BUSCA YE FUENTE" LE RESISTENCIA Y METODOS nr DIAGNOSIS AL VIRUS LEL MOSAICO EN CARDAMOMO, siaLICD'TECA Da LA UNIVERSIDAD DEL VALE DE GUATEMALA UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias y Humanidades Departamento de Ciencias Agrícolas BUSCA DE FUENTES DE RESISTENCIA Y METO= TF DIAGNOSIS AL VIRIÁS DEL MOSAICO W CARDAMOMO OSCAR DAVID BONILLA AGUIRRE Trabajo de investigación presentado para optar el grado académico de Licenciado en Ciencias Agrícolas Guatemala 1983 (f) Inge fiero Julio R. l'Ijada Asesor BIBLIOTECA DE LA UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Vo. Bo. : Al:. A L -7 ' • Ingeniero Marco 2 Uriza Director Leptor'Ciencias Agrícolas Tribunal: (f) dicALc5én.443-v erriAtel Lada. Concepción M. de Bosque co MaiL ce h-ri: Dia Marco Urizar Montcrieff (f) 94,7 Ing. Manuel fiel V le Fecha de aprobacidn: 18 de noviembre de 1983. BIBLIOTECA DE LA UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA A mis padres A mis abuelos A mi familia A mis profesores A mis amigos AGRADECIMIENTO Lo hago patente de forma muy sincera a: La Asociación de Productores de Cardamomo (APRÓCAR) por su interés, ayuda y soporte económico del estudio. D. Le.nnis Gonsalves por su transmisión en el conocimiento de la técnica ELISA. Los Ingenieros Julio R. Tejada y Marco T. Urizar, Lic. Mar co T. Urizar Montcrieff por su ayuda tan franca y desinte— resada. El extensionista del proyecto APROCAR—UVG, Rolando Mejía por su trabajo. A mis compañeros de laboratorio. A la Universidad del Valle por haber prestado sus instala— ciones y equipo. Y finalmente, a todas aquellas personas que intervinieron en la realización del presente estudio. RESUMEN La resistencia parietal es la mejor forma de combatir las en— fermedades virales. Con el propósito de encontrar alguna linea que posea los genes de resistencia, que puedan ser utilizados en un fu— turo para mejoramiento del cardamomo. Se han hecho intentos de ob— tener plantas que sirvan como fuentes de resistencia al Virus del — mosaico del cardamomo. Las plantas aparentemente sanas fueron seleccionadas en culti— vares de alta incidencia de esta enfermedad. Se recolectaron y eva luaron bajo condiciones de presión de selección natural por dos mé— todos serológicos: El ELISA—directo y el indirecto. Se encontró — una correlación extremadamente alta entre ambos métodos y los sín— tomas visuales en vivero de evaluación de susceptibilidad. Le un total de 54 lineas, seleccionadas a nivel de campo y eva luadas en vivero después de ocho meses de inoculación natural, pre— sentaron un grado nulo de infección 24 de ellas. 212mbie'n se utilizó el método ELISA—indirecto como instrumento de diagnosis en plóntulas de viveros comerciales, &Indo como resul— tado una muy buena sensibilidad en muestras compuestas de un grupo de submuestras. Lo que representa una mayor confiabilidad debida al tamaño de la muestra y un ahorro de reactivos y tiempo, lo cual es de gran importancia. ix CON1ENIDO Página RESUMEN I. INTROLUCCION II. REVISIOM DP LITERATURA A. El cultivo del cardamomo B. La enfermedad del mosaico del cardamomo C. Técnicas serológicas en el diagnóstico de virus en plantas D. La técnica inmunosorbente enzima con— jugada (ELISA) E. Resistencia parietal de plantas a en— fermedades virales III. MATERIALES Y METODCS A. Reactivos B. Procedimiento de la técnica ELISA C. Purificación de la gama—globulina D. Conjugación de la enzima fosfatasa con la gama—globulina E. Preparación de las muestras para anali zar con ELISA Y. Selección del material de cardamomo en plantaciones con alta incidencia al Vi rus del mosaico del cardamomo G. Establecimiento de la estación experi mental,,para las pruebas de seleccicri 1 4 4 10 11 12 15 19 19 19 27 28 29 29 30 x Pdgina 11. Diagnóstico del Virus del mosaico del cardamomo en pldntulas de viveros co— merciales y plantaciones adultas de — cardamomo 31 IV. RESULTADOS 34 A. Evaluación de la selección del mate — rial de cardamomo en plantaciones con alta incidencia al Virus del mosaico del cardamomo 34 B. Evaluación del material de cardamomo seleccionado del campo, e inoculado — naturalmente en la estación experimen tal 38 C. Mecanismos de diagnosis en viveros co merciales y plantaciones adultas de — cardamomo 51 V. DISCUSION 58 VI. CONCLUSIONES 61 VII. EIBLIOGRAFIA 62 xi LISTA DE CUADROS Página 35,36,37 Cuadro 1 Codificación y origen del material pro— misorio libre del virus 2 Placas de ELISA—directo e indirecto con datos de lineas, valor promedio, desvia ción standard y coeficiente de variación 3 Número de muestras a recolectar por hec tárea, a un nivel de confianza y error muestral máximo dados 4 Húmero de muestras a recolectar de — acuerdo al número de plantas en vivero, a un nivel de confianza y error mees — tral máximo dados 5 Análisis de varianza respecto de las — muestras de viveros comerciales 6 Valores promedio de las absorbancias de muestras compuestas por 20 submuestras cada una 42 53 54 56 57 xii LISIA DF FIGURAS Figura Página 1 Principio de la técnica ELISA-directo 20 2 Diagrama de distribución de muestras y controles en las placas de ELISA 22 3 Principio de la técnica ELISA-indirec- to 25 4,5,6 Representación de los porcentajes de in lección por linea en síntomas y ELISA- directo 39,40,41 7 Controles positivos de cada placa y sus respectivos umbrales de infección 43 8 Representación del rango entre la mayor y menor lectura de cada linea por ELISA directo 9 Representación del rango entre la mayor y menor lectura de cada linea por ELISA directo 10 Regresión lineal y correlación entre - porcentajes de plantas infectadas con síntomas y ELISA-directo (sin correc - ción) 11 Regresión y correlación entre porcenta- jes de plantas infectadas con síntomas y ELISA-directo (con corrección) 12 Representación de los tres valores más altos de las plantas con resultados ne- gativos en ELISA-directo 13 Representación de los tres valores más altos con resultado negativo en ELISA- indirecto 14 Regresión lineal y correlación en absor bancia por ELISA-directo e indirecto 52 45 46 47 48 49 50 I. INTRODUCCION El cardamomo (E2ettaria cardamomum Matan) es uno de los culti— vos, aunque relativamente reciente, de los Inda importantes en Gua— temala. Su importancia como producto de exportación cobró signifi— cancia hasta mediados del siglo XX; su cultivo se inició en el país al principio de 1920. Esto debido principalmente a que la partici— pación en el mercado externo ha ido en aumento constante, sobre to— do desde los años sesenta. Ha llegado a convertirse al final de la década de los setenta, en el tercer producto de exportación del país. Guatemala ocupa el primer lugar como exportador de esta especie, a nivel mundial (24). Este cultivo fue introducido a Guatemala alrededor de 1920, en el departamento de Alta Verapn,.. Por la disponibilidad de condicio nes de clima y suelo adecuados se propagó rápidamente a otras regio nes. Fue llevado a la Costa Sur en 1940 (26). El área cultivada — en 1979 se estima en unas 16 mil hectáreas con una producción de 32 miles de toneladas métricas de cardamomo en pergamino (24). Guatemala es uno de los pocos paises que cuenta con las condi— ciones ecológicas que el cultivo requiere. Por lo tanto, ha incre— mentado sus plantaciones en respuesta a la rentabilidad del cultivo en los últimos años. Además, el cardamomo no está sujeto a conve — nios internacionales que regulan las exportaciones y los precios de las mismas, de tal manera que posee más ventajas, comparado con los cultivos tradicionales como el café y la caña de azúcar. 