UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias y Humanidades Optimización de extracción de ADN y amplificación de los marcadores universales 16S y 18S ADNr para código de barras de ADN de microorganismos presentes en el Lago de Atitlán, Sololá y en un humedal artificial en El Progreso, Guatemala Trabajo de graduación presentado por Adriana María Carrillo Pérez para optar al grado de licenciada en Bioquímica y Microbiología presentado Guatemala 2019 Optimización de extracción de ADN y amplificación de los marcadores universales 16S y 18S ADNr para código de barras de ADN de microorganismos presentes en el Lago de Atitlán, Sololá y en un humedal artificial en El Progreso, Guatemala UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias y Humanidades Optimización de extracción de ADN y amplificación de los marcadores universales 16S y 18S ADNr para código de barras de ADN de microorganismos presentes en el Lago de Atitlán, Sololá y en un humedal artificial en El Progreso, Guatemala Trabajo de graduación presentado por Adriana María Carrillo Pérez para optar al grado de licenciada en Bioquímica y Microbiología presentado Guatemala 2019 i PREFACIO La elaboración de esta tesis surgió por el interés de la empresa Cementos Progreso de utilizar las aguas tratadas provenientes de aguas residuales de usos domésticos, con el fin de utilizar los microorganismos nativos para fines comerciales. En el caso del Lago Atitlán surgió por interés personal debido a la contaminación que se presenta en la actualidad, por lo que se buscaba implementar métodos fáciles y rápidos para la identificación de los microorganismos presentes para su posterior uso. La investigación de tesis ha sido posible gracias a la colaboración de Cementos Progreso, Centros de Estudios en Biotecnología (CEB) de la Universidad del Valle y del Centro de Estudios en Atitlán (CEA) por permitir utilizar las diferentes instalaciones y materiales para llevarla a cabo. Quiero agradecer, en primer lugar, a Yunuen Soto, asesora principal de la investigación, por su orientación y enseñanza a lo largo del proceso experimental. En segundo lugar, quiero agradecer a mi directora de carrera, Pamela Pennington, por su compañía a lo largo de la investigación y por cada uno de los consejos para la realización de la parte experimental y saber guiarme a lo largo del proceso. En lo personal, agradezco a todas las personas que estuvieron a mi lado en todo el proceso del trabajo experimental principalmente a mi familia por su apoyo incondicional y por darme ánimos en todo momento. ii ÍNDICE PREFACIO ............................................................................................................................. i LISTA DE FIGURA ................................................................................................................ iv LISTA DE CUADROS ........................................................................................................... vii RESUMEN .......................................................................................................................... viii I. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1 II. OBJETIVOS ............................................................................................................... 2 III. HIPÓTESIS ................................................................................................................ 3 V. MARCO TEÓRICO ..................................................................................................... 5 A. Microalgas......................................................................................................................................... 5 1. Características .............................................................................................................................. 6 2. Clasificación ................................................................................................................................. 7 3. Condiciones de crecimiento (cultivos) ......................................................................................... 7 4. Tipos de cultivos .......................................................................................................................... 8 B. Microorganismos procariotas ............................................................................................................ 9 C. Microorganismos eucariotas ............................................................................................................. 9 D. Biomasa .......................................................................................................................................... 10 1. Fuente como combustible ........................................................................................................... 10 2. Fuente como biofertilizante ........................................................................................................ 11 3. Aceites (Fuente como materia prima) ........................................................................................ 12 E. Humedal artificial ........................................................................................................................... 12 1. Componentes .............................................................................................................................. 12 2. Funciones ................................................................................................................................... 12 3. Tipos de humedales .................................................................................................................... 13 4. Aplicaciones ............................................................................................................................... 14 F. Lago de Atitlán ............................................................................................................................... 14 1. Características ............................................................................................................................ 14 2. Actualidad .................................................................................................................................. 