen y el segundo para enfocarla y afinarla. Identifique ambos tornillos con toda seguridad. f. Suba el PORTAOBJETIVO usando el tornillo macro métrico. Esto facilitará colocar la lámina. g. Ajuste el DIAFRAGMA a:fin de que la iluminación observada a travez del OCULAR sea uniforme y agradable . h. Aseguresé que su preparación esté limpia. 1. Coloque su preparación sobre la PLATINA direc- tamente al centro del agujero del condensador, usando los tornillos que sirven para moverla, J. Suba el condensador a su posición superior usando el tornillo para esto, hasta que la dis tancia entre el condensador y la preparación sea muy pequeña. k. Observando por un lado el microscopio, baje el portaobjetivos mediante el tornillo macrométri- co hasta que la distancia entre el lente obje- tivo y la preparación sea pequeña. 1. Observe por el ocular y suba lentamente el tor nillo macrométrico hasta que la imagen sea dis tinta. Luego afine con el tornillo micrométri co hasta que la imagen alcance su máxima niti- dez. m. Si la preparación observada lo requiriera, ne- cesitará cambiar de objetivo. Para colocar el OBJETIVO SECO FUERTE (45 X), solamente debe darle vuelta al revólver de los objetivos. NO NECESITA BAJAR O SUBIR EL PORTAOBJETIVOS. n. Enfoque de nuevo con el tornillo MICROMETRICO en forma exclusiva, ya que la distancia entre la laminilla y el objetivo es ahora menor; si usa el macrométrico puede romperla o rayar el lente del objetivo o la preparación. o. Para enfocar con la lente de INMERS1ON (100 X) suba su lente con el tornillo macrométrico. Co loque una pequeña gota de aceite de inmersión sobre su preparación. Baje su lente de inmer- sión con el tornillo macrométrico observando por un lado del microscopio, hasta que la len te alcance la gota de aceite. Luego observe por el ocular y enfoque con el micrométrico. p. Hechas sus observaciones, proceda a limpiar y a guardar el microscopio, 11 q, Cualquier problema que tenga pida ayuda al instructor. Asegurese que: 1. El OBJETIVO SECO DEBIL esté en su posición. 2, El PORTAOBJETIVOS este hasta abajo. 3. Los tornillos de la platina esten en posi- ción, 4. El microscopio esté cubierto con su cubier ta plastica, r. Cuidados y limpieza del microscopio, 1. Nunca incline el microscopio; úselo siem- pre perpendicular a la mesa de trabajo. 2. Siempre use papel especial para limpiar los lentes, no use toalla de papel o ,tela. 3. Si tiene que dejar el microscopio por algu na razón cuando lo está usando, siempre apague la luz y deje el microscopio cubier to con su cubierta de plástico, 4. El objetivo de inmersión siempre debe ce- jarse limpio, para ello se usa xileno en cantidades mínimas, 5. Los otros lentes, el lente objetivo seco débil, el lente objetivo seco fuerte y el ocular, nunca deben tocarse con ningún lí- quido. 6. Algunas veces aparecen líneas o manchas borrosas en el campo, estas son general- mente causadas por polvo, pequehos hilos o basuras en la lente objetivo, en la len- te ocular o bien en la preparación. Para localizar estas manchas primero limpie su lente objetivo. Segundo, mueva o rota su lente ocular, si las manchas se mueven tam bién, limpie su lente ocular. Si las man chas no se uiitan, mueva su preparacLtr. Si las manchas se mueven al mover su nre- 12 13 paración, éstas estan en la preparación y ésta debe limpiarse. 7. Si las manchas no se quitan limpiando la lente ocular o la preparación, estas pueden estar en el condensador o dentro del obje- tivo ocular. Para limpiar esto LLAME A SU INSTRUCTOR. Cuestionario 1. ¿qué es poder de resolución? 2. ¿Qué es apertura numérica? 3. ¿qué es la microscopia de contraste de fases? 11_. ¿Qué es la microscopla de campo obscuro? 5. ¿Cómo se calcula la magnificación? PRACTICA II CALIBRhCION DEL OCULAR MICROMETRICO Las bacterias se diferencian unas de otras en varias características: forma, tamaño y detalles particulares. A- tendiendo a su forma las bacterias se clasifican en: cocos, de forma redonda, bacilos, de forma rectangular o de baston- citos, y espirilos, de forma alargada en espiral. El tamaño de las bacterias es una característica nece- saria para su identificación ya que existen bacterias dife- rentes que tienen la misma forma, pero se distinguen por sus distintos tamaños. El tamaño de las bacterias puede medirse mediante el microscopio. Para poder medir el tamaño de las bacterias mediante el microscopio, es necesario calibrar el ocular micrométrico que es el instrumento que sirve para medirlas. El ocular micrométrico tiene una escala dividida en intervalos iguales; esta escala aparece como un trazo en forma de escalera al observar por el ocular. Para establecer la medida de los intervalos de la esca- la del ocular micrométrico, se calibra éste usando un micró- metro "objetivo" que tiene una escala de valor conocido. Ge- neralmente la división más pequeda en el micrómetro "objeti- vo" es igual a 10 micrómetros (dm) (Broclmaan, 1973). Objetivo de la Práctica Calibrar un ocular micrométrico. Materiales para la Práctica 1. Microscopio con objetivos seco débil, seco fuerte y de inmersión. 2. Micrómetro ocular. 3. Micrómetro "objetivo" calibrado. 4. Aceite de inmersión. 5. Preparaciones fijas de: bacilos, cocos y espirilos. 6. Papel especial para limpiar lentes. 111 15 7. Xileno,. Procedimiento para la Práctica 1. Su ocular micrométrico ya estará colocado. 2. Su objetivo seco débil estará en posición. 3. Coloque su micrómetro calibrado ("objetivo") y en- fóquelo. 4. Ajuste la iluminación a fin de obtener un buen con- traste entre la escala y el fondo. 5. Mueva el micrómetro calibrado hasta que los orígenes de la escala ocular y de la escala del micrómetro calibrado coincidan en su punto O. Al efectuar esta operación observará que en alguna de las dos esca- las, dos líneas de graduación coinciden.(Fig. No.2) 5. Cuente los intervalos del micrómetro calibrado des- de el punto O hasta donde se verifica la coinciden- cia. Anote este número. 6. Repita el paso anterior para la escala del micróme- tro ocular. 7. Emplee la siguiente fórmula para calcular el valor lineal de cada división del micrómetro ocular; en esta fórmula I es el valor conocido de cada inter- valo del micrómetro calibrado. (No. de divisiones en el micrómetro calibrado) X I No. de divisiones en el ocular = longitud de división/ocular. 8. Mida el tamaño de las bacterias en sus preparacio- nes contando los intervalos del micrómetro ocular que abarcan y multiplicando por la longitud obteni- da en el paso 6. 9. Repita estos pasos con el objetivo seco fuerte y el objetivo de inmersión. 10. Conociendo el tamaño real de las bacterias y el ta- maño de sus dibujos, puede determinar el aumento de sus dibujos. Calcule esos aumentos y anótelos jun- to a sus dibujos. 16 FIGURA No 2 CALIBRACION DE ESCALA OCULAR Resultados de la Práctica 1. La constante de calibración para el microscopio número con un aumento de 100X 450K 1000X 2. Dibuje algunas células en los círculos de abajo para ilustrar las diferentes formas de bacterias. Dibuje a una escala de 1.,/ igual a 5 mm. Recuerde que sus dibujos deben hacerse a lápiz. Bacilos, magnificación X. Tamaho promedio X Magnificación total X. Cocos, magnificación X. Tamaño promedio X Magnificación total Espirilos, magnificación X. Tamaño promedio X 0 Magnificación total 17 PRACTICA III METODOS DE INOCULACION EN MICROBIOLOGIA La inoculación consiste en depositar una pequeña porción de cultivo de microorganismos en un medio adecuado para su crecimiento y reproducción; esto se hace, por ejemplo en un medio sólido, con el propósito de reconocer las colonias que se forman y/o aislar alguna de ellas para usos posteriores. Dependiendo del uso al que se destina el nuevo cultivo, pue- den usarse diferentes tipos de inoculación: en estrías, para aislamiento; punción, para observar movilidad o bien alguna reacción en el fondo del agar; en caldo o en asar, usada sim plemente para mantener una cepa en cultivo puro. En operaciones como éstas, se manejan cultivos de bac- terias, hongos, levaduras; el manejo de cultivos de este ti- po es muy frecuente en el trabajo de laboratorio y debe rea- lizarse con mucho cuidado para evitar las contaminaciones de cultivos y subcultivos. Objetivo de la Practica Introducción al concepto y aplicación práctica de una técnica aséptica estéril. Materiales para la Práctica 1. Asa de punta recta.(Fig.No.3a). 2. Asa de punta redonda.(Fig. No.3b). 3. Tubos de ensayo de 13 X 100 mm. con un cultivo mez- clado de bacterias. 4. Un tubo de ensayo de 13 X 100 mm. con 10 ml. de caldo nutritivo.(Rotulado). 5. Un tubo de ensayo de 13 X 100 mm. con 10 ml. de agar nutritivo.(Rotuludo). 6. Una placa de agar sangre.(Rotulado) 7. Mecheros. 18 FIGURA NO 3 TIPOS DE ASAS — Asa de punta recta b — Asa de punta redonda 19 - Forma de flamear el asa Procedimiento para la Práctica A. Para duplicación de un cultivo. 1. Tome el tubo del cultivo de bacterias con su ma- no izquierda. 2. Tome el asa de punta redonda'con su mano derecha. 3. Flamee el asa en la región de la llama azul, y espere que enfríe manteniendola cerca del meche- ro. ( Fig. No. 3c). 4. Con el dedo meñique de su mano derecha destape el tubo del cultivo. ( Fig. No, 4a). 5. Introduzca el asa y tome una alícuota del culti- vo. (Fig. No4b). 6. Flamee la boca del tubo del cultivo y tápelo. (Fig. no. 4 c). 7. Coloque el cultivo en la gradilla y tome el tubo con caldo nutritivo. Rotulado. 8. Destapelo en la misma forma del paso 4 y coloque la alícuota del cultivo. (Fig. No. 60), 9. Flamee la boca del tubo y tápelo. Coloquelo en la gradilla. B. Para obtener aislamiento de bacterias, siga los si- guientes pasos: 1. Repita los pasos del 1 al 6 del procedimiento anterior. 2. Coloque el tubo de cultivo en la gradilla y to- me su caja de agar sangre debidamente rotulada. 3. Destape con anidado la caja, sin quitar total- mente la tapa. Ver lámina I. 4. Siembre sobre el agar, en estrías.(Fig. No.5a). 5. Cierre la caja y flamee el asa. 6. Siembre en estrías perpendiculares a la siembra anterior. ( Fig. No. 5b). 7. Flamee el asa. 8. Siembre en estrías perpendiculares a la siembra anterior.( Fig. No. 50). 9. Flamee el asa. 20 LAMINA I 21 Forma de abrir la caja de Petri para sembrar. 10. Invierta la caja con el ajar hacia arriba. 