2 Desde el punto de vista económico-social el cultivo es fuente de ingresos para un gran número de familias del área rural. Y por el ti po de cosecha que necesita no es una fuente temporal de ingresos, sino más bien permanente. Eh lo que se refiere al país, es una fuente de - divisas de gran significado y de vital importancia, sobre todo en años de recesión económica como el que se está viviendo en 1983. La mayor parte del área cultivada es poco o nada tecnificada. Con rendimientos menores de doscientos kilogramos por hectárea, mien- tras que las plantaciones con alto grado de tecnificación pueden alean zar producciones que sobrepasen los 650 kilogramos por hectárea (a4). El cardamomo en la actualidad en Guatemala es víctima de una en- fermedad conocida como "mosaico", la cual fue detectada por vez prime- ra en la finca La Florida, Quetzaltenango, en el año de 1975 (18). A partir de ese ario la enfermedad se ha diseminado a casi todas las plan taciones del país, quizás con excepción de la zona norte, aunque no hay datos concretos al respecto. Los dañes producidos por el virus tampo- co han sido evaluados en forma técnica-científica, pero se asume que - la enfermedad afecta hasta un 70% de la producción actual y puede aún terminar de manera definitiva con este cultivo en el país, si no se en cuentran las estrategias de control adecuadas. Eh vista de lo grave del problema la Asociación de Productores de Cardamomo de Guatemala (APROCAR), hizo contacto con el ir. Dennis Gon- salves de la Universidad de Cornell, Estados Unidos de América, para que realizara un estudio del agente causante de la enfermedad, el vi- 3 rus del mosaico del cardamomo (VMCar). Eh febrero de 1982, APROCAR gestionó que la Universidad del Valle de Guatemala se hiciera cargo de un programa de investigación conjun— to, de tal forma que se firmó un convenio con el propósito de encon — trar un medio de diagnosis rápido, eficiente y relativamente económi— co. Además, de que se sentaran las bases para las medidas de control a corto y largo plazo con el fin de enfrentar el problema. El objetivo del presente estudio es el de encontrar fuentes de — resistencia al VMCar, por medio de la técnica serológica inmunosorben te enzima conjugada (ELISA), a partir de material encontrado aparente mente sano en ¿reas de alta incidencia de la enfermedad y establecer los mecanismos de diagnosis. La hipótesis planteada, es que todas las variedades de cardamomo presentes en Guatemala son susceptibles al VMCar. 4 II. REVISION DF LITERATURA A. El cultivo del cardamomo El cardamomo es la semilla seca de una planta perenne, Elettaria cardamomum Maton, perteneciente a la familia Zingiberaceae. Se encuen tra en forma silvestre en los bosques monzónicos, siempre verdes de los Ghats Occidentales en el Sur de India y Sri Lanka. Alrededor del año 1800 todo el abastecimiento provenía de estos bosques, y el culti vo consistia sólo en el aclaren parcial del bosque alrededor de las — plantas silvestres (51). 1. Características botánicas nos características de esta planta son divididas en la siguiente forma: a. Estructura El cardamomo es una planta perenne, herbácea con un rizoma subte— rraneo ramificado, del cual surgen varios brotes erectos con panículas también erectas o postradas. El rizoma es robusto, algo leñoso, en — forma horizontal y con numerosas raíces fibrosas en la capa superfi — cial. Los brotes, en ndmero de 10 a 20 con 2.5 a 5 m de alto, están compuestos de hojas nacidas en forma de macollas. Las hojas son de dos láminas, lanceoladas y terminadas en punta, de 25 a 50 cm de largo y de 5 a 15 cm de ancho, de color verde obscuro y lisas en el haz y — verde pálido en el envés. La superficie inferior puede ser tanto lisa como pubescente, dependiendo de la variedad y la raza (51). La inflorescencia nace eh la región radicular en la base de los 5 brotes con una longitud de 60 a 120 cm. Estas son paniculas erectas, reclinadas o postradas y alargadas. Tiene brácteas medianamente lar— gas de enrollamiento axilar, usualmente con dos o tres flores. Las — flores son hermafroditas, zigomórficas y de cerca de 4 cm de largo y 1.7 cm de diámetro. La bracteola es tubular como el cáliz, el cual es verde, apenas tridentado y firme. El tubo de la corola es del mismo — largo, o menos que el del cáliz, con tres lóbulos angostos, fron— dosos y de color verde pálido. La parte más conspicua de las flores — es el labelo compuesto de tres estambres modificados, de más o menos 1.8 cm de largo con punta ondulada; es blanco con lineas púrpura ra — diando desde el centro. Hay dos estaminoides rudimentarios separados y un estambre funcional. Este último tiene un pequeño filamente am— plio, con una larga antera y una conección con una pequeña cresta en el ápice. El ovario inferior consiste de tres carpelos unidos con nu merosos óvulos en posición axilar y un estilo con un pequeño estigma capitado (51). Los frutos son cápsulas triloculadas, redondas terminadas en pun ta, de color amarillo o verde claro, variando en tamaño de acuerdo a la variedad. Este contiene de 15 a 20 semillas de color pardo obscu— ro, rugosas, aromáticas, de más o menos 3 mm en largo y con una cubier ta mucilaginosa. Ellas contienen un perispermo blanco y un pequeño — embrión (51). b. Citología Según Larlington y Flylie el número cromosómico básico de Eletta— 6 ria es X - 12, y de acuerdo con Gregory el número somático es de 21r 48 aunque Chakravorti lo menciona como 2111 52 (al ). c. Polinización Las flores son auto-estériles, ast que es necesario plantar una mezcla de clones para que la polinización sea efectiva. Ellas son vi sitadas por abejas y otros insectos, los cuales efectuan una poliniza citan cruzada. d. Sistemática Le acuerdo con Willys (52) el género Elettaria tiene siete aspe cies en Indo-Malasia. El cardamomo silvestre y cultivado es Elettaria cardamomum Adatan. Alguna confusión existe respecto a la sistemática, razas, tipos y grados de E. cardamomum. Las variedades y razas son interfértiles, lo cual ha ayudado a una mayor confusión. Lbs variedades botánicas han sido reconocidas (54) en base al ta mato de la fruta: d.1 Variedad major Thwaites Este es el cardamomo silvestre de Sri Lanka, presente en los bos ques húmedos de esta región, el cual es cultivado sólo ocasionalmente. Es una planta robusta aproximadamente de 3 m de alto, con pseudotallos rosados, hojas amplias y panrculas erectas. El ovario y el cáliz son subtomentosos. El fruto, el cual es más largo que el de la variedad mrdamomum, es alargado, de 2.5 a 5 cm en largo, levemente arqueado, - de color amarillo verdoso cuando maduro y pardo obscuro al secar, con 7 mayor nómero de semillas, aunque más largas y menos aromáticas. d.2 Variedad cardamomum (sinónimos var. minor Watt; var. minús— cula Burkill) Esta variedad inclüye la mayoría de las razas cultivadas. La es tatuca varía de 2.5 a 5 m de altura. La partícula es larga con flores más numerosas y puede ser postrada, arqueada o erecta. E1 ovario y — cáliz son lisos. Los frutos más pequeñas que los de la otra variedad con menos semillas, más pequeñas y más aromáticas. Los frutos son amarillos cuando secan. Muchas razas son reconocidas, de las cuales las más importantes son: d.2.1 Cardamomo de Malabar Las plantas raramente exeden los 2.7 m de altura, con ramas, cor tas. Las hojas son de 30 a 45 cm de largo y son pubescentes en la su perficie inferior; las panículas son de 60 a 90 cm de largo y postra— das; los frutos son pequeños, globosos, redondeados u ovoides y leve— mente encorvados. Esta raza es muy susceptible al virus del mosaico. d.2.2 Cardamomo de Mysoure Las plantas son de crecimiento robusto, con tallos de hasta cinco metros de altura, con hojas gruesas, largas, las cuales son lisas en la superficie del envés. Las paneculas son erectas o arqueadas y los frutos son largos, fusiformes, triangulados y lisos. Esta raza se con sidera que posee cierta resistencia al Virus del mosaico y se desarro— lla adecuadamente para elevaciones mayores que el cardamomo de Malabar. 