15 3. Ecología...................................................................................................................................... 15 4. Toxinas producidas por cianobacterias ...................................................................................... 15 G. Código de barras de ADN ............................................................................................................... 16 H. Extracción de ADN ......................................................................................................................... 17 I. Marcadores universales 16S y 18S ................................................................................................. 18 1. Reacción en cadena de la polimerasa ......................................................................................... 19 VI. ANTECEDENTES ..................................................................................................... 22 iii VII. METODOLOGÍA ...................................................................................................... 23 VIII. RESULTADOS ......................................................................................................... 30 IX. ANÁLISIS DE RESULTADOS.................................................................................... 59 X. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 65 XI. RECOMENDACIONES ............................................................................................. 66 XII. REFERENCIAS ........................................................................................................ 67 XIII. ANEXOS ................................................................................................................. 73 XIV. GLOSARIO ........................................................................................................... 118 iv LISTA DE FIGURA Figura 1. Principales características de microalgas ......................................................................................... 6 Figura 2. Tipos de fotobiorreactores. A) Fotobiorreactor tubulares. B) Fotobiorreactor en placa. C) Fotobiorreactores en columna vertical. D) Fotobiorreactores semi-abierto .................................................... 8 Figura 3. Morfología de microorganismos procariotas. .................................................................................. 9 Figura 4. Clasificación de algas eucariotas. A) Euglenophyta B) Dinoflagelados C) Diatomeas D) Clorophyta (algas verdes) E) Phaeophyta F) Rhodophyta............................................................................. 10 Figura 5. Tipos de humedales artificiales según el flujo del agua ................................................................. 13 Figura 6. Humedal artificial de flujo subsuperficial horizontal ..................................................................... 14 Figura 7. Flujo de trabajo para código de barras para ADN .......................................................................... 17 Figura 8. Representación del gen ARNr 16S de las 9 regiones conservadas (V1-V9). Corresponden a la secuencia del genoma de Escherichia coli ..................................................................................................... 19 Figura 9. Representación del gen ARNr 18S de las 9 regiones conservadas (V1-V9). Corresponden a la secuencia de S. cerevisiae ............................................................................................................................. 19 Figura 10. Diagrama del proceso de la reacción en cadena de la polimerasa ................................................ 21 Figura 11. Flujo de trabajo (Los números corresponden a los objetivos específicos) ................................... 25 Figura 12. Cuadros de cámara Neubauer (El conteo de células se realizó en los cuadros resaltados en verde) ....................................................................................................................................................................... 29 Figura 13. Diagrama del humedal artificial con la localización de los puntos de muestreo. H = humedal. .. 30 Figura 14. Localización del centro Weiss muestreado en el Lago de Atitlán ................................................ 31 Figura 15. Diagrama de dispersión de cuantificación por medio de espectrofotometría en muestras frescas y congeladas del humedal artificial. .............................................................................................................. 34 Figura 16. Diagrama de dispersión de cuantificación por medio de fluorometría en muestras frescas y congeladas del humedal artificial. ................................................................................................................. 35 Figura 17. Productos de amplificación de PCR 18S (Ek82_F y Proto5_R) de muestras frescas y congeladas del humedal artificial en gel de agarosa 0.8%. .............................................................................................. 37 Figura 18. Productos de amplificación de PCR 16S (27_F y 1492_R) de muestras frescas y congeladas humedal artificial en gel de agarosa 0.8%. .................................................................................................... 38 Figura 19. Productos de amplificación de PCR 16S (27_F y 1492_R) de muestras frescas del centro del Lago de Atitlán y muestras perservadas con RNAlater del humedal artificial en gel de agarosa 0.8%. ....... 39 Figura 20. Productos de amplificación de PCR 18S (Ek82_F y Proto5_R) de muestras frescas del centro Lago Atitlán a distintas profundidades y muestras preservadas con RNAlater del humedal artificial en gel de agarosa 0.8%. ............................................................................................................................................ 39 Figura 21. Productos de amplificación de PCR 18S (V4_F y V4_R) de muestras frescas del humedal artificial en gel de agarosa 0.8%. ................................................................................................................... 