11. Coloque la caja en incubación a 372C. 12. Transcurridas 24 horas de incubación, examine la caja y tome nota do lo que observe. Deje la caja en incubación otras 24 horas para exa- minarla de nuevo. C. Para obtener un cultivo puro proceda así: 1. Tome el asa de punta recta y flameela. Déjela enfriar manteniendola cerca de la llama. 2. Pique una colonia aislada del crecimiento que obtuvo en la caja de ajar sangre. 3. Tome el tubo con ajar nutritivo, debidamente rotulado, destápelo en la forma que se indicó anteriormente. 4. Siembre las bacterias en el tubo.(Fig. N006a). 5. Flamee la boca del tubo y tápelo. 6. Coloque el tubo en incubación a 372C durante 24 horas. 7. Transcurridas las 24 horas de incubación, exa- mine el cultivo y tome nota de lo que observe. Deje el tubo en incubación otrLs 24 horas para examinarlo de nuevo. Cuestionario 1. ¿Por qué es necesario flamear el asa antes de introdu- cirla al cultivo? 2. ¿Por qué'se flamea la boca del tubo antes de cerrarlo? 3. ¿Por qué razón se siembra en estrías sobre el ajar en vez d4 en una forma circular? 4. ¿A qué conclusión podemos llegar cuando aparecen colonias de diferente forma, tamaho o color? 5. ¿Qué diferencia hay entre el procedimiento de aislar en la caja de altar sembrando en estrías y el procedimiento de tomar un asa y sembrar en caldo? 22 11111111111111 FORMA DE TOMAR UNA PORCION DE CULTIVO 23 a — Destape el tubo manteniendolo inclinado cerca del mechero b — Introduzca el asa en forma recta, paralela al largo del tubo r Flamee la boca del tubo antes de cerrarlo Figura A Flamee el asa BIBLIOTECA DE LA á Int Un OE GWEIALA FIGURA No 5 214. FORMA DE SEMBRAR. EN ESTRIAS Figura B Flamee el asa Figura C Flamee el osa FIGURA N° 6 FORMA DE SEMBRAR EN TUBO a— En tubos con agar inclinado siempre de abajo hacia arribo. b— En tubos de agar especial, como TS I, pique hasta el fondo y luego hago estrías de abajo hacia arribo 25 - En medios liquidas, introduzca el asa hasta la mitad tubo, PRACTICA IV PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Un medio de cultivo es una mezcla de compuestos que sir ve para promover el crecimiento y reproducción de bacterias, hongos y levaduras a partir de un inóculo pequeño. El medio de cultivo contiene los substratos necesarios para satisfacer los requerimientos nutricionales de los microorganismos, y puede usarse para diferentes propósitos. Como células vivientes, los microorganismos requieren nitrógeno y carbono, por lo que un medio básico debe contar con una fuente de cada uno de estos elementos. Algunas bac- terias pueden usar la atmósfera como fuente de nitrógeno; otras pueden usar el nitrógeno de compuestos simples como a- mino ácidos y urea; y para aquellas más exigentes, se han de sarrollado hidrolizados de proteína que son solubles en agua los cuales se conocen como peptonas. Los medios de cultivo pueden ser sólidos, semisólidos o líquidos. Los agentes solidificantes más usados son el agar, la gelatina, el sílice y unos agentes poliacrilíticos. La gelatina se usa raramente porque es fácil de licuarse a tem- peraturas un poco arriba de la temperatura ambiente, en tan- to que el sílice se usa por regla general para microbiología de suelos (Blair, 1970). El agente solidificante más usado es el agar. El que un medio de cultivo Sea sólido, semisólido o líquido, gene- ralmente depende de la concentración de agar que contenga. El medio es sólido cuando el agar está a una concentración de 1.5%, semisólido cuando el agar esta a una concentración de 0.2%, y líquido cuando no tiene agar. Se pueden emplear también agentes selectivos que se a- gregan al medio y que permiten el crecimiento de algunos or- ganismos e inhiben el crecimiento de otros. Existen clases especiales de medios selectivos que se usan para aislamiento, mantenimiento, evaluación, etcétera. Algunos agentes son es- 26 peciales para el aislamiento de una sola clase de bacterias, tal como el asar Salnonella-Shigella (SS). Para detectar el cambio de pH resultante del metabolis- mo de algunas bacterias, son muy usados los indicadores como el Rojo de Fenol, el Rojo Neutro, etcétera. Los cambios de color observados en el medio sirven de indicio para identi- ficar el cambio de pH resultante. Vea la tabla de indicado- res en el apéndice H. Objetivo de la Práctica Habilitar al estudiante en la preparación de cuatro me- dios de cultivo sencillos, los cuales se usarán en las prác- ticas siguientes. Materiales para la práctica (por estudiante) 1. Caldo para prueba de carbohidratos (BBL OF Basal Medium), 2, Azucares: Dextrosa, Sacarosa y Lactosa. 3. 1 Erlenmeyer de 500 ml. 4. 3 Erlenneyers de 250 ml. 5. 1 probeta graduada de 250 ml. 6. 1 embudo de plastico o bien papel cortado en cua- dros de 15 cms.2 para servir el medio. 7. 50 tubos de ensayo de 16 X 125 mm. con tapón de rosca y campanilla de Durham invertida. 8. 3 pipetas de 10 ml. 9. Balava, 10. Papel encerado. 11. Espátulas planas. Procedimiento para la Práctica Examine la etiqueta del envase del medio de cultivo se- co y averiguo qué cantidad debe usarse para preparar 500 ml, de caldo liquido, 1. Pese la cantidad de polvo seco necesario para pre- parar 500 ml. de caldo. 2. Coloque el polvo ya pesado en el Erlenneyer de 500 21 mililitros y agregue 250 ml. de agua destilada ca- liente, agitando en forma continua. 3. Agregue otros 250 ml. de agua destilada hasta que esté todo disuelto. 4. Distribuya esta solución en los tres Erlenmeyers de 250 ml. colocando 160 ml. de la solución en cada uno de ellos. 5. Coloque 10 ml. de la solución sobrante en cada uno de dos tubos de ensayo. 6. Rotule los Erlenmeyers con los números 1, ii, 7. A la alícuota i agreguele 0.4 gms. de Dextrosa. 8. A la alícuota ü agreguele 0.4 gms. de Sacarosa. 9. A la alícuotaiii agreguele 0.4 gms. de Lactosa. 10. Rotule 16 tubos con "Caldo Glucosado". 11. Rotule 16 tubos con "Caldo Sacarosado". 12. Rotule 16 tubos con "Caldo Lactosado". 13. Distribuya los medios en los tubos respectivos, colocando 10 ml. en cada tubo. 14. Esterilice en el autoclave a 1182C y 15 libras de presión. Este paso es parte de la siguiente prác- tica. Cuestionario 1. ¿Qué son medios diferenciales? 2. ¿Qué son medios selectivos? 3. ¿Conoce usted el contenido de amino ácidos de algunas peptonas? 4. ¿(.tué son Triptonas? 5. ¿,(kué son Caseitonas? 28 PRACTICA V ESTERILIZACION La esterilización es un tratamiento por medio del cual se destruye toda forma de vida microbiana. Esto se puede lograr empleando agentes físicos y químicos, y en el caso de ciertas soluciones, por filtración. Uno de los agentes más práctico y confiable es el calor. Se puede esterilizar por calor seco, usando un horno a 1702C durante 90 minutos. También se puede utilizar calor htedo utilizando vapor de agua a presión, generalmente 15 libras para llegar a una temperatura de 1202C. De los dos métodos, el calor seco requiere más tiempo ya que la conducción del calor es más lenta en el aire que en el vapor de agua. Los medios de cultivo que deben prepararse con sustaw, cias suceptibles al calor, tales corno sangre, carbohidratos, antibióticos u otros, se esterilizan antes de la adición de estas sustancias en Erlenmeyers tapados con algodón y envuel tos en papel café (Fig. No.7 a ). Ya estériles, y a 45 6 50,2C se les puede agregar la sustancia faltante y alicuotar- los. Se recomienda que la temperatura no baje más de la tem peratura recomendada ya que, el bajar y volver a_subir la temperatura puede causar cambios de pH hasta de 1 unidad. Existen otros métodos para esterilizar sustancias lábi- les al calor excesivo. Uno de ellos es la esterilización fraccionada o Tindalización. También se usa el método origi nado por Pasteur (Pasteurización), generalmente aplicado a la leche, el cual destruye bacterias patógenas transmitidas atravez del consumo de leche. La filtración es también un método para esterilizar so- luciones termolábiles. La acción de estos filtros es comple ja, ya que los microorganismos son retenidos por los filtros por el tamaño de los poros y por absorción de las paredes de los poros en su paso atravez de ellos. Existen varios tipos de filtros, estos son: filtros de membrana que consisten de 29 FIGURA No 7 30 a — Forma de tapar los Erlenmeyer para esterilizar los medios de cultivo. b— Los tubos de agar que es necesario, queden en forma incli- nada, se enfrian asi. La altura "ha dependera del grueso del tubo. 31 discos de ésteres de celulosa; filtros Seitz que consisten de discos hechos de una mezcla de asbesto y celulosa; discos de incrustaciones de vidrio; y filtros de candela hechos de porcelana no vidreada (Stainer et al., 1970). Generalmente, los hisopos, las pipetas y la cristalería se envuelven en papel café para ser esterilizados en el auto- clave con el propósito de que al ser guardados, conserven su esterilidad. Aunque los desinfectantes no se pueden considerar agen- tes esterilizantes, se utilizan en el laboratorio para tratar materiales ya usados en el laboratorio antes de lavarlos. Esto es importantes ya que algunas veces se utilizan en las prácticas microorganismos potencialmente patógenos. De los agentes desinfectantes más usados estan el fenol al 9/0 y el clorox en una dilución 1:20. Objetivo de la Práctica Conocer y practicar una técnica de esterilización que es usual en los laboratorios. Materiales para la Práctica 1. Los medios de cultivo preparados en la práctica an- terior. 2. Cristalería: cajas de Petri de 20 cros. de diámetro, pipetas de 1 ml., 5 ml. y 10 ml. 3. Papel café cortado a la medida para envolver la cristalería. 40 Autoclave. Procedimiento para la Práctica 1. Coloque los tubos de ensayo con los medios de cul- tivo en gradillas o canastas de metal. Este paso probablemente ya estará hecho de la práctica ante- rior. 2. Asegurese que cada canasta o gradilla esté rotulada con su nombre, la fecha y el nombre del medio que contengan. 3. Envuelva una a una las piezas de cristalería con pa pel café. 4. Coloque todo en el autoclave. 5. Esterilice durante 20 minutos a 118QC a 15 libras de presión. 6. Desconecte el aparato y deje bajar la presión lenta mente hasta O libras, después puede abrir la puerta del autoclave. 7. Saque las gradillas o las canastas y la cristalería del autoclave y deje enfriar. 8. Los medios de cultivo ya fríos o a temperatura am- biente deben colorarse en la incubadora durante 24 horas. 9. Transcurridas las 24 horas de incubación, pueden guardarse en refrigeración. Cuestionario 1. ¿Por qué es necesario incubar los medios ya estériles? 