8 Eh Guatemala se acostumbra asignar diferentes nombres a las li- neas que se producen, tales como: Cardamomo rojo, amarillo, blanco, grueso, largo, "pache", gran cardamomo, etc. Sin embargo, se cree que todas se derivan de las variedades cardamomo' y mqjor Ihwaites, de las cuales la primera es la más difundida por ser la más productiva y de - mejor aceptación en el mercado internacional. Ademds, en las montañas de Alta Verapoz se ha reportado la existencia de plantas de cardamomo silvestre (24). 2. Ecología del cultivo El cardamomo es un cultivo tropical que crece a altitudes entre los 760 y los 1400 m sobre el nivel del mar (51), pero con mejor resul tado entre los 900 y los 1300 m (6), en áreas donde la precipitación - pluvial por ano sea mayor de 2000 mm bien distribuida durante ese la,E so. El rango de temperatura adecuado es de 10 a 35 °C, con una media de más o menos 22 °C (51). El cardamomo es muy susceptible a los vientos fuertes. La sombra es otro factor muy importante en el éxito del cultivo. .Pues constitu ye un medio de protección tanto para los rayos directos del sol, como contra las fuertes corrientes de viento. Una sombra de 30 a 40% se - considera adecuada (38). Sin embargo, en Guatemala bajo las condicio nes de la Costa Sur se ha cultivado el cardamomo al sol, con resulta- dos exitosos. Sobrepasando en producción por área al sistema tradicio nal bajo sombra. Los suelos aconsejables son los de textura franco-arenosos con - 9 estructura estable. El terreno debe tener buena cobertura y adecuado abastecimiento de agua. El cardamomo requiere buen drenaje, este cul tivo no tolera anegamientos (51). 3. Importancia económica El uso principal del cardamomo en términos generales es con pro— pósitos culinarios domésticos. El mercado internacional, no obstante, depende de la demanda creada por aplicaciones especializadas, las cua les envuelven a dos distintos mercados: Los paises árabes del Medio Oriente y Escandinavia. Eh el pasado, ha sido tradicionalmente usado para aromatizar el café, y más recientemente, como saborizante de hor neados como pasteles, panecillos, bollos y pan. Eh otros paises de — Europa y Norteamérica también es usado en la elaboración de algunas — salsas, sopas, pescados enlatados y en la aromatización de algunos ci garrillos (41). El aceite de cardamomo es producido en pequeñas cantidades en Gua temala, el cual es utilizado para dar sabor a ciertos licores, amargos, remedios y ocasionalmente en perfumería (4°. Eh Guatemala a partir de 1959 las exportaciones comenzaron a co— brar importancia. Eh 1978 se exportaron más de dos mil toneladas mé— tricas, dando un ingreso que significó 30.8 millones de quetzales. De manera que se colocó en un tercer lugar entre los productos de expor— tación, después del café y el algodón (24). El cardamomo requiere aproximadamente un total de 221 jornales — por hectárea en un año, lo cual según las estimaciones de 1978, este — 10 cultivo dió ocupación a 14.7 miles de personas (24). B. La enfermedad del mosaico del cardamomo Eh Guatemala el VYCar fue detectado en 1975, en fincas del muni— cipio de El Palmar, Quetzaltenango. Reconocimientos posteriores de— mostraron su presencia en toda la Costa Sur. No se ha hecho un estu— dio exhaustivo en cultivares de Alta Verapaz, empero en las pocas plan taciones observadas hasta la fecha no se ha encontrado (18). La enfermedad se manifiesta primero en las hojas jovenes de las partes en crecimiento. La hoja pierde su uniformidad en el color ver de y se desarrollan fajas o manchas cloróticas, las cuales son aguda— mente delimitadas. Las manchas crecen gradualmente en tamaño, frecuen temente corriendo juntas y ocupan una gran superficie de la hoja. Eh hojas con alto grado de infección las Breas son confinadas sólo entre las venas en franjas alargadas. Eh casos extremos la hoja es total— mente clorótica. Le las hojas de la región apical la enfermedad se — esparce gradualmente a las hojas bajeras. Las plantas afectadas lucen cloróticas en comparación con las sanas que son de un verde obscuro. Cuando la planta es infectada desde una etapa muy joven, muestra un — achaparramiento y no alcanza un desarrollo normal. Las plantas afec— tadas se marchitan gradualmente y se vuelven raquíticas. La cosecha decrece ario con ano. El deterioro de la plantación es tan rdpido que en cuatro años del aparecimiento de la enfermedad las plantas quedan totalmente destruidas (41,17). El agente causante de la enfermedad es un virus de varilla flexi- 11 ble (17). El cual ha sido reportado como no—persistente (47) y como semi—persistente (48) en el áfido Pentalonia nigronervosa que ha sido citado como el principal vector de la enfermedad en forma natural. La transmisión por medio de la semilla se cree que no es factible (1), — además intentos para probar la transmisión por la savia han dado resul tados negativos (17). C. Técnicas serológicas La aerología se basa en las reacciones inmunológicas. Estas tie nen una base común. El agente inmunizador, llamado antígeno o inmund geno que estimula al animal a que desarrolle proteínas llamadas anti— cuerpos en su suero sanguíneo; las cuales reaccionan específicamente— con el antígeno que estimuló su producción. Afortunadamente para los virólogos los virus no tienen que infectar y multiplicarse en el ani— mal para crear anticuerpos. Por lo que muchos virus en plantas son — eficientes inmunogenos. Más sin embargo, la reacción entre un anti— cuerpo y el antígeno puede ser fácilmente estudiada in vitro (19). Los anticuerpos reaccionan específicamente con su antígeno homó— logo porque se pueden unir de una sola forma. Las moléculas del anti— cuerpo tienen sitios activos en sus superficies y estos se cree que — son complementarios. Presumiblemente en forma molecular, carga e hi— drofobicidad a los sitios antigdnicos en la superficie de su antígeno homólogo. iü tal suerte que en condiciones adecuadas ambos pueden com binarse (19). Hay varias formas con las cuales se puede demostrar la reacción — entre partículas de virus y sus anticuerpos. La mayoría de métodos — 12 se realizan in vitro y muchos pueden ser usados cuantitativamente y - cualitativamente para determinar las concentraciones de antígeno y an ticuerpo, pero estos difieren en conveniencia y sensitividad. Algunos de ellos son los siguientes: 1) Aglutinación de cloroplastos; 2) - Prueba de tubo de precipitación; 3) Prueba de precipitación cuantita tina; 4) Prueba de fijación-complemento; 5) Prueba de anillo inter- fases; 6) Prueba de difusión en gel; 7) Prueba de inniuno-osmoforesis; 8) Técnica de anticuerpos traza (19 ). D. La técnica inmunosorbente enzima conjugada (ELISA) La técnica inmunosorbente enzima conjugada (Enzymelinked inmuno- sorbent assay) se adaptó en 1977 para la detección de virus en plan- tas por Voller, et al (49) y Clarck & Adonis (7). 