40 Figura 22. Patrones de restricción obtenidos de la digestión enzimática con RsaI en productos 18S (Ek82_F y Proto5_R) de muestras frescas del centro Lago Atitlán a distintas profundidades y muestras frescas del humedal artificial en gel de agarosa 2.0%. .................................................................................................... 41 Figura 23. Patrones de restricción obtenidos de la digestión enzimática con RsaI en productos de PCR 16S (27_F y 1492_R) de muestras congeladas del humedal artificial en gel de agarosa 2.0%. ........................... 42 Figura 24. Patrones de restricción obtenidos de la digestión enzimática con RsaI en productos de PCR 18S (Ek82_F y Proto5_R) de muestras congeladas del humedal artificial en gel de agarosa 2.0%. .................... 43 Figura 25. Mapa de calor de bandas obtenidas de la digestión enzimática con RsaI en productos PCR 18S (Ek82_F y Proto5_R) para microorganismos presentes en humedal artificial y Lago de Atitlán ................. 44 Figura 26. Alineamiento de cebadores universales 18S V4_F y V4_R con las secuencias para el género Nitzschia sp. .................................................................................................................................................. 48 Figura 27. Alineamiento de cebadores universales 18S V4_F y V4_R con secuencias para el género Phormidium sp. y Phormidium autumnale. ................................................................................................... 48 Figura 28. Alineamiento de cebadores universales 18S V4_F y V4_R con secuencias para el género Calonesis sp. .................................................................................................................................................. 49 Figura 29. Alineamiento de cebadores universales 18S V4_F y V4_R con secuencias para el género Spirogyra sp................................................................................................................................................... 49 Figura 30. Alineamiento de cebadores universales 18S V4_F y V4_R con secuencias para el género Navicula sp. ................................................................................................................................................... 49 v Figura 31. Alineamiento de cebadores universales 18S V4_F y V4_R con secuencias para el género Euglena sp. .................................................................................................................................................... 50 Figura 32. Alineamiento de cebadores universales 18S V4_F y V4_R con secuencias para el género Ooscytis sp. ................................................................................................................................................... 50 Figura 33. Alineamiento de cebadores universales 18S V4_F y V4_R para secuencias para el género Chlorococcum sp. .......................................................................................................................................... 51 Figura 34. Alineamiento de cebadores universales 18S V4_F y V4_R para secuencias para el género Closterium sp................................................................................................................................................. 51 Figura 35. Alineamiento de cebadores universales 18S V4_F y V4_R para secuencias para el género Wilmottia sp. ................................................................................................................................................. 52 Figura 36. Diagrama de los cebadores V643 y V804 para la región V4 ....................................................... 53 Figura 37. Identificación de microorganismos por PCR in silico del cebador V643 para la región V4 ........ 53 Figura 38. Identificación de microorganismos por PCR in silico del cebadore V804 para la región V4 ...... 55 Figura 39. Promedio de conteo de células de los diferentes puntos de muestreo en el humedal artificial .... 57 Figura 40. Promedio de conteo de células de los diferentes puntos de muestreo en el humedal artificial .... 58 Figura 41. Diagrama de dispersión de dos métodos de cuantificación en muestras frescas del humedal artificial. ........................................................................................................................................................ 85 Figura 42. Diagrama de dispersión de dos métodos de cuantificación en muestras congeladas del humedal artificial. ........................................................................................................................................................ 85 Figura 43. Diagrama de dispersión de dos métodos de cuantificación en muestras frescas del centro del Lago Atitlán................................................................................................................................................... 86 Figura 44. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Nitzschia sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 86 Figura 45. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Nitzschia sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 87 Figura 46. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Euglena sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 88 Figura 47. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Euglena sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 89 Figura 48. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Caloneis sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 91 Figura 49. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Caloneis sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 92 Figura 50. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Spirogyra sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 93 Figura 51. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Spirogyra sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 95 Figura 52. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Navicula sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 96 Figura 53. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Navicula sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 97 Figura 54. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Ooscystis sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 98 Figura 55. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Oocystis sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 98 Figura 56. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Chlorococcum sp. por el programa Cluster Muscle .............................................................................................................................. 99 Figura 57.Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Chlorococcum sp. por el programa Cluster Muscle ............................................................................................................................ 100 Figura 58. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Closterium sp. por el programa Cluster Muscle ............................................................................................................................ 101 Figura 59. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Closterium sp. por el programa Cluster Muscle ............................................................................................................................ 102 Figura 60. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Wilmottia sp. por el programa Cluster Muscle ............................................................................................................................ 103 vi Figura 61. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Wilmottia sp. por el programa Cluster Muscle ............................................................................................................................ 105 Figura 62. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Phormidium sp. por el programa Cluster Muscle ............................................................................................................................ 107 Figura 63. Alineamiento de cebadores V4_F y V4_R con secuencia del género Phormidium sp. por el programa Cluster Muscle ............................................................................................................................ 107 vii LISTA DE CUADROS Cuadro 1. Clasificación de microalgas según: divisiones, clase, orden (SILVA, 2019) ................................. 7 Cuadro 2. Marcadores universales 16S y 18S que se probaron en este estudio ............................................ 19 Cuadro 3. Variables dependientes e independientes ...................................................................................... 24 Cuadro 4. Secuencia de cebadores utilizados en este estudio ........................................................................ 27 Cuadro 5. Condiciones termociclador PCR 16S (27_F y 1492_R) y 18S (Ek82_F y Proto5_R) .................. 27 Cuadro 6. Condiciones termociclador PCR 18S cebadores V4_F y V4_R ................................................... 28 Cuadro 7. Comparación de dos métodos de cuantificación de ADN por medio de espectrofotometría y fluorometría de muestras frescas del humedal artificial. ............................................................................... 32 Cuadro 8. Comparación de dos métodos de cuantificación de ADN por medio de espectrofotometría y fluorometría de muestras frescas del centro de Lago Atitlán a distintas profundidades. ............................... 32 Cuadro 9. Comparación de dos métodos de cuantificación de ADN por medio de espectrofotometría y fluorometría de muestras congeladas de humedal artificial. .......................................................................... 33 Cuadro 10. Prueba estadítica Kruskal-Wallis para muestras frescas y congeladas. ...................................... 35 Cuadro 11. Prueba Post-Hoc ......................................................................................................................... 35 Cuadro 12. Tamaño de bandas obtenidas de la digestión enzimática con RsaI en productos de 18S (Ek82_F y Proto5_R) de muestras frescas del centro Lago Atitlán a distintas profundidades y muestras frescas del humedal artificial en gel de agarosa 2.0%. .................................................................................................... 41 Cuadro 13. Tamaño de bandas obtenidas de la digestión enzimática con RsaI en productos de PCR 16S (27_F y 1492_R) de muestras congeladas del humedal artificial en gel de agarosa 2.0%. ........................... 42 Cuadro 14. Tamaño de bandas obtenidas de la digestión enzimática con RsaI en productos de PCR 18S (Ek82_F y Proto5_R) de muestras congeladas del humedal artificial en gel de agarosa 2.0%. .................... 43 Cuadro 15. Identificación de microalgas y su posible aplicación .................................................................. 45 Cuadro 16. Diseño de cebador V643 para eucariotas para la región V4 ....................................................... 52 Cuadro 17. Diseño de cebador V804 para eucariotas para la región V4 ....................................................... 52 Cuadro 18. Prueba estadítica Kruskal-Wallis para los diferentes puntos de muestreo. ................................. 58 viii RESUMEN Las microalgas, procariota y eucariota tienen una amplia variedad de aplicaciones en biotecnología, alimentos, energía y agricultura. Suelen estar en exceso en diferentes cuerpos de agua naturales altamente contaminados por incremento de nutrientes. Asimismo, tienen un rol importante en la remediación de aguas residuales a través de sistemas de tratamiento de agua, por ejemplo, humedal artificial. El objetivo de este estudio fue desarrollar un método molecular para la identificación de microalgas presentes en un humedal artificial (Sanarate) y en el Lago de Atitlán (Sololá). Para esto se realizó extracción de ADN de muestras frescas y congeladas por el método de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), amplificación de los marcadores universales 16S (cianobacterias) y 18S ADNr (eucariotas) y análisis de patrones de restricción por digestión enzimática de los amplicones con RSAI. Además, se realizó caracterización microscópica en muestras fijadas en lugol 2% y se cuantificaron con cámara de Neubauer. Se obtuvo amplificación de los dos marcadores universales en las muestras analizadas, sugiriendo presencia de microalgas de ambos orígenes. También se determinó diferencia en los patrones de restricción entre las muestras del humedal artificial y del Lago de Atitlán. Por último, en el humedal artificial se identificó morfológicamente (hasta género) y se encontró en mayor cantidad: Chlorella 44%, Euglena 8% y de morfología filamentosa 5% como Spirogyra sp. y Wilmottia sp. entre otras en muestras del humedal artificial. A partir de estos resultados se puede continuar con el desarrollo de un método molecular óptimo y más rápido para identificación de microalgas. También se sugiere el aprovechamiento de Euglena sp. y Spirogyra sp. para la producción de biocombustibles debido a su amplia aplicación en biotecnología. 