2. Distinga entre los términos desinfectar y limpiar. 3. Distinga entre los términos bactericida y bacteriostáti- co. 14. ¿Qué factores aumentan o disminuyen la acción de los agentes químicos sobre las bacterias? 5. ¿qué efecto tiene la luz ultravioleta sobre las bacte- rias? 32 33 PRACTICA VI PRESENCIA DE MICROORGANISMOS EN EL AMBIENTE El aire, la tierra, el agua y cualquier superficie estan poblados de microorganismos; todo el ambiente, en general, a loja, microorganismos. El hombre es huésped de una gran can- tidad de microorganismos que residen en sitios como la piel, la boca, los intestinos, etcétera. Se dice que tienen la propiedad de ser ubicuos, El ambiente puede ser una fuente de contaminación; es muy importante que la persona que trabaja en un laboratorio conozca las probables fuentes de contaminación. Esto lo o- bligará a practicar sus tareas con cuidado y emplear técni- cas que eviten la contaminación del material con que trabaje; solo así, sus resultados serán confiables° Objetivo de la Práctica Demostrar la presencia de microorganismos en diferentes ambientes, la piel, la tierra, el agua, el aire y la saliva° Materiales para la Práctica 1. Tres cajas de Petri .con Agar Nutritivo. 2. Tres cajas de Petri con Agar Sangre. 3. Asas de punta redonda. 4-. Mecheros. 5. Espátulas planas. 6. Pinzas. Procedimiento para la Práctica 1. En las cajas de Agar Nutritivo siembre así: a, Por medio de una pinza previamente flameada, coloque una partícula de tierra sobre el agar y frotela con movimiento circular sobre el a- gar. Rotule la caja con su nombre, fecha y el material que sembró, 34 b. En la segunda caja, tome un poco de agua de lo- do por medio del asa de punta redonda previamen te flameada y siembre en estrías. Rotule la ca ja con su nombre, fecha y el material que sem- c. La tercera caja, déjela abierta durante 15 mi- nutos y luego tápela. Rotule de la misma for- ma que las antLriores. 2. En las cajas de ligar Sangre siembre así: a. Con el asa previamente flameada frote su brazo o la parte posterior de su oreja y siembre en estrías sobre el agar. Rotule. b. Con el asa previamente flameada tome un poco de saliva y siembre en estrías sobre el agar. Ro- tule. c. En la tercera caja, sople fuertemente con la bo- ca sobre el agar. Rotule. 3. Ponga a incubar las cajas durante 24 horas a 37ºC. Transcurrido ese tiempo, observe y deje incubar otras 24 horas a la misma temperatura para obser- var de nuevo. 4. Anote sus resultados en un cuadro. Tome en cuenta lo siguiente: número, característica de la colonia, forma (refiérase al cuadro en el apéndice 1), tantalio y color. Cuestionario 1. ¿Eran todas las colonias iguales? 2. ¿Qué papel importante juegan las bacterias en la saliva? 3. ¿De cuál de las fuentes obtuvo mayor número de colonias? 4. ¿Porqué razón cree usted que hay mayor número de bacte- rias en unos lugares? COLORACIONES 35 PRACTICA VII COLORACIONES SIMPLES Hasta ahora hemos visto la estructura macroscópica de las colonias en los cultivos y los diferentes tipos que po- demos encontrar. Muchas veces el microbiólogo de experiencia puede distinguir con facilidad. ciertos microorganismos por el tipo de colonia. Algunas colonias varían en su forma y tatua no ( Vea apéndice I), también pueden variar en color depen- diendo del medio de cultivo en que se cultiven. Es necesa- rio, sin embargo, distinguir los microorganismos microscópi- , camente a fin de saber su forma, agrupación y aún ciertas estructuras celulares. Para esto se usa la coloración. Las técnicas de coloración pueden ser simples y dife- renciales. Las primeras son útiles para conocer la forma y agrupación de los microorganismos, las segundas para cono- cer partes de la células o de la composición de su pared celular. Objetivo de la Práctica Aprender a hacer un frotis y a colorear con colorantes simples. Materiales para la Práctica 1. Cultivos puros de Staphylococcus epidermidis, Ba- cillus subtilis y Escherichia cola. 2. Colorantes: Safranina y Azul de Metileno de Loe- 'ffler (Vea apéndice F). 3. Pizetas con agua destilada. 4. Portaobjetos limpios. 5. Mecheros. 6. Asas bacteriológicas..( Fig. No. 3 a y b). 7. Microscopio. Procedimiento Para la Práctica 1. Rotule sus láminas con su nombre, la fecha, el mi- croorganismo que va a colorear y el nombre de la coloración. 36 2. Coloque una gota de agua destilada sobre el porta- objetos. ( Fig. No.8 0). 3. Seleccione una colonia aislada del cultivo y tome una parte con el asa previamente flameada. Vea la figura número 3c, 4. Transfiera la parte de la colonia a la gota de agua y haga una emulsión cuidando que no sea muy densa. ( Fig. No. 8 d). 5. Deje secar al aire. 6. Flamee la preparación pasando rápidamente el porta- objetos a unos 10 cros, sobre la llama del mechero, de manera que la parte del frotis quede hacia arri- ba, Repita esto unas dos o tres veces. Esto fija la preparación.( Fig. No. 9 a)0 7. Haga sus frotis en duplicado para usar uno con cada coloración. 8. Repita los pasos 1 al 6 con una colonia de cada cul tivo. 9. Cubra un frotis de cada uno de los cultivos con va- rias gotas de Safranina y déjelos reposar durante un minuto. 10. Lave suavemente con agua destilada y deje secar so- bre una toalla de papel.(Fig. No0 9 b). 11. Cubra el otro frotis de cada uno de los cultivos con varias gotas de Azul de Metileno y déjelos re- posar durante tres minutos. 12. Lave cada frotis suavemente con agua destilada y deje secar sobre una toalla de papel. 13. Observe las preparaciones al microscopio poniendo atención a la forma y agrupación de los microorga- nismos. Use su objetivo seco fuerte. 14. Anote sus resultados en un cuadro indicando el nom- bre del microorganismo, agrupación, coloración y el aumento. 37 d— Haga una emulsión con el agua y la porción de la colonia,exten- diendo un ¿rea adecuada. FIGURA NO 8 38 FORMA DE HACER UN FROTIS a — Portaobjetos b — cubreobjetos c — Coloque una gota de agua estéril sobre el portaobjetos FIGURA 9 39 FORMA DE FIJAR UN FROTIS Y SECARLO a — Fi je al calor de la llama del mechero, pasando su frotis dos o tres veces sobre la llama. Cuide que el lado del frotis quede hacia arriba. b — Deje secar al aire sobre una toalla de papel. Cuestionario 1. ¿Cual es el mecanismo de coloración de los colorantes simples? 2. Cuando se fija el frotis al calor, ¿qué pasa con las bacterias? 3. ¿qué parte de la célula bacteriana se colorea? 14.0 PRACTICA VIII COLORACION DE GRAM Esta coloración fue desarrollada por el bacteriólogo danés Christian Grata, en 1884 (Davis et al.,1973). Es una coloración muy usada en el laboratorio de Microbiología que permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: Gran positivas y Grum negativas, de acuerdo con su capacidad para retener la coloración. Las bacterias que retienen el colorante Cristal Violeta después de haber sido lavadas con el decolorante, son Gran positivas; las bacterias que son decoloradas y se tiñen con el colorante de contraste, son Gram negativas. Debido a es- tas características, las primeras aparecen de color azul y las segundas, de color rojo. El mecanismo de esta coloración está relacionado con la estructura de la pared celular, su grosor, tamano de los poros y propiedades de permeabilidad de la pared intacta. Para explicar el mecanismo de coloración se ha propuesto una teoría de una composición única de la pared celular. Esta teoría postula que las bacterias .que son Gram positivas tie- nen todas una misma composición que-les es común y que las Gram negativas tienen todas otra composición de su pared. Sin embargo, esta teoría no.es satisfactoria ya que algunas levaduras de pared gruesa, que son Gram positivas, tienen una composición química y una estructura de su pared celular diferente de las bacterias Grum positivas (Zinsser, 1972)0 Algunos atribuyen la decoloración de las Gram negativas a su alto contenido de lípidos en la pared celular. Estos lípidos se disuelven con el alcohol, dejando escapar el complejo Cristal Violeta-yodo (Lynch et al.,1972). Se ha demostrado que la pared de los Gram positivos no se tiñe, estrictamente hablando, sino que presenta una "barrera de permeabilidad" a la elución del complejo. El efecto deshidratante del sol- vente organico parece contribuir a la retención del colorante en las Grata positivas, ya que el alcohol al 95% es menos e- fectivo en eluir los metabolitos que el alcohol al 50% (Da- vis et al.,1973). Objetivo de la Práctica Practicar una técnica de tinción diferencial. Materiales para la Práctica 1. Cultivos puros de Staphylococcus epidermidis y Es- cherichia coli. 2. Colorantes: Cristal Violeta y Safranina (apendice F). 3. Fijador: Solución de yodo (apéndice G). 4. Decolorante: Alcohol etílico 95%. También se puede usar alcohol-acetona, apéndice G. 5. Solución de MaliCO3 al 5% (apéndice G). 6. asas bacteriológicas. 7. Mecheros. 8. Pizetas con agua destilada. 9. Portaobjetos. 10. Aceite de inmersión. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus láminas con su nombre, la fecha y el nom bre del microorganismo que va a colorear. 2. Prepare un frotis de cada una de las especies de bacterias° 3. Coloree con Cristal Violeta durante 1 minuto. 4. Agregue 2 gotas de Na11003 al 5%. 5. Lave suavemente con agua destilada. 6. Decolore con alcohol al 95% durante 30 segundos. Esto se puede hacer de dos formas: a. Inclinando el portaobjetos y dejando correr go- tas de alcohol. b. Colocando el porta objetos durante 30 segundos en una jarra de Coplin llena de alcohol. 7. Lave suavemente con agua destilada. 8. Coloree con Safranina durante 30 segundos. 9. Lave suavemente con agua destilada. 14.2 10. Deje secar al aire sobre, una toalla de papel. 11. Observe al microscopio usando el objetivo de inmer- sión. 12. Anote sus resultados. Cuestionario 1. ¿Cuál de las colonias es de bacterias Grata positivas y cuál es de bacterias Gram negativas? 2. ¿Cree usted que solamente por la forma de la colonia pue- de establecerse si las bacterias. son Gram positivas o Gran negativas? 3. qué forma resultaría afectada esta Unción si un cul- tivo es muy viejo? 