1. Fundamentos de la técnica ELISA Di este método el virus de la muestra probada es atrapado selec- tivamente e inmovilizado por un anticuerpo especifico y adsorbido a - una superficie sólida. El virus atrapado reacciona con la ayuda de un anticuerpo especifico, al cual se le ha enlazado una enzima. respuis de lavar, la enzima gue ha formado un complejo con el virus atrapado, es detectado colorimétricamente por la adición de un substrato adecua- do a la enzima (7), y el cual por hidrólisis da una coloración amari- lla (2). El conjugado anticuerpo-fosfatasa alcalina (enzima) tiene Mana - importancia. La reacción de condensación se lleva a cabo en los gru- pos epsilón-amino de la lisina y los grupos alfa-amino terminales de - 13 las proteínas reactantes, a través de la formación de una base de - Schiff; el glutaraldehído actúa como agente condensante (4), 2. Condiciones de la técnica ELISA Muchas técnicas serológicas convencionales no pueden ser usadas - a causa de limitaciones tales como bajas concentraciones del virus, costo de reactivos, equipo sofisticado y otras. Las cuales son amplia mente superadas por ELISA (7). Las ventajas particulares de la técni- ca ELISA sobre otras de anticuerpo-enlazado, son la combinación en la economía de reactivos, la extrema sensibilidad y su potencial de medi- ción. También es altamente versátil detectando virus isométricos y fi lamentosos, tanto en preparaciones purificadas como en extractos cru- dos del hospedero (7). La técnica enzima inmunosorbente ha sido reportada como más sen- sible en comparación con las técnicas de radio-inmunosorbentes (2). La eficiencia de la técnica ELISA es independiente de la relación antígeno-anticuerpo. También se ha reportado recientemente que para varios virus la especificidad de ELISA es tal, que preparados para de- tectar otra, serológicamente muy relacionadas. 3. Tipos o clases de ELISA La técnica de enzima inmunosorbente ha tenido algunas modifica- ciones, las que han dado origen a distintos tipos, los cuales varían en algunas de sus características de detección seroldgica. Estos son: a. Directo o de doble sandwich El tipo más conocido y del cual existe información bien documenta 14 da es el método de doble sandwich (42,36,52). Este tipo consiste en la adhesión de la gama-globulina anti-virus especifica a la placa de- poliestireno por un buffer de carbonato de sodio a pff 9.6. A continua ción se colocan las muestras del material a investigar, de manera que si el virus esta presente pueda ser atrapado por los anticuerpos y fi- jados a éstos por una reacción antígeno-anticuerpo. Después se adicto na otra gama-globulina conjugada a una enzima, para completar el doble sandwich. Por último, se adiciona el substrato de tal suerte que si es virus esté presente durante el proceso una reacción amarilla (7). Este método tiene la desventaja de que necesita conjugar la enzi- ma a cada antisuero purificado. Además la especificidad de esta prue- ba es tan alta que puede diferenciar lineas muy relacionadas serológi- camente del mismo virus (12). b. Indirecto Este es un nuevo método y se ha empleado poco. En términos gene- rales consiste en la adhesión de las muestras de material en estudio a la placa de poliestireno por un buffer de carbonato de sodio, si en la muestra existe virus, este se adhiere a la pared de los pocillos de las placas de poliestireno. Aida tarde se coloca la gama-globulina anti- - virus de conejo, preadsorbida, de manera que se enlace a las partícu- las del virus. A continuación se adiciona una gama-globulina anticone jo conjugada a una enzima, de suerte que se enlace a los antivirus. Por último se adiciona el substrato, de forma que si se ha dado origen al complejo virus-antivirus-anticonejo se obtenga una reacción positi- 15 va (21). Esta prueba tiene la ventaja de que no es necesario conjugar es- pecíficamente la enzima a cada antígeno a ser probado y elimina la ex- trema especificidad, permitiendo una evaluación de las relaciones en- tre las lineas (10). 4. Análisis de las muestras La toma de decisión respecto a considerar una muestra infectada en algunos casos dudosos es difícil, ya que el punto a partir del cual debe considerarse la reacción como positiva, visualmente, es muy sub- jetiva. Por tanto, la evaluación de positividad hace necesario el uso del análisis fotométrico. Clarck (7) obtuvo diferencias de la inten- sidad de color iguales a un cambio de 0.150 a 0.200 en absorbancia a 405 nanómetros de longitud de onda en extractos de planta sana. Mues- tras con lecturas arriba de 0.150 del control (extracto de planta sa- na) fueron consideradas como positivas. Otro método utilizado para la determinación del umbral de infección en las lecturas de muestras con el Virus del enrollamiento de la papa (PLRV) fue considerado a partir de la media aritmética de la absorbancia de los controles sanos más - dos desviaciones standard (8). Y Diez (16) toma tres desviaciones - standard en adición a la media aritmética de los controles sanos para la determinación del umbral de infección. E. Resistencia de las plantas a enfermedades virales La resistencia es un concepto relativamente nuevo en cuanto a su uso en el control de enfermedades, pero antiguo en relación a su - 16 existencia. Eh plantas específicamente, se define como la habilidad de la planta a oponerse, disminuir o sobrepasar el ataque de un pató- geno (50). Pero a diferencia de inmunidad, no es una cualidad absolu- tamente invariable y puede ser sobrepasada por exposición a inóculo - masivo bajo condiciones altamente favorables al patógeno (11). La in- munidad significa que no se estd sujeto al ataque del patógeno, es de- cir que existe una resistencia total (50). Algunos dividen la resis- tencia en vertical, que se expresa únicamente contra algunos biotipos de una especie de organismo, y horizontal aquella que se expresa en - contra de varios de los biotipos (28). Yambión se hace mención de o- tra clase de resistencia debida a la muerte prematura del tejido in- fectado, lo que resulta en la inactivación del agente atacante (11). La verdadera resistencia es diferente de aquellas circunstancias que dependen de alguna característica estructural o fisiológica de la planta que prevee la invasión efectiva del patógeno. Esto genera una actividad protoplóSmica debida a una reacción específica. Sin embar- go, causas de inmunidad o resistencia debidas a características anató- micas de la planta prevee la entrada del patógeno a la misma. Si se consideran las causas de verdadera inmunidad o resistencia, se induce una masa de evidencias anatómicas, fisiológicas, bioquímicas y ecológi cas. Algunas teorías para explicar casos específicos y otras para ex- plicar el problema en general (50). Los grados de resistencia mostrados por las plantas no deben ser tomados como fijos y absolutos. La temperatura, humedad, fertilidad y reacción del suelo afectan marcadamente el desarrollo de la enfermedad. 