1 I. INTRODUCCIÓN Las microalgas son microorganismos unicelulares o agrupados, en colonias o filamentos, fotosintéticos que se encuentran en diferentes cuerpos de agua y en tierra. Se ha visto que estos microorganismos tienen capacidad biorremediadora, lo cual consiste en la eliminación o biotransformación de compuestos contaminantes de un medio natural. Los compuestos son captados por la biomasa algal y pueden ser recuperados mediante su cosecha, con el objetivo final de eliminación de contaminantes y producción de biomasa con fines comerciales como: biofertilizantes, biocombustibles de cuarta generación, alimentación animal, cosméticos, consumo humano, entre otros. Por lo tanto, esta investigación pretendió determinar la diversidad de microalgas y cianobacterias para evaluar su potencial como materias primas sustitutas de bajo costo e impacto ambiental e implementar en el laboratorio de Bioquímica y microbiología técnicas moleculares para la identificación de estos microorganismos. Este estudio se realizó en dos cuerpos de agua de diferente naturaleza: el primero fue un humedal artificial ubicado en Sanarate (El Progreso), el segundo en el Lago de Atitlán, ubicado en el departamento de Sololá. Las muestras de agua se recolectaron en los meses de julio y septiembre 2019 y se procesaron en los laboratorios de la Universidad del Valle de Guatemala para su análisis. El presente estudio se implementó un método óptimo de extracción de ADN y amplificación de los marcadores universales 16S y 18S ADNr de microalgas nativas de los cuerpos de agua mencionadas anteriormente. Se obtuvo amplificación de los dos marcadores universales en las muestras analizadas, sugiriendo presencia de microalgas de ambos orígenes. De modo que servirá de antecedente para posteriores estudios de caracterización molecular y análisis de código de barras de ADN (DNA barcording) para funciones taxonómicas para posteriores investigaciones. 2 II. OBJETIVOS A. Objetivo general Implementar un método óptimo de extracción total de ADN y amplificación de los marcadores universales 16S y 18S ADNr de microalgas nativas de diferentes cuerpos de agua. B. Objetivos específicos 1. Optimizar el método de extracción de ADN de microorganismos presentes en diferentes muestras de agua. 2. Estandarizar la técnica molecular de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) para el marcador universal de procariotas 16S ADNr. 3. Estandarizar la técnica molecular de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) para el marcador universal de eucariotas 18S ADNr. 4. Determinar diferencia de patrones de restricción en productos de PCR de 16S y 18S en los diferentes puntos de muestreo. 5. Caracterizar y cuantificar microscópicamente organismos presentes en las muestras del Humedal artificial. 6. Diseñar cebadores 18S para la región V4 para la identificación de microalgas eucariotas. 3 III. HIPÓTESIS El método de extracción de ADN por el método de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y PCR pueden ser óptimos para microorganismos procariotas y eucariotas de los diferentes cuerpos de agua. 4 IV. JUSTIFICACIÓN El estudio se centró en dos diferentes cuerpos de agua: un humedal artificial ubicado en Sanarate (El Progreso) y el Lago de Atitlán (Sololá). El humedal es una zona que se encuentra en una superficie terrestre saturada de agua, regulada por factores climáticos y en constante interrelación con los seres vivos que se encuentran en su interior. Son utilizados para la mejora de la calidad de las aguas en ecosistemas naturales. Se seleccionó el humedal artificial de la empresa Cementos Progreso en la planta de San Miguel (Sanarate, El Progreso), construido en el año 2,000, con el fin de tratar las aguas residuales provenientes de usos domésticos. Cementos Progreso es una empresa guatemalteca que se compromete al cuidado del medio ambiente, se busca utilizar los microorganismos nativos para fines comerciales. El Lago de Atitlán es un ecosistema que constituye el medio en el cual interactúan variedad de flora y fauna. Se caracteriza por se una cuenca endorreica, es decir, que no tiene una salida de agua fluvial hacia el océano. Este cuerpo de agua que tiene alta contaminación principalmente por agua residuales, basura sólida y químicos usados en actividades agrícolas por ende afecta a las comunidades cercanas. Se tienen registros que, desde la década de 1980, los niveles de contaminación se han incrementado en el agua del lago debido al producto de la actividad humana en la cuenca. Principalmente por el aumento de la población que ha provocado una mayor descarga de aguas residuales sin tratamiento, mayor deforestación en la cobertura boscosa causando arrastre del suelo por escorrentía en la estación lluviosa, así como el aumento en el uso de detergentes y fertilizantes químicos. Estos factores han provocado el aumento en la concentración de nutrientes (principalmente nitrógeno y fósforo) en el lago promoviendo florecimientos de microalgas potencialmente dañinas que afectan el ecosistema y a las comunidades aledañas. En los últimos años se han realizado diferentes estudios en los cuales se ha demostrado que las microalgas y cianobacterias son materias primas alternativas para la producción de alimentos (alimentos fermentados, aditivos o suplementos, preservación de alimentos y biomasa), energía y medio ambiente (biocombustibles, biorremediación, ensayos de toxicidad y bioindicadores), agricultura (fijación de nitrógeno, biofertilizantes y ciclos de nutrientes) y biotecnología (producción de fármacos, suplementos dietéticos y pigmentos. Por lo tanto, esta investigación pretendió determinar la diversidad de microalgas y cianobacterias en el humedal artificial de Cementos Progreso y un análisis preliminar de muestras del Lago de Atitlán para evaluar su potencial como materias primas sustitutas de bajo costo e impacto ambiental. 