4-3 PRACTICA IX COLORACION DE ZIEHL NIELSEN Esta coloración fue desarrollada por Ehrlich en 1882. Ziehl en 1882 y Nielsen en 1883, independientemente, modifi- caron el método de Ehrlich y este método es el que general- mente se usa en el laboratorio de Microbiología (Brockman, 1973). Las bacterias del género Mycobacterium tienen un conte- nido de lípidos que representa un 20 a 40, de su peso seco. La abundancia de lípidos es responsable del carácter hidro- fóbico de estos organismos, los cuales se adhieren entre ellos cuando crecen en medios líquidos y tienden a flotar en él. También es responsable de su impermeabilidad a algunas tinciones y de su resistencia a ácidos (Davis et al., 1973) Se ha encontrado que una clase de ácidos grasos, los ácidos micoliticos, son únicos de la pared celular de las micobacterias y también de los géneros Corynebacterium y Nocardia, lo que probablemente las relaciona químicamente. Algunos autores creen que es la estructura física de la pared celular y no la presencia de ácidos micoliticos y lípidos lo que hace a estas bacterias ácido alcohol resistentes. Los géneros Corynebacterium y Nocardia se conocen como ácido al- cohol resistentes parciales ya que solo partes de su células se colorean con esta coloración (Zinsser, 1972). La coloración de Ziehl Nielsen es de importancia en el laboratorio para conocer algunas bacterias patógenas como Mycobacterium tuberculosis causante de la tuberculosis y 11,y- cobacterium lepras causante de la lepra. Objetivo de la Práctica Practicar una técnica de coloración diferencial. Materiales para la Práctica 1. Cultivos puros de: Mycobacterium sp. Nocardia s&, y Staphylococcus epidermidis. 2. Colorantes: Carbofuschina y Azul de Metileno(apéndi- 44 45 ce F). 3. Decolorante: Alcohol ácido hol al 95%. (vea apéndice G) o alco- 4. Portaobjetos limpios. 5. Mecheros. 6. Asas bacteriológicas. 7, Pizetas con agua destilada. 8. Hisopos, 9. Alcohol de quemar. 100 Microscopios. 11. Aceite de inmersión. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus láminas con el nombre del microorganismo, que va a colorear, su nombre, la fecha y la colora- ción. 2. Prepare un frotis de cada uno de los cultivos. 3. Cubra el frotis completamente con carbofuschina. 4. Caliente la preparación con un hisopo impregnado de alcohol de quemar. Mantenga hervor durante un período de 3 a 5 minutos. 5. Lave suavemente con agua destilada. 6. Decolore con alcohol ácido hasta que no quede color en el portaobjetos. 7. Lave suavemente con agua. 8. Coloree con Azul de Metileno durante 30 segundos. 9. Lave suavemente con agua destilada. 10. Seque al aire sobre una toalla de papel. 11. Observe al microscopio con objetivo de inmersión. 12. Anote sus observaciones, las bacterias ácido alco- hol resistentes apareceran de un color rojo fuerte. 13. Las bacterias que no son ácido alcohol resistentes apareceran azules. Cuestionario entiende por ácido-alcohol resistencia parcial? apariencia tienen las colonias de Mycobacterium su resultados obtiene si colorea micobacterias con Gram? 1. •¿,14116 2. ¿,.ué 3. ¿,..¿ué PRACTICA X COLORACION DE CAPSULAS Algunos microorganismos están cubiertos por una estruc- tura amorfa y gelatinosa llamada cápsula. Esta cápsula está compuesta generalmente de polisacáridos o de complejos pro- teína-polisacarido y sirve para protejerlos y, en algunos, determina su virulencia. Las cápsulas de las bacterias pueden ser teñidas con co loraciones negativas y especiales. De las primeras, como la tinta china, se forma una zona más clara entre el medio opa- co y el cuerpo de la bacteria que es más refractivo y está teñido. 'as segundas, es una exposición a anticuerpos cap- sulares que aumenta su tamaño y refractibilidad, llamado "Reacción de Quellum" (Davis et al.,1973). La producción de cápsula por los microorganismos pató- genos es generalmente correlacionada con su virulencia. La pérdida de cápsula, por ejemplo por mutación, cambia el as- pecto de una colonia de apariencia lisa y brillante a una colonia de aspecto rugoso, en el medio de cultivo. Este cam bio se correlaciona con la pérdida de virulencia y facilita la destrucción de las células por los fagocitos (Zinsser, 1972.). Objetivo de la Práctica Practicar una técnica de coloración negativa para cáp- sulas. Materiales para la Práctica 1. Cultivos puros de Escherichia coli, StreEtococcus 2neumoniae y Klebsiella pneumoniae. 2. Colorantes: Rojo Congo en suero al 107), tinta china, Azul de Metileno (Vea apéndice F). 3. H01 al l%. 40 Alcohol metilico con 0.2% de ácido acético. 5. Portaobjetos. 6. Asas bacteriológicas. 4-7 4-8 7. Pizetas con agua destilada. 8. Mecheros. 9. Microscopios. 10. Aceite de Inmersión. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus láminas con su nombre, fecha, nombre del microorganismo y la coloración. 2. Coloque una pequena gota de tinta china en el porta- objetos. 3. Coloque con el asa una porción del cultivo sobre la tinta china. L. Extienda esta mezcla cultivo-tinta china con el asa a fin de dejar una capa delgada; deje secar al aire. 5. Fije la preparación con alcohol durante 1 minuto. 6. Lave suavemente con agua destilada. 7. Seque sobre una toalla de papel. 8. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión. 9. Anote sus resultados. La cápsula aparecerá como un halo claro alrededor de la bacteria. Existen otros procedimientos para tinción de cápsula (Broc- man, 1973)0 1. Rotule sus láminas. 2. Coloque una pequeña gota de Rojo Congo en suero al 10% sobre el portaobjetos. 3. Coloque con el asa una porción del cultivo sobre el colorante. L. Extienda la mezcla con el asa a fin de hacer un fro tis delgado. 5. Fije al calor, pasando su preparación sobre el meche ro. 6. Cubra el frotis con 11C1 al 1% durante 5 a 10 segun- dos y luego escúrralo. 110 LO LAVE. 7. Deje secar al aire. 8. Coloree con Azul de Metileno durante 1 minuto. 9. RO LO LAVE, solamente escúrralo y deje secar al aire. .10. Observe al microscopio y anote sus resultados. Cuestionario 1. ¿4ué factores aceleran o ayudan a producir cápsula en al gunas bacterias? 2, ¿Qué factores restringen la producción de 'cápsula? • 3. ¿Por qué el Rojo Congo es usado como coloránte negativo? 4. ¿4111, cambios sufre el Rojo Congo cuando se agrega HC1? 5. Investigue sobre las propiedades antifagociticas de la cápsula. PRACTICA XI COLORACIOH DE ESPORAS En condiciones ambientales desfavorables algunas bacte- rias forman estructuras especializadas llamadas esporas. Los géneros que generalmente forman esporas son Bacillus y Clos- tridium. Al igual que las semillas de las plantas superiores las esporas son criptobióticas (no tienen actividad metaboli- ca) y son resistentes al calor, al frío, a la toxicidad de ciertas sustancias químicas y a la radiación (Davis et al., 1973). La capa que cubre las esporas esta hecha en un 80% de una proteína parecida a la queratina. Esta proteína es inso luble a menos que sus numerosos enlaces S-S se rompan, is esta capa de proteína la responsable de la resistencia de las esporas a ciertos colorantes y a algunos compuestos químicos. También la presencia de una gran cantidad de dipicolinato de calcio y el hecho que son deshidratadas contribuyen a su re- sistencia al calor (Davis et al., 1973) 0 Objetivo de la Práctica Practicar una técnica de coloración de esporas llamada de Schaeffer y Fulton (Davidson and Henry, 1974). Materiales para la Práctica 1. Cultivos de 48 horas de Bacillus subtilis y Clostri- dium perfringens0 2. Colorantes: Verde de Malaquita en solución acuosa al 5% y Safrenina en solución acuosa al 0.5%.(vea apéndice F). 3. Portaobjetos limpios. 4. Hisopos. 5. Alcohol de quemar. 6. Mecheros. 7. Asas bacteriológicas, 8. Microscopio, aceite de inmersión. 50 Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus láminas con su nombre, fecha, coloración y nombre dól microorganismo que va a colorear, 2. Prepare un frotis de cada une de los cultivos y fi- je al calor. 3. Cubra sus frotis con Verde de Malaquita y caliente con un hisopo impregnado con alcohol de quemar, 4. Deje actuar el colorante tres minutos adicionales. 5. Lave suavemente con agua. 6. Aplique solución de Safranina durante 30 segundos. 7. Lave suavemente con agua destilada. 8. Deje secar sobre una toalla de papel. 9. Observe al microscopio con lente de inmersión. 10. Las esporas apareceran de color verde y el resto de la célula de color rojo o rosado. Anote sus resul- tados. Cuestionario 1. ¿Se consideran las esporas estructuras reproductoras? 2. ¿Cuál es el objeto de calentar la lámina? 3. Si quisiera dar una demostración de producción de espo-. ras, ¿en qué clase de medio de cultivo las sembraría? 4. ¿Porqué solo Bacillus y Clostridium esporulan? 51 PRACTICA XII COLORACION DE FLAGELOS Entre los diferentes grupos de bacterias existen algunas inmóviles, como por ejemplo la mayoría de los cocos y algunos géneros de bacilos. Cuando existe movilidad, generalmente es mediada por un flagelo, organelo formado por hilos muy finos de proteína con una estructura helicoidal, que salen del citoplasma de la célula bacteriana (Stainer, 1970). Las bacterias flageladas tienen generalmente sus flage- los polares o bien alrededor de la célula. Los flagelos po- lares del orden Pseudomonadales pueden estar colocados en un solo polo, se les llama monotricos; pueden tener un gru- po de flagelos en un solo polo, se les llama lofotricos; un flagelo en cada polo, se les llama anfitricos. Los miembros del orden Eubacteriales tienen sus flagelos alrededor de to- da la superficie de la célula y se les llama peritricos (Zin- sser, 1972). Los flagelos pueden observarse con el microscppio ópti- co por medio de coloraciones especiales. Aunque el procedi- miento varia en detalle, siempre tiene el mismo principio. Las células fijadas son tratadas con un mordiente: una solu- ción inestable que precipita una capa de material teñible sobre el flagelo (Stainer, 1970). Esto es seguido de la aplicación de un colorante. La coloración de flagelos más usada en el laboratorio es la originada por Leifson, la cualucontiene el mordiente y el colorante en una misma solución. En algunos casos se usa como colorante el acetato de pararosanilina (Lynch et al., 1972), y en otros la Fuschina básica (Davidson y Henry, 1974). En ambos casos se usa el ácido tánico el cual parece hacer las proteínas insolubles (Cram y Hammond, 1964). Objetivo de la Práctica Practicar una técnica de coloración de flagelos y obser var su posición en diferentes tipos de bacterias. 52 Materiales para la Práctica 1. Cultivos de Proteus vulgaris, Pseudomonas aerugino- sa, Bacillus subtilis y Salmonella sp. 2. Colorante de Leifson (vea Apéndice F). 