17 Otros factores como la edad y madurez de la planta pueden afectar la resistencia (50). Eh algunas enfermedades virales ha sida reportado recientemente que los efectos predominantes de la adición de nutrimen— tos es para incrementar la susceptibilidad (11). Se ha dicho también que la mayoría de plantas son más susceptibles a la infección viral cuando están jovenes, y su resistencia natural aumenta con la edad — (11). El concepto de resistencia necesita ser definido, no sólo en con— ceptos de la relación patógeno—hospedero sino en términos que incluyan las condiciones ambientales y la influencia de éstas tanto en el paró— sito como en el hospedero. Estos últimos organismos vivientes que po— seen capacidades inherentes de variación (11). Cuando el hospedero y parásito han tenido una larga asociación, entonces en el proceso evolucionario formas resistentes han sido desa— rrolladas por selección natural. Ya que, sin tales factores de resis— tencia no podrían haber sido sobrevivientes (11 ). Es más, aún cuando se logra un riguroso aislamiento de un virus clonal, usualmente éste contiene una pequeña pero finita proporción de variantes (19). Para la realización de experimentos y pruebas de resistencia de— ben escogerse sitios donde la incidencia de la enfermedad sea extrema— damente alta, la exposición severa y uniforme, además de otras condi— ciones conducentes a una investigación eficiente (11 ). El éxito del fitomejoramiento radica en una amplia aplicabilidad, o la utilización del más extenso arreglo de los genotipos, tanto del — 18 patógeno como del hospedero (11). Puesto que la mayoría de las reste tencias esta' sujeta a la pérdida debida a la aparición de otras cepas vírales. Esto ha sucedido por ejemplo, con aquellas fuentes de resis•-- tencia encontradas en el Virus de la papa (PVP) y del Virus del mosai— co del pepino (CMV), las cuales fueron perdidas después de ser intro— ducir7ns en diferentes cultivos de chile (9,10). 19 III. MATERIALES Y METO= A. Reactivos La aplicación de la técnica ELISA, necesita de los siguientes - reactivos: 1. Suero de conejo anti-virus específico al Virus del mosaico en cardamomo. Este antisuero fue producido por el Lr. Dennis Gonsalves, a par- tir de partículas del VMCar, purificadas por (1 en la Universidad de Cornell. El virus fue inyectado en forma periódica en conejos, los - que fueron sangrados a ciertos intervalos, dando como resultado dife- rentes antisueros. 2. Suero de cabra anti-conejo específico a la gama-globulina de conejo. Este se consigue comercialmente con la siguiente denominación Sigma No. A-8025. 3. Suspensión de secciones de hojas de cardamomo Fracciones de la hoja son maceradas y extraídas en el buffer de acuerdo al tipo de técnica ELISA a utilizar. Dependiendo de la técni- ca también se realiza la dilución de muestra en relación al buffer. Los otros reactivos usados son los descritos por Clarck & Adams (7) y por Gonsalves (21). B. Procedimiento de la técnica de ELISA Para facilitar la descripción de cada uno de los tipos de técni- ca se detallan a continuación: 1. Anticuerpo específico adsorbido a la placa 1.4 Lavado 2. Adición de muestras conteniendo el virus lavado 3. Adición de enzíma conjugada al anticuerpo 1 14 :1111r lavado O 0 • • 4. Adición Si substrato 0 0 ° tc);°` PARAR LA 1BACCIGN ( MICH 3M ) Lbc/uacidh • Medición fotortétrica visual (405 nm) Fig. 1 Principio de la Técnica de PlIS.1 -directo. 20 21 1. Técnica de ELISA-directa El procedimiento utilizado en el presente trabajo es el descrito por Clarck & Aclame (7). a. Primer paso Se utiliza una placa de poliestireno de noventa y seis pocillos - donde se adhieren los anticuerpos en cada uno de ellos. Para esto se hace una dilución de la gama-globulina hasta llevarla a una concentra- ción de cinco microgramos por mililitro en una solución buffer de car- bonato de sodio a pH 9.6. Las placas se llenan con 0.20 ml por pocillo y luego selladas con Parafilm, para evitar alguna contaminación. Lue- go las placas se incuban en cajas de humedad a 37 °C por un periodo de 2 a 2.5 horas. Al cumplirse ese tiempo se lavan tres veces las placas con buffer salino de fosfatos-lineen (PRS-lbeen), dejando cada una por un lapso de tres minutos antes de enjuagar. Esto con el propósito de eliminar todos aquellos anticuerpos que no hallan sido adheridos a las paredes de los pocillos, ver fig. 1. b. Segundo paso Utilizando el extracto crudo de las plantas a probar, fig. 1, se procede a llenar tres pocillos con cada muestra, las que pueden ser de 25 a 28 por placa. Los espacios restantes se distribuyen en la placa a manera de que los controles utilizados queden estrategicamente colo- cados. Los controles usados, fig. 2, son tres: Un extracto de planta sana (ffS), uno de planta enfectada (A) y el último. con buffer de ex- tracción (B). Cada pocillo es llenado con 0.20 ml de la suspensión. 22 Sc'.. control nagattuo rete control positivo 11 e control buffer nuestra a pro bar 2 1 2 1 3 4 5 6 ) 7 8 9 I 10 42 12 A 1 .1e- E I 1c 11 1 11 2 I dé E Sc 4 D 11 3 Át 4 U 5 O 6 C 117 11 6 M 9 y10 .2 11 11 11 12 11 13 N 14 E .11 15 11 16 11 17 11 18 Y 11 19 1120 li 21 9 22 2123o _ 11 .24 . 11 25 1125 1127 11 28 * de E * Se Fig. 2 Diagrcana de distribución de muestras y controles en les placas da 1:17-91. 23 Después de llenados los pocillos se sella la placa con Parafilm y se incuba en una caja de humedad en un refrigerador a 6 °C durante 8 a 12 horas. Transcurrido ese tiempo se procede a lavar cuatro veces conP519-lineen, la primera enjuagando inmediatamente la placa y las res- tantes dejando un intervalo de tres minutos de igual forma que en el primer paso. Todo esto con el propósito de eliminar todos aquellos re siduos que no esten adheridos a las paredes de los pocillos, específi- camente a los anticuerpos. c. Tercer paso Cada pocillo vuelve a llenarse con gama-globulina enlazada con - fosfatasa alcalina, fig.1, empleando la concentración más adecuada, - cercana a 1:400. A continuación se incuba la placa sellada, dentro de una caja de humedad a una temperatura de 37 °C por 2 a 2.5 horas. Du- rante este tiempo, si el virus está presente se completa la reacción - denominada de "doble sandwich% es decir, el complejo anticuerpo-virus anticuerpo conjugado. Transcurrido el tiempo se lava la placa con FRS Mugen, tres veces dejando un intervalo entre lavadas de tres minutos antes de enjuagar, fig.l. d. Cuarto paso Se utiliza como substrato pnitroftnil fosfato diluido en un buf- fer de dietanolamina ajustado a N19.8, a razón de 1 mg/ml. Se colo- can 0.25 ml de la dilución por pocillo, asegurándose de que este recien preparada, fig.l. La placa se deja reposar a temperatura ambiente, - hasta que se pueda visualizar en forma clara la reacción en aquellos - 24 pocillos donde se llevo a cabo el "doble sandwich" durante el proceso. En el momento que se considera que la respuesta es lo suficientemente apreciable se procede a detener la reacción por medio de una solución de Hidróxido de Sodio (NaOH 3M). Inmediatamente después de detener la reacción se hace la lectura de la intensidad de color, al medir la absorbancia a 405 nanómetros. El umbral de infección se calcula sumándole a la media aritmética de - los controles negativos tres desviaciones standard. 