5 V. MARCO TEÓRICO A. Microalgas Las microalgas son microorganismos unicelulares o agrupadas en colonias o filamentos fotosintéticos que se encuentran en diferentes cuerpos de agua (dulces, saladas, lagos hipersalinos, desiertos y ecosistemas árticos) (Ganesan V, 2014). El componente principal de las células eucariotas en su pared celular es la celulosa y además pueden contener macromoléculas como la pectina y peptidoglucano. Las células procariotas se dividen en dos grupos Gram-negativas y Gram-positivas ambas contienen en su pared celular peptidoglucano, con excepción que las Gram-positivas que carecen de una membrana externa pero se encuentran rodeadas por capas de peptidoglucano mucho más gruesas que las que se encuentran en las células Gram-negativas. Dentro de las capas de peptiglucano se encuentran polímeros aniónicos, llamados ácidos teicoicos (Silhavy, Kahne, & Walker, 2010). Las microalgas se encuentran presentes en un rango bajo de temperaturas y nutrientes y son responsables de la producción del 50% del oxígeno y fijación del 50% del carbono en la tierra (Hernández, 2009). Se estima que existen más de 100,000 especies y se encuentran en diferentes formas, con un diámetro de 0.2 a 2.0𝜇m y con una longitud de hasta 60m. Están constituidas por proteínas, carbohidratos y lípidos (Hernández, 2009), estos pueden ir variando según la manipulación que se reciba de nutrientes, cantidad luz solar y dióxido de carbono (Braida, Tartaglia, Campot, & Nervi, 2015). Al ser microorganismos fotosintéticos pueden ser autótrofos o heterótrofos (Guamán, Nory, & Romero, 2016). Los autótrofos almacenan energía química en moléculas de carbohidratos que sintetizan (Del Carmen & García, 2013). Los heterótrofos son algas dependientes de la glucosa u otras fuentes de carbono para el metabolismo del carbono y energía y algunas microalgas pueden crecer de forma mixotrófica (autótrofos y heterótrofos). Debido a que las microalgas son ricas en energía han recibido atención por su facilidad de adaptación para crecer en fotobiorreactores o estanques abiertos para la producción de aceites y lípidos para múltiples aplicaciones (Guamán et al., 2016). Las microalgas se pueden subdividir en algas eucariotas y procariotas (Ganesan V, 2014). Los eucariotas poseen orgánulos celulares definidos: núcleos, cloroplastos, mitocondrias, además presentan diferentes pigmentos fotosínteticos. Entre estas se encuentran: rodofitas, clorofitas, dinofitas, crisofitas, prymnesiofitas, bacillariofitas, xantofitas, eustigmatofitas, rhaphidofitas y feofitas. Los procariotas (cianobacterias o azul- verde) son primitivos y poseen la estructura celular más simple de las bacterias y se encuentran distribuidos en hábitat terrestres y acuáticos. Estos microorganismos son eficientes para convertir la energía solar en biomasa al tener acceso a agua, dióxido de carbono y otros nutrientes por medio de la fotosíntesis (Guamán et al., 2016). Entre las microalgas importantes que convierten la energía solar en biomasa son: Anthospira maxima, Botrycoccus brauanii, Scenedesmus quadricauda, Chorella vulgaris, Dunaliella salina y Chaetoceros muelleri (Ghayal & Pandya, 2013). 6 1. Características Entre las características de las microalgas se encuentran (Vega Naranjo & la, 2014): Figura 1. Principales características de microalgas 7 2. Clasificación En el siguiente cuadro se presenta la clasificación de microalgas: Cuadro 1. Clasificación de microalgas según: divisiones, clase, orden Divisiones Clase Orden Cryptophyta (Diatomeas) Cryptophyceae Cryptophyceae Pyrophyta (Dinoflagellata) Dinophyceae Peridiniales Adinophyceae Prorocentrales Haptophyta Pymnesiophyceae Euglenophyta (Euglenozoa) Euglenophyceae Euglenales Clorophyta (algas verdes) Clorophyceae Charophyceae Mikromonadophyceae Pleurastrophyceae Olvophyceae Phaeophyta Phaeophyceae Laminariales Desmarestiales Ectocarpales Chordariales Dictyosiphonales Seytosiphonales Dictyotales Fucales Ochrophyta Bacillariophyceae Chrysophyceae Dictyochophyceae (SILVA, 2019) 3. Condiciones de crecimiento (cultivos) Los cultivos de microalgas deben cumplir ciertas condiciones para su crecimiento entre ellas se encuentran (Hernández-Pérez & Labbé, 2014): - Luz: Este es una de las condiciones más importantes para el cultivo de microalgas debido a que la usencia de la misma no alcanzaría para su tasa de crecimiento y el aumento de la misma podría ocasionar la fotoinhibición; el cual es el punto de saturación que conduce a la muerte celular. El rango de luz óptimo es de 2,000-4,000lux y tienen un ciclo 10-30 horas. - pH: Está influenciado por productividad algal, respiración, alcalinidad y composición iónica, actividad microbiana autotrófica y heterotrófica. El rango de pH para la mayoría de los cultivos se encuentra entre 7 y 9, siendo un rango óptimo de 8.2 a 8.7 (J, R. Benavente-Váldes, J.C. Montañez, C.N. Aguilar, 2009). - Temperatura: Esta varía entre especies pero el rango de temperatura óptima se encuentra entre 28- 35°𝐶. - Dióxido de carbono: Aumenta la productividad microalgal. La concentración de dióxido de carbono tolerable para diferentes especies de microalgas se encuentra entra 10-15%. 8 - Nutrientes: Entre los principales se encuentran nitrógeno y fósforo. Estos ayudan en la regulación de lípidos, en la formación de ácidos nucleicos y transferencia de energía. 