3. Portaobjetos limpios y conservados en alcohol al 95% hastael momento de usarse. 4. Asas bacteriológicas. 5. Pipetas de Pasteur. 6. Pipetas de 1 ml. estériles. 7. Mecheros. 8. Formalina al 40%. 9. Microscopio. 10. Aceite de inmersión. Procedimiento para la Práctica 1. Coloque 1 ml. de formalina al 40% en el tubo de un cultivo. 2. Agite suavemente. 3. Tome un poco de esta suspensión con el asa y coló- quelo sobre un portaobjetos limpio. 4. Extienda suavemente sobre el portaobjetos y deje secar al aire. NO FIJE AL CALOR. 5. Rotule la lámina con su nombre, la fecha y el nom- bre del microorganismo que va a colorear. 6. Coloque varias gotas del colorante de Leifson sobre el frotis y déjelo actuar durante 10 minutos. 7. Lave suavemente con agua usando una pipeta de Pas- teur, sin quitar antes el colorante. 8. Si lo desea, puede anadir un colorante de contras- te como el Azul de Metileno. 9. Deje secar al aire sobre una toalla de papel. 10. Observe al microscopio con objetivo de inmersión y anote sus resultados. 11. Repita estos pasos con todos los cultivos. Cuestionario 1. Describa la estructura y composición química de los fla 53 gelos bacterianos. 2. ¿En qué forma se diferencian los flagelos de las bacte- rias de otros tipos de flagelos? 3. ¿Por qué no fijarnos al calor? 4. ¿Alié diferencia hay entre peritrico y atrito? 51+ BACTER IAS 55 PRACTICA XIII MOVILIDD DE LAS BACTERIAS El movimiento de las bacterias puede ser de tres formas: por flagelos, por deslizamiento y por movimiento rotatorio. Estos movimientos las ayudan a desplazarse en su habitat o bien en los medios de cultivo. Existen varios métodos por medio de los cuales se puede observar el movimiento bacteriano. Uno de estos métodos es el de observar un tipo de movimiento denominado "swarming" o crecimiento esparcido, que se puede observar a simple vista en una placa de agar. Otro método es de gota pendiente, en la cual se puede ver la movilidad en vivo. En un medio semi sólido se puede observar también crecimiento esparcido hacia los lados de la línea de inoculación. ( Fig. No.10 b) Objetivo de la Práctica Estudiar varios métodos de observación del movimiento bacteriano. Materiales para la Práctica 1. Cultivos en caldo de Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella sp. y Bacillus subtilis. 2. Láminas portaobjetos excavadas. 3. Cubreobjetos. 4. Tubos de ensayo de 13 X 100 mm. con 10 ml. de agar semisólido (vea apéndice A). 5. Cuatro placas de agar sangre. 6. Asas bacteriológicas. 7. Vaselina. 8. Mecheros. 9. Microscopio. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus placas de agar y sus tuboscOn su nombre, la fecha, tipo de microorganismo que va a sembrar en cada una y nombre del medio de cultivo. 56 2. Tome con el asa una porción del cultivo y siembre en estrías en una placa de Algar Sangre, 3. Tome un poco del mismo cultivo con el asa de punta recta y siembre en el altar sémisólidp haciendo una sola punción en línea recta.( Fig. 1p. 10 a). 4. Ponga a incubar durante 24 horas a 37 2c. 5. Tome con el asa una porción de un cultivo y coloque en un cubre objetos. 6. Invierta la lámina y colóquela sobre la lámina ex- cavada en la cual ha puesto ya una película de va- selina líquida alrededor de la excavación. 7. Observe al microscopio, en seco fuerte. 8. Repita estos 6 pasos con las cuatro cepas y anote sus resultados en un cuadro. Cuestionario 1. ¿Observó movilidad en todas las cepas? 2. ¿En cuál de las cepas observó "swarming"? 3. ¿En qué condiciones ambientales encontraría usted bacte- rias móviles más fácilmente? 4. ¿Cuál es el objeto de poner vaselina en la lámina exca- vada? 5. ¿Cuál de las cepas diría usted que posee flagelos? 57 FIGURA No 10 58 FORMA DE SEMBRAR PARA LA PRUEBA DE MOVILIDAD a En medios semisolidos para la prueba de movilidad, pique hasta la mitad del agar b — Posibles resultados Microorganismo Microorganismo Microorganismo anaerobio móvil aerobio móvil aerobio no móvil PRACTICA XIV LICULFACCION DL LA GELATINA Entre los métodos para identificar los tipos de bacterias está el que se basa en la propiedad que tienen algunas de ellas de hidrolizar o licuar la gelatina. Las bacterias dela familia Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae y los anaero- bios, especialmente Clotridium, tienen esa propiedad (Bla- zevic, 1975). La gelatina es derivada del colágeno, siendo el coláge- no una proteína insoluble que puede licuarse por calentamien to; al enfriarse, se convierte en gelatina. Las estructuras del colágeno y de la gelatina son similares y ambas sustan- cias difieren sólo en su estructura física (Blazevic, 1975), La gelatina es hidrolizada por la enzima gelatinasa de varios tipos de bacterias. Después de ser hidrolizada en sus aminoácidos componentes, ya no vuelve a su estado de gel ni aún a temperaturas muy bajas. Existen varios métodos para demostrar la producción de gelatinasa. Algunos métodos han probado ser útiles para el trabajo con ciertos tipos de bacterias, en tanto otros méto- dos han resultado eficaces para otros tipos. Por ese motivo ninguno de los métodos es universal para todos los tipos ni es siempre posible reemplazar un método por otro (Blazevic, 1975). Objetivo de la Práctica Practicar un método para demostrar la producción de gelatinasa por algunas bacterias. Materiales para la Práctica 1. Cultivos de 24 horas de Escherichia cola, Proteus vulgaris y Bacillus subtilis. 2. Ocho tubos de 13 X 100 mm. con 10 ml. de Agar Nu- tritivo con 0.4% de gelatina. 3. Ocho cajas de Petri con agar Nutritivo con 0.4% de gelatina. 59 60 4. Solución de HgCl 0.5M.(fea apéndice G). 5. 1 pipeta de Pasteur. 6. Mecheros. 7. Asas bacteriológicas. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus cajas y sus tubos con su nombre, la fecha, el tipo de microorganismo que va a sembrar, y el tipo de medio que esta usando. 2. Inocule dos de los tubos de hgar Nutritivo con ge- latina por el método de punción con cada una de las cepas. 3. Guarde dos tubos cono control. 4. Siembre dos cajas de Agar Nutritivo con gelatina con cada una de las cepas. 5. Guarde dos cajas sin inocular como control. 6. Ponga a incubar los tubos y las cajas sembradas durante 48 horas a 302C. 7. Después de transcurrido el tiempo de incubación co- loque los tubos en refrigeración durante 1 hora y luego observe. Si ha licuefacción de la gelatina el medio no se solidificará con la refrigeración. 8, En las cajas de altar, ponga un chorro de HgC12 por medio de una pipeta de Pasteur. Espere 10 mi- nutos. 9. Si hay licuefacción de la gelatina se formará una zona- clara'airededor de las colonias. 10. Si no hay licuefacción de la gelatina se formará un precipitado opaco alrededor de las colonias. Cuestionario 1. ¿i(.116 beneficios obtienen las bacterias de la licuefac- ción de la gelatina? 2. Discuta otros medios para practicar esta prueba y su u- tilidad ( Ref. Blazevic, 1975). 3. ¿Qué sustancias inhiben la licuefacción de la gelatina? 4. ¿A qué se debe la formación de la zona clara alrededor de la colonia? PRACTICA 'XV PHODUCCION DE CATALASA La prueba de la catalasa ha sJxio utilizada por muchos años como ayuda para distinguir, principalmente, los géneros Staphylococcus y Streptococcus (Blazevic, 1975) En el metabolismo aeróbico se produce H202 tanto como H2 O debido a que el oxigeno es el aceptor final de hidrógenos en la cadena respiratoria. Si el peróxido de hidrógeno se acumula en el medio lleva a la muerte de las bacterias ya que es un agente oxidante muy fuerte. Las bacterias aerobias producen la enzima catalasa la cual media en el rompimiento del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno(Brockman, 1973). La reacción se expresa simplemente así: catalasa 2H2O2 > H2O + 02 Se ha investivado el rango de la concentración de per- óxido de hidrogeno que debía usarse en esta prueba y se en- contró que la mejor concentración es de 3% (Blazevic, 1975). También se han investigado diferentes formas de hacer esta prueba; y es igualmente posible hacerla en un asar que no contenga sangre o bien en un portaobjetos (Blazevic, 1975). El uso de altar que contenga sangre puede llevar a una reacción positiva falsa ya que la enzima catalasa se ha ais- lado do glóbulos rojos. El uso de asas que contengan hierro también puede llevar a una reacción positiva falsa. Objetivo de la Práctica Practicar una técnica simple de poner de manifiesto la producción de catalasa en algunas bacterias. Materiales para la Práctica 1. Cultivos en Agar Nutritivo de: Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis Streptococcus sp. y Clostridium sporogenes. 2. Peroxido de hidrogeno diluido al 3%. 3. Portaobjetos limpios. 61 4. Asas bacteriológicas.de platino. 5. Mecheros. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus láminas con su nombre, fecha y el el mi- croorganismo que va a usar. 2. Coloque una gota de paró:II:Ido de hidrógeno sobre un portaobjetos usando un gotero. 3. Tome con el asa una porción de un cultivo bien desa rrollado. 4. Coloque la porción del cultivo sobre la gota de per óxido de hidrogeno y observe. La producción lame- diatade burbujas indica una racción positiva. 5. Esta prueba también puede hacerse colocando las go- tas de peróxido do hidrógeno sobra una colonia bien desarrollada en el cultivo. 6. Repita estos pasos con cada uno de los cultivos. 7. Anote sus resultados en un cuadro. Cuestionario l. ¿Por qué no podemos usar cultivos de ajar sangre para esta prueba? '29 Explique el proceso de oxidación. 3. Explique el proceso de fermentación, 4. ¿Cómo podría explicar la reacción de catalasa con el peróxido de hidrógeno en dos pasos de oxidación y de reducción? 