2. Técnica de ELISA-indirecta El procedimiento utilizado en el presente trabajo es el descrito en las notas de laboratorio del La'. Iennis Gonsalves. a. Primer paso Usando una placa de poliestireno de noventa y seis pocillos se ad hieren a ellos las muestras, para ello estas son extraidas en una solu ojón buffer de carbonato de sodio de pH 9.6 en una relación de dilución de 1:50. Se adicionan 0.20 ml por pocillo de las muestras a evaluar, fig 3 Las placas son sellados con Parafilm y puestas en cajas de hu- medad, las que son incubadas por 2 a 2.5 horas a una temperatura de - 37 °C ó bien toda la noche en una refrigeradora a 6 °C. Cumplido el - tiempo, se lavan las placas con YES-Ihmen, tres veces, dejando un inter valo de tres minutos entre lavado, antes de enjuagar. b. Segundo paso Con anticuerpos específicos de atar se procede a preadsorber la gama-globulina a otras proteínas de la planta. Este proceso consiste 1. Adición de muestras conteniendo el vírus -u- lavado .2_ Adición de anticuerpo específico al vírus Lavado Adición de ant i -conejo - lavado a- adición del substrato PARAR LA REACCION Na0L7 ) Evaluación visual Medición ibtomarica ( 405 nm) BIBLIOTECA 25 IDE LA UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Flis- Pir5nc.ipio de la l'Étnica ELISA-indirecto. 26 en lo siguiente: Se macera un tejido sano a una dilución de 1:20 en buffer de enzima. Se filtra a través de una gaza. Se mide el extrae to sano de manera que sea un décimo del volumen total de la gama-glo- bulina y el buffer usado en este paso. Se adiciona la gama-globulina diluida 1:500 del volumen total. Se deja reposar de 3 a 5 minutos. Se agita suavemente para mezclarla lo mejor posible. A esta mezcla - se le agrega el buffer de enzima necesario para llegar al volumen to- tal. Se llenan los pocillos con alícuotas de 0.20 md de la solución de gama-globulina preadsorbida, fig.3. Se incuba 2 a 2.5 horas a 37 °C. _Transcurrido el tiempo se lava tres veces, a intervalos de tres minu- tos con PES-Macen. c. Tercer paso Se prepara el anti-conejo de cabra, conjugado con la enzima frs- fatasa alcalina. Se diluye 1:1000 en buffer de enzima. Se llenan los pocillos con alícuotas de 0.20 ml, fig.3. Luego se incuba por 2 a - 2.5 horas a 37 °C. _Transcurrido el tiempo se lava la placa con PBS- 2Ween, tres veces a intervalo de tres minutos. d. Cuarto paso Se adicionan 0.25 ml del substrato, p-nitrofenil fosfato, dilui- do en buffer de dietanolamina ajustado a pff 9.8, a razón de 1 mg/m1. Se mantiene a temperatura ambiente el tiempo necesario hasta observar claramente la reacción. En ese momento se detiene la reacción al a- gregar 0.50 ml de Hidróxido de sodio 3M a cada pocillo. Luego se eta 27 lúa la reacción de la misma forma que se hizo con ELISA-directo, ver 119-3. C. Purificación de la gama-globulina Para la purificación de la gama-globulina del antisuero de cone- jo se pueden seguir varios procedimientos. Eh el presente trabajo se usó el descrito por Clarck & Aclame (7). A un mililitro de gama-globulina se le adicionan 9 ml de agua - destilada. Lentamente se le agregan 10 ml de una solución saturada - de sulfato de amonio, aproximadamente, a la media hora. Se incuba de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente. Al transcurrir este tiempo- se centrifuga a 4000 rpn durante 10 minutos y se colecta el precipi- tado. Se disuelve este en dos mililitros de 0.5 PES. A continuación se dializa a temperatura de 4.°C tres veces, con un lapso de tiempo - de tres a cuatro horas cada una en 0.5 PBS. El fraccionamiento de la gama-globulina con LEAS se hace por me- dio de una columna de intercambio tónico. Para empezar se agita el - LEAS disuelto en etanol al 28% y se mide de 5 a 10 ml. Luego se colo ca en un beacker de vidrio. Se lava el LEAS con agua destilada, agi- tando suavemente en espiral. Se deja reposar hasta que estabilice. - Se remueve el líquido sobrenadarte con una pipeta de Pasteur y se eli mina. Se repite el procedimiento 10 veces con agua y tres con 0.5 PBS. Al terminar el lavado se humedece la columna con 0.5 PBS, aseguróhdo- se de que la membrana quede cubierta. Es recomendable llenar antes el capilar con agua destilada para evitar burbujas. Se coloca el LEAS - 28 al mismo tiempo en la columna. Usando una pipeta de Pasteur se la— van hacia abajo todos los lados de la columna con 0.5 PBS, pero lle— nando hasta donde el DIME' está completamente equilibrado. Se miden el NI y la conductibilidad del 0.5 1BS antes de lavar. Se extrae el 0.5 PES bajando en la columna hasta el menisco del ME. Se echa la gama—globulina con una pipeta de Pasteur, muy cuidadosamente, sin dis turbar el LEAS. Se extraen dos mililitros, uno por tubo. Cuidadosa— mente se llena la columna con PES; ésta se mantiene llena todo el tiem po. Para finalizar se extraen 13 ml (uno por tubo). Y se mide la — concentración en OD (dioptrías ópticas) a 280 nanómetros de todos los tubos, incluyendo dos de desecho. D. Conjugación de la enzima con la gama—globulina Para este proceso se centrifugan 5000 unidades de fosfatasa alca fina y se colocan en un tubo de precipitado. Y se desecha el líquido sobrenadante. El precipitado se disuelve en dos miligramos de gama— globulina purificada. Se dializa tres veces en contra de PES. Se le adiciona glutaraldehído en solución acuosa, mezclándolo bien, hasta — llevarlo a una concentración final de 0.06%. Este preparado se deja en reposo por cuatro horas a temperatura ambiente, en donde se desa— rrolla un color pardo—amarillento. El material se vuelve a dializar tres veces en PES para remover el glutaraldehído. Finalmente se le — adiciona albúmina de huevo para llevarla a una concentración de 5 mg/ ml y se guarda en refrigeración a 4 °C por tiempo indefinido en tubos previamente siliconados. 29 E. Preparación de las muestras a analizar con ELISA La preparación de la muestra a estudiar es diferente, dependien— do del tipo de ELISA utilizado. De manera que a continuación se data lla el procedimiento para cada una: 1. ELISA—directo La suspensión es obtenida por medio de la maceración de secciones de hoja utilizando un buffer de extracción de pH 7.4. La maceración se hace por medio de un aparato llamado "tissumizer". La relación de dilución que se utilizó de hoja respecto del buffer fue la de 1:25. — Para evitar la contaminación en el aparato se hacen dos lavados con agua destilada a alta velocidad y se quitan los residuos con un par de pinzas. También es importante pasar antes las muestras que se su— ponen sanas y después las que presentan síntomas visuales de la enfer medad 2. ELISA—indirecto La suspensión en este caso es obtenida por medio de la maceración de las secciones de hoja, pero en este método se utiliza un buffer de carbonato de sodio de pH 9.6. El resto del procedimiento es el mismo de ELISA—directo excepto que la relación de dilución de la sección de hoja respecto del buffer es de 1:50. F. Selección del material de cardamomo en plantaciones con alta incidencia al VL'Car. Se visitaron varias de las plantaciones de cardamomo de la Costa Sur y se buscaron aquellas plantas que estando bajo un alto grado de 30 incidencia de la enfermedad se presentaran como aparentemente sanas. De esas plantas se tomó una muestra, se marcó el lugar y se tomaron — los datos necesarios. Las muestras fueron evaluadas por medio de la prueba de ELISA—directo en el laboratorio. Todas aquellas plantas aparentemente sanas que dieran un resulta do negativo a la prueba de ELISA fueron recolectadas y llevadas a la estación experimental, localizada en la finca Altamira. G. Establecimiento de la estación experimental para las pruebas de selección La estación experimental se estableció en un área donde la inci— dencia de la enfermedad es alta, la infección severa y puede decirse que uniforme debido a que es un área cardamomera sujeta al ataque vi— ral fuerte. La estación está ubicada según Holdrich en un bosque subtropical húmedo, en la finca "Altamira", municipio de San Francisco Zapotitldn, Departamento de Suchitepéquez. 