4. Tipos de cultivos Los cultivos de microalgas se dividen en dos tipos: abiertos y cerrados. Los sistemas abiertos se refiere que la biomasa está expuesta a las condiciones del medio ambiente y los cerrados se encuentran en fotobiorreactores, es decir, no se encuentran en contacto con el medio externo (Ramírez, Queiroz Zepka, & Jacob-Lopes, 2013). Los sistemas cerrados son llamados fotobiorreactores los cuales son contenedores artificiales en dónde en su interior se puede generar condiciones necesarias para que los microorganismos se cultiven, crezcan y se desarrollen de manera rápida y eficiente para generar biomasa. En el campo de biotecnología, este tipo de biorreactor se utiliza para el cultivo de microalgas con el propósito de fijar dióxido de carbono para la producción de biomasa como se mencionó anteriormente, mediante la reacción de la fotosíntesis que se lleva a cabo (Mendoza-Guzmán, de la Jara-Valido, & Portillo-Hahnefeld, 2011). Los sistemas cerrados tienen diversas ventajas entre ellas se encuentran: mayor rendimiento en la depuración del agua, mayor eficiencia del proceso de fotosíntesis, reducción de la pérdida de dióxido de carbono, evita los malos olores y la evaporación del agua, evita la contaminación por otros microorganismos lo cual ayuda a tener volúmenes de biomasa mayores y permite la regulación de parámetros que intervienen (Piñeiro, 2015). Los diseños de estos pueden ir variando. Pueden ser tubulares, columna vertical con burbujeo, semi-abierto y panel vertical/horizontal (ver Figura 3) (Ramírez et al., 2013). Figura 2. Tipos de fotobiorreactores. A) Fotobiorreactor tubulares. B) Fotobiorreactor en placa. C) Fotobiorreactores en columna vertical. D) Fotobiorreactores semi-abierto. (Piñero, 2015) 9 B. Microorganismos procariotas Las bacterias se caracterizan por no tener su material genético en el núcleo (Lumen, 2018). Los microorganismos procariotas se encuentran en la mayoría de los hábitats de la Tierra: agua, suelo y sedimentos. Estas pueden llegar a medir entre 0.2-2.0 μm. Son componentes importantes en los ciclos biogeoquímicos de la biósfera y representan una gran parte de la diversidad genética (Whitman, Coleman, & Wiebe, 1998). Las formas comunes son cocos (esféricas), bacilos (bastones), espirilo, espiroqueta o Vibrio (curvas) (ver Figura 4) (Lumen, 2018). Figura 3. Morfología de microorganismos procariotas. (Lumen, 2015) C. Microorganismos eucariotas El dominio Eukarya incluye a las eucariotas unicelulares o pluricelulares, por ejemplo: protistas, hongos, plantas, algas y animales. La característica principal es que su material genético se encuentra dentro de un núcleo (Lumen, 2018). Además, estas cuentan con orgánulos que les permite realizar reacciones bioquímicas las cuales les ayuda sobrevivir y reproducirse. Las algas son organismos fotosintéticos que extraen energía del sol y liberan oxigeno y carbohidratos a su alrededor; su pared celular es de celulosa y carbohidratos. Estas se pueden dividir en varios tipos según su morfología o modo de crecimiento (Robert A. Andersen Ralph A. Lewin, 2019). Se pueden dividir en algas verdes, rojas, pardas y doradas (ver Figura 4) 10 Figura 4. Clasificación de algas eucariotas. A) Euglenophyta B) Dinoflagelados C) Diatomeas D) Clorophyta (algas verdes) E) Phaeophyta F) Rhodophyta (Braida et al., 2015) D. Biomasa En la fotosíntesis por medio de la luz solar y dióxido de carbono se produce variedad de moléculas orgánicas y biomasa, por medio de este proceso los organismos fotoautotróficos como las plantas, algas y cianobacterias almacenan energía solar y esto tiene potencial para cubrir una parte significativa de la demanda mundial de energía (Benedetti; et al, 2018). Es parte importante para el ciclo del carbono de la Tierra, ya que ayuda a regular la cantidad de luz solar que entra en la atmósfera de la Tierra (Ghayal & Pandya, 2013). Se han utilizado diferentes combustibles de biomasa para la generación de energía bioenergética, como los residuos agrícolas, residuos de madera, cultivos energéticos específicamente como materiales de desecho (Freiberg, Scharfe, Murta, & Seidler, 2018) 1. Fuente como combustible Los lípidos son la fuente principal para la producción de biodiesel y se encuentran presentes entre el 20- 50% de su peso seco o incluso valores más altos. Esto se debe a la eficiencia fotosintéticas que tiene las microalgas y se define como la función de la energía luminosa absorbida que es fijada como energía química en la biomasa durante el crecimiento autotrófico. Las microalgas aprovechan la radiación solar entre los 400 y 700nm de longitud de onda denominado Radiación fotosintéticamente activa (Hernández, 2009). Los lípidos producidos por microalgas se clasifican en dos: no polares (almacenamiento: acilgliceroles, esteroles, ácido grasos libres y ésteres de esterilo) y polares (estructurales). Los principales componentes de lípidos de almacenamiento se encuentran triacilgliceroles (TAGs) entre los cuales se encuentran ácidos grasos saturados e insaturados, glucolípidos, fosfolípidos y pigmentos; entre los lípidos estructurales se encuentran los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) (Chen, Wang, Qiu, & Ge, 2018). Es importante mencionar que 11 no todos los lípidos sintetizados por las microalgas son funcionales para la producción de biodiesel. Las cantidades de estos lípidos varían según la especie, las condiciones de crecimiento y el ambiente. Se sabe que el contenido de lípidos varía entre 20-50% de la biomasa seca, entre estas se encuentran: Chlorella, Crypthecodinium, Cylindrotheca, Dunaliella, Isochrysis, Nannochloris, Nannochloropsis, Neochloris, Nitzschia, Phaeodactylum, Porphyridium, Schizochytrium y Tetraselmis (Sajjadi, Chen, Raman, & Ibrahim, 2018). Entre los apropiados se encuentran ácidos grasos, libres y unidos covalentemente al glicerol y sus derivados, los cuales son producidos con mayor frecuencia, usualmente se encuentran entre el 20-40% (Hernández, 2009). La producción de biocombustibles se puede clasificar de 2 formas: conversión termoquímica y bioquímica. Conversión termoquímica la biomasa se descompone por medio de calor y la conversión bioquímica consiste en la degradación biológica de la biomasa por medio de reacciones químicas y biológicas asociadas a procesos metabólicos (Hernández-Pérez & Labbé, 2014). Las investigaciones que se han realizado acerca de esta nueva fuente de combustibles tienen diversas ventajas entre ellas se encuentra que las condiciones de cultivo pueden ser controlados por medio de la limitación de nutrientes y no requieren productos agrícolas o tierras de cultivo para su producción. Además, esta tecnología conlleva al reciclaje del dióxido de carbono liberado en las emisiones industriales. Adicional a esto la biomasa residual ha sido factible para la alimentación para los seres vivos y en la producción de otros biocombustibles o de fertilizantes (Hernández, 2009). 