62 PRACTICA XVI METABOLISMO BACTERIANO, ACCION SOBRE CaliBOHIDRATOS Cada tipo de microorganismo dispone de ciertas enzimas y su capadidad de metabolizar carbohidratos depende de la presencia de ellas. El patrón de utilización de los carbohi dratos por los microorganismos resulta ser altamente especí- fico para determinados géneros, especies u otros grupos ta- xonómicos; y esta especificidad es muy útil para identificar microorganismos. Se pueden observar cuatro tipos de reacciones cono re- sultado del uso de carbohidratos »or los microorganismos: 1) oxidación; 2) fermentación; 3) no fermentación; y I) no oxidación. Los organismos oxidadores producen ácido y gas en pre- sencia de oxigeno; los organismos fermentadores producen á- cido y gas en ausencia de oxígeno. La producción de ácido se pone de manifiesto incluyendo un indicador en el medio el cual cambia su color con el cambio de pH. La producción de gas se pone de manifiesto recolectándolo por medio de una campanilla do Durham invertida colocada en el .aedio de cul- tivo; si hay producción de gas, esta campanilla tendrá bur- bujas. Uno de los indicadores más usados es el Rojo de Fenol, el cual es rojo a un pH neutro y amarillo cuando hay presen- cia de ácido. El Azul de Bromotimol que es verde cuando el el pH es neutro y amarillo cuando hay presencia de ácido. Vea la tabla de indicadores en el apéndice H. Para lograr anaerobiosis (es decir ausencia de oxígeno) se colocan sobre la superficie del cultivo en tubos 2 ml. de aceite mineral estéril, lo que impide el contacto con la at- mósfera. Objetivo de la Práctica Determinar la utilización de carbohidratos por ciertos 63 microorganismos y algunos de sus productos finales. Materiales para la Práctica 1. Cultivos de 24 horas de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Shigella sp., Pseudomona aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Salmonella sp., y Staphylo- coccus aureus. 2. Tubos de ensayo de 16 X 150 mm. con 10 ml. de; 16 tubos con caldo glucosado 16 tubos con caldo lactosado 16 tubos con caldo sacarosado Todos los tubos deben contener Rojo de Fenol como indicador y campanilla de Durham invertida. 3. Aceite mineral estéril. 4. Asas bacteriológicas. 5. Mecheros. Procedimiento para la Práctica 1. Identifique cada tubo con el nombre del medio que que contiene, el nombre del microorganismo que va a sembrar en él,,su nombre, y la fecha. 2. Inocule cada una de las siete cepas en dos tubos con caldo glucosado. 3. Deje dos tubos como control. 4. Separe los tubos en dos grupos, cada grupo con las siete cepas diferentes. 5. Repita estos pasos con los otros medios. 6. En un grupo, coloque 2 ml. de aceite mineral esté- ril. 7. Ponga a incubar durante 24 horas a 37s2C. 8. Anote sus resultados en un cuadro, indicando si hay producción de gas o no; si hay producción de ácido o no. Anote su interpretación y sus conclusiones. Cuestionario 1. ¿Qué otros indicadores podríamos usar en este ejercicio y cuál seria su color con los cambios de pll? 2. Explique que es respiración. 64. 3. Explique qué es fermentación. t. ¿¿ué otro método podría usarse para detectar producción de gas? 65 PRACTICA XVII EL CICLO DEL AZUFRE Y LA PRODUCCION DE HIDROGENO SULFURADO El elemento azufre es un elemento esencial en la mate- ria viva y es abundante en la corteza terrestre, siendo dis- ponible a los organismos vivos en forma de sulfatos solubles. La utilización de sulfatos para síntesis de constituyentes u celulares y la descomposición subsecuente de estos compuestos resulta en la formación de H2S. La formación de hidrógeno sulfurado en la naturaleza es resultado de la descomposición anaerobia de algunas bacterias (llamada bacterias del azufre) que utilizan el azufre como agente oxidante. La actividad de estas bacterias es particularmente aparente en el lodo y en el fondo de los estanques. El color negro del lodo se de be a la formación de un precipitado negro del H2S con sales de metales que también se encuentra en él. Las bacterias reductoras del azufre juegan un papel importante en el ciclo del azufre ya que el H2S al oxidarse de nuevo forma S el cual puede ser oxidado de nuevo para formar sulfatos los cuales son utilizados nuevamente por las plantas y animales. (Stainer et al.,1974)0 La producción de hidrógeno sulfurado se puede poner de manifiesto en el laboratorio utilizando compuestos sulfura- dos orgánicos o inorgánicos en el medio de cultivo. La pro- ducción de H2S a partir de compuestos orgánicos sulfurados se cree que es debida a la presencia de una enzima, cisteina desulfihidrasa, la cual actúa sobre la cisteina presente en las peptonas. La reacción se representa así: HSCH2CH(14112)COOH i H2S + NH3 + CH2C000OH cisteina ácido pirúvico (Blazevic, 1975) 66 67 La producción de H2S a partir de compuestos inorgáni- cos sulfurados probablemente se debe a la presencia de otra enzima, posiblemente reductasa tiosulf¿tica y de un agente reductor donador de hidrógenos. La reacción se representa así: S203 211 > S0 3 + H2 S (Blazevic, 1975) Para detectar la producción de H2S en el laboratorio se utilizan sales de metales pesados como el plomo, el bismuto o el hierro. Las más recomendadas son las sales de hierro usadas en combinación con el agar de triple azúcar (TSI) las cuales forman un precipitado negro cuando hay formación do H2 (Blazevic, 1975). Objetivo de la Práctica Practicar una prueba para determinar ciertas caracterís y ticas de fermentación de azucares, producción de H2S y pro- dupción de gas debida a la fermentación rápida de los azuca- res. Materiales para la Práctica 1. Cultivos de 24 horas de Escherichia coli, Proteus vulgaris, Saluonella sp. y Arizona sp. 2. Cuatro tubos de 13 X 100 mm. con 10 ml. de agar TSI inclinado. 3. Asas bacteriológicas de punta recta. 4. Mecheros. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus tubos con su nombre, fecha, tipo de medio, y el nombre del microorganismo que va a sembrar. 2. Siembre cada una de las cepas en el agar TSI usando la técnica de punción hasta el fondo y de estrías en el inclinado. (Fig. ido. 6 b). 3. Ponga a incubar durante 24 horas a 372C. L. Después del período de incubación, observe sus re- sultados y anótelos en un cuadro. 68 5. Haga su cuadro de resultados tomando en cuenta lo siguiente: a. Producción de hidrógeno sulfurado, la formación de un color negro en el medio. b. Fermentación, cambio de color del indi cador, ya sea sólo en el fondo o en todo el agar. c. Producción de gas, se manifiesta por rompimiento , del altar. Cuestionario 1. ¿Por qué los organismos que fermentan la Glucosa produ- cen gas solamente en el fondo del tubo? 2. Explique la composición del medio TSI y lo que indican sus resultados. 3. Mencione otros indicadores para detectar la producción de H2S. 4. E. coli no produce H2S en el medio de TSI, pero puede producirlo en un medio que contenga grandes cantidades de cistina. Explique. 5. Haga un esquema del Ciclo del Azufre y explique en 61 el papel que juegan las bacterias. PRACTICA XVIII DETERMINACION DE UN PRODUCTO.DEL METABOLISMO DE PROTEINAS POR LA PRUEBA DE INDOL La mayoría de los medios de cultivo tienen peptonas las cuales, al ser utilizadas por los microorganismos como fuen- tes de nitrógeno, liberan aminoácidos. La triptona es una peptona que tiene alto contenido de triptofáno (ecuación Ia). Algunas bacterias actúan sobre éste aminoácido por medio de un proceso enzimatico, dando lugar a la producción de indol (ecuación Ib), ácido pirúvico (ecuación Ic) y amoniaco (ecua- ción Id). .l indol producido por el microorganismo puede ser detec tado por medio de diferentes reactivos, pero para todos los reactivos la reacción química básica es siempre la misma. Uno de los reactivos empleados es el p-dimetil-amino-benzal- debido (ecuación IIb), el cual reacciona con el indol para formar un colorante rojo. De los reactivos usados para este trabajo, el más usado es el reactivo de Kovacs (vea apéndice G) (Blazevic, 1975). La reacción básica para la detección de indol se basa en que cuando en presencia de calor, se mezclan un pirrol (indol benzopirrol) y una solución alcohólica débil de para-dimetil- amino-benzaldehido, se desarrolla un producto de color rojo. La misma reacción ocurre sin necesidad de calentamiento cuan- do el reactivo se hace con HC1 concentrado. El mecanismo de la reacción se representa por las siguientes ecuaciones: 69 Ecuación I. Fl b. indol CH2CH(NI2)COOR a. triptofáno + CH 3 CCOOH + NH 3 triptofanasa c. ácido d. amoniaco piruvico Ecuación II. 70 CHO N II N(0113)2 a. indol b. p-dimetil- amino-benzal- dehido N(C113)2 c. colorante rosindol Objetivo de la Práctica Practicar una prueba usada en el laboratorio para deter minación de producción de indol por las bacterias. Materiales para la Práctica 1. Cultivos de 24 horas de Escherichia coll y Entero- bacter aerogenes. 2. Tres tubos de 13 X 100 mm. con 10 ml. de caldo MR-VP(vea apéndice B). 3. Asas bacteriológicas. 4. Reactivo de Kovacs (vea apéndice G). 5. Mecheros. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus tubos con su nombre, la fecha, nombre del microorganismo que va a sembrar y el nombre del me- dio. 2. Siembre cada uno de los microorganismos en un tubo de caldo. 3. Deje un tubo sin sembrar como control. 4. Ponga a incubar durante 48 horas a 3720. 5. Agregue a cada uno de los tubos 10 gotas de reacti- vo de Kovacs. 6. Agite suavemente hasta mezclar (1 minuto) y deje en reposo hasta que el reactivo se separe y ocupe la parte superior del medio. 73. 7. La presencia de indol se reconoce por un color rojo en la parte del reactivo después de que éste se ha separado . No torne en cuenta un resultado positivo después de 10 minutos de haber agregado el reactivo. . 8. Anote sus resultados en un cuadro. Cuestionario 1. ¿Conoce usted algunos otros aminoácidos que contengan el anillo de indol? 2. ¿Cuál es la composición del reactivo de Kovacs? 3. Mencione otros procedimientos para detectar indol. PRACTICA XIX DETERMINACION DE ALGUNOS PRODUCTOS FINALES DEL METABOLISMO ANAEROBIO POR MEDIO DE LA PRUEBA DEL ROJO DE METILO Cuando las bacterias de los Géneros Lscherichia y En- terobacter son cultivadas en presencia de una cantidad igual de dextrosa, los productos finales de su metabolismo anaero- bio son diferentes. Las bacterias del género Escherichia forman ácidos hasta alcanzar un pH de 4 ó 5 y en ese punto las bacterias cesan su actividad. En cambio, las bacterias del género Enterobacter alcanzan un pH de 4 ó 5, pero conti- núan su actividad hasta que el medio alcanza un pH de 6 6 7 (Blazevic, 1975) La explicación de esta diferencia entre los dos géneros es debida a que las bacterias del género Escherichia produ- cen gran cantidad de ácidos en la fermentación de lu glucosa, mientras que las bacterias del género Enterobacter producen ácidos, pero la mayor parte de sus productos finales de fer- mentación son compuestos neutros como butilen-glicol y eta- nol. En condiciones aerobias, ambos géneros tienen el po- tencial de utilizar sus productos ácidos en su metabolismo, pero la cantidad de ácido producido por el género Escherichia es muy grande (Blazevic, 1975). En la estandarización de esta prueba son importantes la concentración de dextrosa, el tiempo de incubación y lá tem- peratura. El medio conocido como MR-VP es el usado ahora pa ra esta prueba y se recomiendan 5 días de incubación a 302C. Se emplea el Rojo de Metilo como indicador ya que tiene la propiedAd de permanecer rojo a un p11 de 4 6 5 y cambia a a- marillo para valores de pH entre 6 y 7. Objetivo de la Práctica Practicar un método para demostrar los productos fina- les del metabolismo anaerobio de dos tipos de bacterias. 