1. Formación de la estación e introducción del material de cardamomo con posible resistencia al WICar La estación de prueba de susceptibilidad es una pequeña área ro— deada de cardamomo infectado con VMCar y bajo sombra de café. La par cela consta de dos hileras de bloques en forma transversal, cada uno conteniendo once posturas provenientes de una de las plantas seleccio nadas a nivel de campo. Las plantas individuales, fueron recolectadas y divididas de tal forma que se obtuvieran las posturas necesarias — 31 con que cuenta cada bloque. 2. Inoculación natural con VMCar 1 observación del material de cardamomo La inoculación del material se produjo únicamente en forma natu- ral. Se ha considerado que la diseminación de las partículas de VMCar es causado por vectores provenientes de las plantaciones vecinas al - área de prueba. Todas las plantas de la estación fueron evaluadas respecto a la presencia da síntomas visuales, característicos de la enfermedad al momento de tomar las muestras para laboratorio. 3. Selección „y evaluación del material post-inoculación natural Todo el material recolectado en la estación fue evaluado en tres diferentes formas: a) Síntomas visuales; b) Por el método serológico de ELISA-directo en todas las plantas individualmente; y o) Por el - método de ELISA-indirecto en las tres plantas (posturas) que presenta ron los valores mis altos en absorbancia respecto de la linea total. La selección se hizo en base al porcentaje de infección que pre- sentó cada linea completa. Además, se realizó una evaluación de sus- ceptibilidad de las lineas que presentaron mayor concentración de vi- rus en la muestra trabajada en laboratorio. H. Diagnóstico del VMCar en plántulas de viveros comerciales Plantaciones adultas de cardamomo I. Cálculo del tamaño de las muestras Para evaluar plantaciones adultas o viveros comerciales de carda momo se necesitó establecer un mecanismo que permita hacer un mues- 32 treo con un nivel de confianza conocido, una estimación del error mues- tral. Y que al mismo tiempo fuera fácil de manejar aún cuando el núme- ro de muestras sea grande, de manera que fueran evalundns sin dificul- tad. EZ material sujeto a estudio de resistencia fue tomado como una - población bajo un grado incipiente de infección con MVCar y servir co- mo base en el establecimiento de los tamaños de las muestras a tomar pa ra la detección de infecciones con VMCar en otros cultivares o viveros de cardamomo. Puesto que la población estudiada fue de 449 plantas in- dividuales, su comportamiento es de acuerdo a una distribución 11311, por lo que se puede determinar el número de la muestra a partir de la des- viación standard de la misma, por medio de la relación siguiente: Et" La desviación standard se calculó a partir de la lectura de absor bancia de cada muestra y en cada placa en forma individual. La media aritmética de las desviaciones standard de todas las placas se tomó co- mo la desviación standard de toda la población. 2. Número de muestras a evaluar por placa Lebidb a que el número de muestras a evaluar por placas es limita do, se buscó una alternativa que permita incrementar el número de 33 muestras, sin afectar la confiabilidad del resultado. En base a que la técnica ELISA—indirecto es más sensible se eligió ésta para probar si al agruparse varias muestras en una sola, puede detectarse la in— fección a través de este método. Para esto se utilizó una placa de poliestireno (Elisa), usando cada dos hileras horizontales como un sólo bloque. Se usó el diseño experimental de bloques completos al azar con el propósito de medir la diferencia entre las lecturas de absorbancia a 405 nm de las prue— bas hechas entre plantas sanas y plantas enfermas. Se usaron diez distintas muestras, compuestas de 20 submuestras, lo que globaliza un total de 200 submuestras, lo cual hizo al mues— treo más significativo estadísticamente. Las muestras fueron extraí— das al azar del vivero, a fin de tener una probabilidad adecuada de — encontrar alguna planta con infección piral. Además de las plantas — muestreadas se usaron en la placa extractos de planta sana y enferma como controles negativo y positivo respectivamente. El método utilizado fue el de ELISA—indirecto y a partir de los resultados obtenidos en la medición de la absorbancia, se calculó el análisis de varianza y se hizo una diferenciación de medias usando el comparador de Tukey ). La placa tiene ocho hileras verticales, lo que permite cuantifi— car cuatro repeticiones (4 bloques). La distribución de las muestras en cada bloque, independiente de los otros, se realizó por medio de — una tabla de números aleatorios. 34 IV. RESULTADOS Los resultados obtenidos se presentan en el siguiente orden: A. Evaluación de la selección del material de cardamomo en plantacio— nes con alta incidencia al virus del mosaico del cardamomo; B. Evaluación del material de cardamomo seleccionado del campo e ino— culado naturalmente en la estación experimental; C. Mecanismos de diagnosis del WiCar en plantaciones adultas y viveros Comerciales. A. Evaluación de la selección del material de cardamomo en plantaciones con alta incidencia al Virus del mosaico del cardamomo Todo el material que fue encontrado aparentemente sano, fue some— tido a la prueba de ELISA en el laboratorio y reevaluado como positivo o negativo, según la reacción a la prueba. Del material con apariencia sana, solamente un 26.21% fue evaluado como positivo, es decir que se detectó la presencia del virus en él. La evaluación en esta etapa se limitó simplemente a una evaluación visual de la reacción. Las plantas que fueron reevaluados sin VMCar a partir de material de apariencia sana en plantaciones de alta incidencia fueron recolecta das y sembradas en la estación experimental en bloques de once posturas a partir de la división y reproducción por rizoma. El material presen te en la estación y su origen se presenta en el Cuadro 1. lb 54 lineas obtenidas de las áreas infectadas con VMCar y sembra das, se obtuvo un porcentaje de desarrollo de 75.59%0 lo que equivale 35 Cuadro 1 Codificación y origen del material promisorio libre del virus, plantado en la Estación Ex- perimental ubicada en la Finca Altamira. Código en la Material recolectado en Estación Experimental Nombre de la Finca Sección de la Finca 1-A 1-B 2-A 2-B 3-A 3-B 4-A 4-B 5-A 5-B 6-A 6-8 7-A 7-B 8-A 8-B 9-A 9-B 10-A Fca. Lblores Fca. Lblores Fca. Las Margaritas La Esperanza La. Victoria La Unión La Isla Guarumales Altos Guarumales Altos Guarumales Altos Guarumales Altos Guarumales Altos La Unión La Unión La Unión Ixcanalera I Ixcanalera I Ranchería Ranchería Ranchería Ranchería Iransval Eco.. Las Margaritas. Fca. Medellín Fca. Medellín Eco.. Medellín Fea. Medellín Fca. Medellín rica. Las Margaritas Fca. Las Margaritas Eco,. Las Margaritas Eco.. Patzulín Fea. Patzulin Fca. El Porvenir Fca. El Porvenir Fca. El Porvenir Fca. El Porvenir Fca. Altamira Continuación Cuadro 1. Código en la Material recolectado en Estación Experimental Nombre de la finca sección de la Finca 10-B Tico.. Altamira Yk'ansual 11-A Tm. Altamira franaval 11-B Fca. Altamira Transual A-12 Fca. Altamira flunsual B-12 Fca. Altamira D'ansval A-13 Fca. Altamira il-anspal B-13 Fca. Dolores Miramar A-14 Fca. El Encanto Concepción B-14 Fca. EU Encanto Concepción A-15 Pcia. El Encanto Concepción B-15 Fca. El Encanto Concepción A-16 Fca. Culpdh B-16 Fca. Culpdn A-17 Fca. Culpe B-17 Fca. Culpdn A-18 Fca. Culpdh B-18 Fca. Culjrin A-19 Fca. Culpdn B-19 Fca. Culpdn 56 Continuación Cuadro 1. Código en la Material recolectado en Estación Experimental Nombre de la finca Sección de la finca ....