72 73 Materiales para la Práctica 1. Cultivos de 24 horas de Escherichia coli y Entero- bacter aerogenes. 2. Tres tubos de 13 X 100 mm. con 10 ml. de caldo MRVP. 3. Asas bacteriológicas. 4. Indicador Rojo de Metilo (vea apéndice G). Mecheros. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus tubos con su nombre, la fecha, el nombre del microorganismo que va a sembrar y el medio. 2. Siembre cada uno de los microorganismos en un tubo. 3. Deje un tubo sin sembrar como control, 4. Ponga a incubar durante 5 días a 30200 5. Agregue 5 gotas del indicador Rojo de Metilo en cada uno de los tubos. 6. Anote sus resultados en un cuadro, indicando una reacción positiva (+) si el color es rojo o una reac- ción negativa (-) si el color es amarillo. Cuestionario 1. Mencione otros indicadores que podrían usarse en esta prueba. 2. ¿Qué ácido se produce en la fermentación de la Glucosa? 3. ¿qué significa tener el potencial de utilizar sus produc- tos finales de fermentación? 4. ¿Por qué es necesario tanto tiempo de incubación a esa temperatura? PRACTICA XX DETERAINACION JE ALGUNOS PRODUCTOS INTLRÑLIDIOS DEL HETABOLISMO ANAEROBIO P011 LIDIO DE LA PHULLA DL VOGUES PROSKAUER: Como vimos en la práctica anterior, los organismos que tienen la habilidad de fermentar la glucosa pueden tener diferentes tipos de productos finales de dicha fermentación. la fermentación con producción de una mezcla de ácidos es característica del género Escherichia. La fermentación con producción de butileno-glicol es característica del género • Enterobacter La prueba de Vogues-Proskauer pone de manifiesto la presencia de butileno-glicol por medio de una reacción de co lor de un intermediario de su formación: el acetil-metil - carbinol. La ecuación I muestra la reacción total de glu- cosa a butileno Glicol. La ecuación II muestra como el ace- til-metil-carbinol, en un medio alcalino, se oxida a diaceti lo. El diacetilo produce un color rojo solamente en presen- cia de creatina la cual provee grupos de guanidina (Blazevic, 1975). Esta reacción se representa en la ecuacion III. La adición de alfa-naftol solamente intensifica el color. Ecuación I. Ó H É Ó d - ó 0 O ti - CH > CH - C - C - CH 3 3 II Glucosa Acetilmetilcarbinol H CH -C ó H 3 4 ó 3 É Butileno-glicol 74 75 Ecuación II. k y CH - c 3 FI - CH 3 02 9 3 - c - KOH Acetilmetilcarbinol Diacetilo Ecuación III. Diacetilo + H2N - O N - CH2COOH ----3 Complejo rojo CH3 Creatina Objetivo de la Práctica Practicar,una prueba para demostrar la presencia de un intermediario de la producción de butileno glicol en la fer- mentación de la glucosa. Materiales para la Práctica 1. Cultivos de 24 horas de Escherichia coli y Entero- bacter aerogenes. 2. Tres tubos de 13 X 100 mm. con 10 ml. de caldo Mil- VP. 3. Frascos gotero con KOH al 40 %. 4. Frascos gotero con Alfa naftol. al 5% solución alcoholica. 5. Asas bacteriológicas. 6. Mecheros. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus tubos con su nombre, la fecha, el nombré del microorganismo que va a sembar y el medio. 2. Siembre cada uno de los tubos con una cepa. 3. Deje el tercer tubo como control. 4. Ponga a incubar durante 48 horas a 37°C. 5. Agregue 10 gotas de KOH a cada uno de los tubos. 6. Agite suavemente durante 1 minuto. 7. Agregue 10 gotas de Alfa naftol. 8. Agite suavemente duarante 1 minuto. 9. Ll desarrollo de un color rojo indica una reacción positiva. 10. Anote sus resultados en un cuadro. Cuestionario 1. ¿Cuales son los productos fianles de la fermentación ácida? 2. ¿Por qué incubarnos solamente 48 horas en vez de 5 días como en la prueba anterior? 3. ¿Cuál es la razón de agitar el tubo despues de agregar los reactivos? 76 77 PRACTICA XXI UTILIZACIOLi DE CITRATO La habilidad de ciertos microorganismos para utilizar el citrato de sodio como única fuente de carbono es una prue ba muy útil para su identificación. Esta prueba es la últi- ma de una serie de pruebas (Indol, Rojo de Metilo, Vogues- Proskauer) conocidas en conjunto como la prueva IMViC muy útil para distinguir entre los géneros Escherichia y Entero- bacter. Hoppe y Seyler en 1679 (Blazevic, 1975) fueron los pri- meros en sugerir que las sales de ciertos ácidos orgáncos po drían ser convertidas en carbonatos alcalinos por las bacte rías. Ayers y Rupp en 1915 enfocaron sus investigaciones ha cia las reacciones alcalinas producidas por algunas bacterias, que no podían ser explicadas por producción de amoniaco o sustancias básicas productos del metabolismo de proteínas. Fue Simons en 1926 quien desarrolló un medio sólido con ci trato como fuente de carbono y utilizó un indicador, el Azul de Bromotimol, que es azul a un pll de 7.6 y verde a un pH de 6.8 (Blazevic, 1975). La reacción exacta producida por los organismos que utilizan el citrato todavía no es bien conocida. Aparente- mente, esta reacción ocurre por un exceso de bióxido de car- bono generado en la descomposición de citrato a oxaloacetato el cual es descarboxilado a piruvato y bióxido de carbono. El exceso de bióxido de carbono se puede combinar con sodio y agua para formar carbonato de sodio que es suficientemente alcalino para subir el pR (Blazevic, 1975). Objetivo de la Práctica Practicar una prueba que pone de manifiesto la habili- dad de ciertas bacterias de utilizar el citrato como única fuente de carbono. Materiales para la Práctica 1. Cultivos en agur de Escherichia coli, Enterobacter 78 aerogenes. 2. Tres tubos de 16 X 125 mm. con 10 ml. de Altar Citra to de Simmons, inclinado (Vea apéndice a). 3. Asas bacteriológicas. 40 Mecheros. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus tubos con su nombre, la fecha, el nombre del microorganismo que va a sembrar y el medio. 2. Siembre cada uno de los organismos en un tubo por medio del método de estrías en el altar inclinado. 3. Deje el tercer tubo sin sembrar como controlo 4. Ponga a incubar durante 48 horas a 72 horas a 372C. 5. Observe cada 24 horas. 6. Anote sus resultados en un cuadro. Si el medio per manece verde es una reacción negativa, si el color del medio cambia a zul, indica una reacción positiva. Cuestionario 1. ¿Por qué el metabolismo de las proteinas da productos al calinos? 2. ¿Por qué el medio de Simons no tiene peptonas? 3. Investi¿ue otros métodos para determinar la utilización de citrato por las bacterias. PRACTICA XXII EL CICLO DEL NITROGENO Y LA REDUCCION DE NITRATOS A NITRITOS Muchos tipos de bacterias pueden utilizar el nitrato en vez de oxígeno como aceptor final de hidrógenos en la ca- dena respiratoria. Cuando la materia orgánica se descompone en la tierra y las condiciones se vuelven anaerobias como ro sultado de la respiración bacteriana o microbiana, cualquier nitrato que esté presente tiende a ser reducido. Este pro- ceso se le llama denitriTicación. En la naturaleza el pro- ceso es rápido y generalmente el producto final es nitrógeno gaseoso el cual escapa a la atmósfera. Existen bacterias que fijan el nitrógeno gaseoso directamente de la atmósfera, por ejemplo, Rhizobium. También existen bacterias que oxidan el amoníaco a nitritos, por ejemplo Nitrosomas y otras que oxidan los nitritos a nitratos como Nitrobacter (Stainer, 1975). Parte de este proceso que ocurre en la naturaleza es u- tilizado en el laboratorio para identificación de algunas bacterias o bien para poner de manifiesto esta actividad me- tabólica de las bacterias. El cultivo de bacterias fijadoras de nitrógeno gaseoso in vitro es muy dificil.' Las bacterias son capaces de reducir los nitratos a ni- tritos en varias formas. Una forma es asimilación por la cual el nitrato es reducido a amoníaco, con el nitrito como inter mediario. El amoníaco producido es usado para síntesis de a- mino ácidos y otros compuestos nitrogenados. Otro proceso, llamado disimilación o respiración, es usado por los microor- ganismos primeramente para obtención de energía. En este ca- so, el nitrato es el receptor final de elctrones en ausencia de oxígeno. J-ste proceso permite a algunos aerobios facul- tativos crecer en anacrobiosis (Blazevic, 1975). Para determinación de nitritos en el laboratorio se usa un medio al cual se ha agregado KNO3 al 0.1. La presencia 79 Ecuación II. Acido sulfanilico + diazotizado NH2 HO3s N=N c. colorante rojo b. Naftil amina NH2 de nitritos se pone de manifiesto haciendo reaccionar los nitritos con ácido sulfanilico (ecuación I b) el cual es diazotizado. El ácido sulfanilico diazotizado reacciona con la naftil amina (ecuación II b) para dar un colorante azo de color rojo (ecuación Iic). Ecuación I. NO2 + H03 s— NH2 + H + a. Nitrito b. Aldo sulfanilico 80 H0 3 3— N =N + H2O c. Acido sulfanilico diazotizado Si el color rojo no es detectado, hay dos posibilidades: 1) que no haya habido reducción de nitratos a nitritos; y 2) que la reducción haya sido completa a nitrógeno gaseoso. Pa- ra detectar la primera, se agrega un poco de polvo de zinc, el cual reduce los nitratos a nitritos si están presentes, y luego se prueba de nuevo la reacción de color. Si ahora ocurren las reacciones de color, esto indica que no hubo re- ducción de nitratos por las bacterias. El nitrógeno gaseo- so se puede detectar con una campanilla de Durham invertida. Objetivo de la Práctica Practicar un método para demostrar la habilidad de al- gunas bactei'ias de reducir nitratos a nitritos. Materiales para la Práctica 1. Cultivos de 21L horas de Lscherichia cola, Proteus vulgaris, Pseudomonw aeruginosa y Bacillus subtilis, 2. Cinco tubos de 16 X 125 mm, con 10 ml. de caldo de nitrato (vea apéndice E») 3. Solución de ácido sulfanilico (Solución A). 4. Solución de 11-N-dimetil-l-naftilamina (Solución E). ( Vea el apéndice O para la composición de las dos soluciones )0 5. Polvo de zinc. 6 , Pipetas de Pasteur. 7 Asas bacteriológicas; 8 . Mecheros. Procedimiento para la Práctica 1, Rotule sus tubos con su nombre, la fecha, el nombre del microorganismo que va a sembrar y el medio, 2. Siembre cada uno de los tubos con cada una de las cepas, 3. Deje un tubo sin sembrar como control. 4. Ponga a incubar durante 148 horas a 372C. 5. Agregue a cada uno de los tubos 10 gotas de la so- lución A. 6. Agregue a cada uno de los tubos 10 gotas de la so- lución E. 7, La aparición de un color rojo indica presencia de nitritos. 8. Anote sus resultados en un cuadro y su interpreta- ción. 9. Si no aparece color, agregue una cantidad muy pe- queña de zinc. 10. Repita los pasos 4 y 5 y observe si hay color. 11. Anote sus resultados de nuevo y su interpretación, 81 Cuestionario 1. ¿qud es una reacción negativa falsa? 2. Si después de haber agregado el zinc y los reacLivos de color no aparece color. ¿Cómo explica usted la desapari- ción de nitrógeno? 3. Estudie el ciclo del Nitrógeno y explique la importancia de las bacterias en él. t. ¿qué importancia tiene esta prueba en la clasificación de las bacterias? 5. ¿Por gut) es importante agregar una cantidad pequeña de zinc? 82 PRACTICA XXIII ACCION DE LAS BACTLIIIAS SOBRE ALGUNAS PROTEINAS Y CARLOIIIDRATOS DE LA LECHE La leche contiene lactosa, galactosa, trazas de glucosa, caseína y sales minerales (Cowan y Steelst, 1974) lo cual la hace un medio de cultivo muy versetil para el crecimiento de las bacterias. En el laboratorio, se prepara como medio de cultivo usando leche descremada y tornasol, un colorante ve- getal. Hay varios cambios que pueden detectarse en la lecho tornasolada. Las reacciones pueden ser sobre el tornasol o bien sobre los componentes de la leche. Los cambios del tornasol pueden ser: 1. Reducción, el medio aparece incoloro. 2. Producción de ácido, el medio se pone rojo o rosado. 3. Producción de álcali, el medio se pone azul obscuro (Cowan y Steelsi, 1974). Los cambios de la leche pueden ser de tres tipos: 1. Coagulación de la caseína con a. producción de un coagu- lo ácido el cual no se retrae y es soluble eh álcalis; b. pro ducción de un coágulo suave o dulce el cual se retrae y expre sa un fluido claro y gris. En este caso el coágulo no es so luble en alcalis. Este coagulo es producido por la acción de una enzima parecida a la renina (Cowan y Steels', 1974). 2. Peptonización (hidrólisis de las proteínas). La caseína se hidroliza ya sea antes o después de la producción de un coagulo. Los aminoácidos resultantes pueden ser metaboliza- dos y uno de sus productos de deshecho es el amoniaco lo que da un cambio de pH (Brockman, 1973). 3. Fermentación rápida, lo que hace que se produzcan gran- des cantidades de gas y se rompa el coagulo (Cowan y Steelsi, 1974)e Objetivo de la Práctica Practicar una prueba que pone de manifiesto la acción de 83 las bacterias sobre una proteLas y azúcares de la leche. Materiales para la Práctica 1 1. Cultivos de 24 horas de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptococcus lactis y Alcaligenes fae- calis. 2. Cinco tubos con leche tornasolada.(Vea apéndice C). 3. Asas bacteriológicas. 4. Mecheros. Procedimiento para la Práctica Rotule sus tubos con su nombre, fecha, el nombre el mi- croorganismo que va a sembrar y el Medio. 1. Siembre cada uno de los microorganismos en un tubo con leche tornasolada. 2. Guarde un tubo sin sembrar como control. 3. Ponga a incubar darante 10 lías a 3720. L1. Haga observaciones cada día anotando sus resultados en un cuadro y su interpretación. Cuestionario 1. ¿Podría dar algunos ejemplos de proteínas de la leche? Le ¿Qué otro tipo de indicadoras podríamos usar? 3. ¿De qué tipo de planta se saca el tornasol? 4. ¿Por qué usamos leche descremada y no leche corriente? 84 85 PRACTICA XXIV CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS Los microorganismos anaerobios constituyen gran parte de la flora normal del organismo, especialmente de las superfi- cies mucosas, como las de la cavidad oral y el aparato gas- trointestinal. Estos microorganismos pueden ser muchas ve- ces los causantes de infecciones mortales, como por ejemplo el tétano, y sin embargo, pueden pasar inadvertidos en los análisis de laboratorio. Es importante conocer los procedimientos para aislar e identificar a los microorganismos anaerobios, no solamente para su estudio como flora normal, sino también como posibles causantes de infecciones como la gangrena, el botulismo, et- cétera. Hoy en día, su cultivo y aislamiento ha llegado a ser un procedimiento rutinario en el laboratorio con la apa- rición de medios de cultivo perfeccionados, de vasos anaero- bios, de empaque deshechables generadores de hidrógeno y de bióxido de carbono (Sutter et al.,1973)0 Los anaerobios son generalmente aislados de una muestra mixta, ya sea como anaerobios múltiples, o más frecuentemen- te, mezclados con bacterias facultativas. Para aislar un cultivo puro en esos casos, es necesario, primero, examinar las colonias resultantes del cultivo de la muestra; segundo, cuantificarlas, describirlas y cultivarlas por separado, siem pre bajo condiciones anaerobias. Para realizar esta práctica es necesario que el estudian te tenga ya cierto conocimiento de principios básicos de bac teriológia anaerobia y que haya investigado la clasificación de los microorganismos anaerobios, su fisiología y las enfer medades causadas por ellos cuando son patógenos o sus activi dados en el intestino cuando son parte de la flora normal. Objetivo de la Práctica Introducir al estudiante a la técnica de cultivo y ais- 86 lamiento de microorganismos anaerobios. Materiales para la Práctica 1. Una muestra de heces fresca. 2. Dos cajas de agar sangre enriquecido para anaerobios (vea apéndice A). 3. Dos cajas de agar sangre con kanamicina-vancomicina (vea apéndice A). 4. Asas bacteriológicas. 5. Jarras de Gaspak. 6. Mecheros. 7. Generadores de hidrógeno deshechables. Procedimiento para la Práctica 1. Rotule sus cajas con su nombre, la fecha y el tipo de medio que va a usar. 2. Tome con el asa una porción de la muestra y siembre por estrías en las dos cajas de agar. 3. Repita el paso 2 con las cajas de agar con kanamici na-vancomicina, 4. Coloque sus cajas en la jarra de Gaspak, 5. Coloque su generador de hidrógeno para crear anaero biosis en la jarra. Este paso da lugar a una reac- ción catalítica del oxígeno y el hidrógeno generado para formar agua, lo cual establece anaerobiosis, 6. Cierre la jarra de Gaspak, 7, Ponga a incubar durante 48 horas a 372C. 8. Las colonias resultantes de esta práctica se usarán en la siguiente práctica para subcultivos y colora- ción de Gram. Cuestionario 1, Mencione algunas otras jarras para cultivos anaerobios. 2, ¿Qué tipos de infecciones pueden causar los anaerobios? 3, ¿Qué características tiene una infección causada por a- naerobios? 4. ¿Qué modificaciones tiene el medio de cultivo de anaero- bios que no tiene el medio para aerobios? PRACTICA XXV AISLAMIENTO E IDEETIPI0aCION PRESUNTIVA DE BACTERIAS AhAnROBIAS I La identificación presuntiva de los microorganismos anaerobios más comunes se puede hacer en base a la acción sobre el agar, morfología celular, arreglo de las células, coloración de Gran, pigmentes, hemélisis, fluorescencia y suceptibilidad a ciertos antibióticos. La caracterización definitiva se basa en un número de características morfoló- gicas, fisiológicas y genéticas, lo mismo que patogenicidad y producción de toxinas (Sutter et al., 1973). Algunas bacterias consideradas anaerobias pueden crecer en 002 al 10%, ser aereotolerantes y crecer débilmente en el aire, especialmente después de su aislamiento anaerobio y subcultivo subsecuente. Actinomyces naeslundii , Lrachnia nropionjea, algunas bifidobacterias y lactobacilos son ejem plos de bacterias microaerofilicas (Sutter et a1.,1973). Es necesario hacer un cultivo puro de la colonia aislada y de- terminar su tolerancia al oxígeno. El 75 al 80;t; de las especies aisladas de cultivos de muestras clínicas son Clostridium perfringens, Bacteroides fragilis, Bacteroides melaninogenicus y Pusobacterium nuclea- tum (Sutter et al.,1973). La frecuencia con que estos y o- tros grupos anaerobios se encuentran en muestras clínicas se encuentra en la página 24, tabla 7 del Wadswurth anaerobio BacteriologI Manual. Para ésta y la práctica siguiente es necesario referirse a dicho manual. Objetivo de la Práctica Practicar alunas pruebas para identificación de micro- organismos anaerobios. Materiales para la Práctica 1. Cultivos de la práctica anterior. 2. 3 placas de agar sangre enriquecido para anaerobios. 87 3. Un tubo de 16 X 125 mm. con 15 ml. de caldo de Tio- glicolato 135 C sin indicador (vea apéndice B). 4. Colorantes para Gram. 5. Reactivos para indol (vea apéndice E). 6. Asas bacteriológicas. 7. Mecheros. 8. Lámpara de luz ultravioleta. 9. Jarras de Gaspak. Procedimiento para la PrActica 1. Observe el crecimiento de las colonias en sus culti vos de la práctica anterior. 2. Escoja 1 colonia y anote en un cuadro las siguientes observaciones: morfología colonial, pigmento, hemó- lisis, acción sobre el agar y fluorescencia, 3. Rotule sus cajas de agar sangre con su nombre, la fecha, el nombre del medio y el ambiente en que las va a cultivar. 4. Siembre las tres placas de agar sangre con una por- ción de la colonia escogida. 5. Ponga a incubar durante 48 horas a 37QC así: Una en ambiente aerobioo Una en ambiente microaerofílico. Una en ambiente anaerobio, 6. Rotule su tubo con caldo de Tioglicolato 1350 con su nombre, la fecha y nombre del medio, 7. Siembre otra porción de la misma colonia en el cal- do. 8. Ponga a incubar en ambiente anaerobio durante 48 horas a 37120, 9. Si el tamalio de la coloaia escogida lo permite, haga una coloración de Gran y la prueba de indol. Si la colonia es muy pequelia, espere hasta la si- guiente práctica para hacer estas pruebas. Cuestionario ¿Q,ué significa ambiente microaerofilico? 2. ¿Cómo logrados un ambiente dicroaerofílico? 88 PRACTICA XXVI AISLAMIENTO E IDEUTIFICACION PRESUNTIVA DE BACTE2IaS ANAEROBIAS II Un antibiótico es una sustancia química que se deriva o se produce por varias especies de microorganismos y que es capaz de inhibir el crecimiento de otros microorganismos. Los antibioticos son muy variados y difieren en su forma de acción. Se han preparado muchos, pero solo unos pocos se utilizan en medicina ya que la mayoría son tóxicos para e