«. A-20 Fca. Culpdn 11-20 Fca. Culpdn A-21 Fca. Culpón B-21 Fca. Culpón A-22 Fca. Culpara B-22 Fca. Culprin A-23 Fca. Culpdn B-23 i Fca. La Igualdad ..j----- A-24 Fca. La Igualdad Igualdad B-24 Fca. La Igualdad Igualdad A-25 Fca. La Igualdad Igualdad B-25 Fca. La Igualdad Igualdad A-26 Fca. La Igualdad Igualdad B-26 Fca. La Igualdad Igualdad A-2? Fca. La Igualdad Igualdad 3? 38 a un promedio de ocho posturas por linea. Siendo la linea 20B la úni— ca pérdida, pues no desarrolló ninguna postura. B. Evaluación del material de cardamomo seleccionado del campo e inoculado naturalmente en la estación experimental El material recolectado en la estación fue evaluado aproximadamen te a los ocho meses después de su siembra. La evaluación se realizó a nivel de postura individual, es decir toda la población. Toda muestra recolectada implicó la evaluación de síntomas visuales al momento de — la toma. Estos resultados fueron comparados con la evaluación de los métodos de diagnóstico ELISA—directo e indirecto como puede verse en — las fi: .ros 4, 5 y 6. 1. Por el método ELISA—directo se evaluaron las 54 lineas con — las posturas presentes en cada una de ellas. La placa en la que fue— ron corridas puede verse en el Cuadro 2 el que incluye las correspon— dientes desviaciones standard y coeficientes de variación. Iú las 54 líneas evaluadas, 24 presentaron un porcentaje nulo de infección, tanto en análisis fotométrico como visual. El umbral de in lección varió respecto de la placa y esta diferencia fue debida al — tiempo de parar la reacción. Pero el umbral fue estandarizado median— te el cálculo del mismo a partir del valor de la media aritmética del control negativo más tres desviaciones standard. Eh general estas des viaciones tuvieron un rango de variabilidad de 0.021 hasta 0.195, Cua— dro 2. Eh la figura 7 puede notarse el punto a partir del cual las mes— 39 Síntomas ELISA- directo 0.75 3.50 HHNN rn en_t \ •-) C•-• CO C.D Cr‘ a H LIT_.\ 3 Fig. 4 Representación de los porcentajes de infección por ltnea en sin tomas y ELISA-directo. U síntomas ELISA- directo 40 O. 7 5 0. 53 •- rx: • cr: ;21 r-1 r1 (;,1 ír, • C%-- CO 0' C D 1-1 r-I rl ri r-1 1-1 rl H rl H 1-1 r---1 ri e-1 r-I r-4 rl N c‘i Ti:EA:3 Fig. 5 Representación de loS porcentajes de infección por linea en sin tomas y ELISA-directo. •-r: 4 4 < 4 ri al CV en rn 1-n 1-1-\\-3 N- N CV Z‘J N N \I N N N .1 IN CV .1_1:,711/2 3 Fig. 6 Representación de los porcentajes de infección por _linea en sín tomas y ELISA-directo. 42 Cuadro 2 Placas de ELISA-directo y ELISA-indirecto con doll.os de valor promedio, desviación standard, lineas, coeficiente de variación. LINEAS iii PLACA (PRV) KE valor promedio 'o ÷ desv. standard F )- 1A, 1B, 2A, 2,11 15-83 0.355 0.063 17.75 211, 4A. 16-83 0.442 0.058 13.12 3A, 3B, 411, 5A. 17-83 0.393 0.079 20.10 5A, 511, 6A, 6B. 18-83 0.350r 0.055 15.71 7A, 7B, 8A. 19-83 0.331 0.044 13.29 88, 9A, 911, 10A, 1011. 20-83 0.203 0.047 23.16 11A, 118,12A. 22-83 0.514 0.153 29.77 12A, 128, 13A. 23-83 0.440 0.070 15.91 1311, 14A, 14B, 15A. 24-83 0.811 0.102 12.58 15A, 158, 16A, 168. 25-83 0.751 0.195 25.97 1611, 17A, 1711, 18A. 26-83 0.692 0.087 12.57 18B, 19A, 198, 20A. 27-83 0.264 0.021 7.96 20A, 21A, 2111, 22A. 28-83 0.386 0.079 20.47 22A, 228, 23A. 29-83 0.252 0.064 25.40 24A, 248, 25A. 30-83 0.206 0.065 31.55 25A, 2511, 26A, 268. 31-83 0.175 0.037 21.14 2611, 27A, 278. 32-83 0.250 0.078 31.20 varias 33-83 0.337 0.049 14.54 no infect. 101-83 0.709 0.067 9.45 no infect. 102-83 0.232 0.035 15.09 vari2s 103-83 0.3C2 0.041 13.58 no infect 104-83 0.202 0.042 20.79 I a ELISA-indirecto 43 1 . 50 Umbral de infección 1 .00 F L_A C: Fig. 7 Controles positivos de cada placa y sus respectivos umbrales de infección. 44 tras fueron consideradoq positivds y la magnitud en la que el control positivo sobrepogó ese punto en cada una de las placas sometidas a es— tudio. El rango de variación obtenido en absorbancia dentro de una misma linea varió de 0.04 en la menor hasta 1.62 en la mayor, figuras 8 y 9. De los resultados obtenidos al emplear la técnica ELISA—directa — se detectó que algunos son contradictorios respecto a los síntomas pre sentes en las plantas. No obstante se correlacionaron con el porcenta je de infección proporcionado por los síntomas visuales. La correla— ción y ecuación de regresión dieron los valores de 0.879 y Y ® 0.966X 4- 0.012 respectivamente, lo que indica una alta correlación entre am— bos porcentajes de infección, figura 10. Todos aquellos resultados dudosos se volvieron a reevaluar por — ELISA de manera que la nueva correlación y ecuación de regresión fue— ron 0.998 y Y 1.002X+ (-0.002), lo que significa una correlación — extremadamente alta, figura 11. Los tres valores mós altos de todas aquellas plantas (líneas) con grado de infección nulo están en su mayoría por debajo del umbral de infección de forma palpable, como puede observarse en la figura 12. 2. Por el método de ELISA—indirecto los tres valores más altos obtenidos con ELISA—directo fueron corridos por ELISA—indirecto. Eh su mayoría corroboraron el grado nulo de infección de las líneas a ex— cepción de cuatro líneas, 4A, 10E, 11A y 17E, figura 13. Las que al momento de esta prueba ya presentaban síntomas visuales; mientras que CC a CC1 O- a al .c -c .4 rzi .-4G oj MS_y- Ian In •.0 r, N. ° O. O' o o rl ni 0,1 en-t ir•O u-1 rl rl rl An so án Au cT A (1 0 5 n i ) 45 LIITLAS fig. 8 ley-eaentación del rango entre la mayor y menor lectura-de auta linea por flISÁ-directo. st 1;11, ia rL 1.00 - 0.50 — -0_50 - ¢e¢e¢ e 6 e MI e e 01 et t'-clM 0, O r -ei Nn UNM '.0 ri N OJ N N N N N Ol OS N O! N N N Cu A ss oa nA tic i A 0+ 0$ n m ) 46 M NEM llp . 9 Re ~s'atochón del imnpo entre la mayor y menor lectura de cada linen por " 22f3_: i recto. - • • Y = 0.958.1 0.012 r 0.879 1 0.75 U •c2 47 0.25 0.53 3.75 1.00 3.1•12.1/..i.3 C5) Fig. 10 Regresión lineal y correlación entre porcentajes de plantas in fectadas con síntomas y ELISA—directo (sin corrección de resul tados dudosos). 7 .50 .25 o.75 :/19 1.002X -I- (-0.002) r = 0.08 48 0.25 0.50 0.75 1.00 317i-2ü:1A3 Fig.11 Regresidn y correlación entre porcentajes de plantas infectadas con síntomas 'y ELISA—directo (con correccidn de 'resultados dudo sos). 49 A B SO R B AN C I A (4 0 5 m i) - 0.25 1•F VWDral de • infección 1.00 0.75 0.50 - 0.25 -0.50 < .4- in •0 CO O' O tr < fe_ rol el rl •—I res/ CD r4 CM On cr) .2 Es. -ce .4 .2 GC me en .c t.- On •0 N cm cm N Cd CV CU CV rm cm LEILAS Fig. 12 Representación de los tres valores ',A altos de las plantas con resultado ne- gativo en rrru -directo. I pi. _si I la Í ---_- Umbral da infección .41 1:Q P:1 la • c.- G in %O CO ON O ri IN en en 4 •P GCGG C. 6 14