2. Fuente como biofertilizante Los biofertilizantes son compuestos orgánicos de los microorganismos vivos para promover el crecimiento de semillas, plantas o bacterias del suelo mediante nutrientes esenciales como nitrógeno, fósforo, potasio, etc. Las características principales de estos es la mejora de la productividad de los cultivos en un tiempo relativamente corto, reducción de consumo de energía, aumento en la fertilidad de los suelos y el control biológico de los organismos fitopatógenos (Win, Barone, Secundo, & Fu, 2018). Estudios recientes han observado que diferentes tipos de microoganismos fotosintéticos como las microalgas eucariotas y procariotas ayudan en la recirculación y biodisponibilidad de elementos importantes como lo son el fósforo, hierro y nitrógeno, por lo tanto, son importantes para el acondicionamiento de suelos agrícolas. Actualmente, se ha utilizado para incrementar la productividad de diferentes cultivos principalmente en maíz y arroz ya que estos se utilizan para alimentación de seres humanos, ganado y aves, los cultivos en los últimos años han ido aumentando la demanda por lo que se debe de mejorar su crecimiento y rendimiento (Dineshkumar et al., 2019). Para la utilización de algunas técnicas de conversión se encuentra la pirólisis en esta técnica se produce carbón vegetal, llamado Biochar o Biocarbón, el cual posee un alto potencial como fertilizante en la agricultura (Hernández-Pérez & Labbé, 2014). Los biofertlizantes a base de algas ha ido aumentando desde el año 2015. Se ha utilizado como modelo Chlorella sp. y se ha observado que las especies de Anabaena han mostrado la capacidad de promover la fertilidad del suelo (Win et al., 2018). 12 3. Aceites (Fuente como materia prima) Contienen entre 25-77% de aceites los cuales se pueden convertir en biocombustible, estos presentan una alternativa para los problemas ambientales como el aumento en las emisiones de dióxido de carbono (Al Hattab M, Ghaly A, 2015). Los aceites principales que se encuentran en las microalgas son ácidos grasos poliinsaturados especialmente ácido eicosapentaenoico (EPA), araquidónico, aminoácidos y ácido docosahexaenoico (DHA, siglas en inglés) (Molina-Grima, Antonio, & Pérez, 1993). El 30% de la producción de las microalgas se utilizan para el consumo animal entre los cuales se encuentran gatos, perros, peces, aves ornamentales, caballos, vacas, toros, moluscos y crustáceos (Hernández-Pérez & Labbé, 2014). E. Humedal artificial Es una zona que se encuentra en la superficie terrestre saturada de agua, regulada por factores climáticos y en constante interrelación con los seres vivos que se encuentran dentro de él. Realizan diferentes procesos físicos, químicos y biológicos, los cuales se basan en fitorremediación. Es una técnica que aprovecha la capacidad de las plantas para absorber, acumular, metabolizar, volatilizar o estabilizar contaminantes presentes en suelo, aire, agua o sedimentos, como metales pesados (Romero, 2015). En estos humedales crecen y se desarrollan diferentes tipos de vegetales, animales y microorganismos adaptados a estas condiciones de inundaciones temporales o permanentes. 1. Componentes Los principales componentes son (Shi; et al, 2011): - Sustrato o materia granular: esto sirve de soporte a la vegetación y permite fijación de biopelícula bacteriana la cual interviene en los procesos de eliminación de contaminantes. - Vegetación: se encuentra mayormente por macrófitas emergentes las cuales contribuyen a la oxigenación del sustrato, eliminación de nutrientes de absorción o extracción y al desarrollo del sustrato y la vegetación. - Agua que tratar: esta circula por la vegetación y el sustrato. 2. Funciones Las funciones de un humedal artificial son (Richardson, 1994): 1. Fijar los contaminantes en la superficie de suelo y materia orgánica. 2. Utilizar y transformar los elementos por intermedio de los microrganismos. 3. Alcanzar los niveles de tratamiento de aguas residuales consistentes con un bajo consumo de energía y bajo mantenimiento. 13 4. Mejorar la calidad del agua. 3. Tipos de humedales La Figura 5 muestra los diferentes tipos de humedales artificiales según el contacto del agua con la atmósfera: Figura 5. Tipos de humedales artificiales según el flujo del agua (Romero, 2015) i. Humedal artificial de flujo subsuperficial horizontal En el humedal artificial de flujo subsuperficial horizontal el agua circula horizontalmente a través del sustrato y de la vegetación de forma continua. Estos tienen una fase de tierra o arena al fondo la cual está recubierta por una membrana impermeable para evitar filtraciones del suelo y contiene macrófitas acuáticas (Romero, 2015). El agua residual para tratar es colocada en un extremo y es recogida por el tubo de drenaje que se encuentra en el otro extremo; esta se trata conforme esta fluye. Esta agua residual no entra directamente al sistema, sino que esta tiene un sistema de amortiguación generalmente por tierra/arena de mayor grosor (Salazar, 2015), según se observa en la Figura 6. Tipos de humedales Flujo libre o superficial (FWS, Free Water Surface) Flujo subsuperficial (SFS o VSB, Vegetated Submerged Bed) Flujo subsuperficial vertical Flujo subsuperficial horizontal 14 Figura 6. Humedal artificial de flujo subsuperficial horizontal. (Salazar, 2015) 4. Aplicaciones Los humedales artificiales son utilizados para la mejora de la calidad de las aguas en ecosistemas naturales. Principalmente para aguas residuales de diferentes orígenes, entre ellos se mencionan a continuación (Hoffmann, Platzer, Winker, & Muench, 2011): - Doméstico o municipal: Municipios urbanos y rurales, centros de salud, campamentos, instalaciones hoteleras, clubes deportivos, escuelas. - Industrial: Refinerías, fábricas de productos químicos, de papel, curtiduría, textiles, destilerías, mataderos. - Alimentario: Producción de leche, quesos, azúcares, conserveras. - Pscifactorías: Cría de peces. - Lixiviados de diferentes orígenes: Agrícolas, aeropuertos, autopistas, invernaderos, viveros, vertedores de basura. F. Lago de Atitlán El Lago de Atitlán se ubica en el departamento de Sololá, Guatemala. La cuenca del Lago tiene una superficie de 541 k𝑚2, un perímetro de 118.5 Km y cuenta con cuatro sub-cuencas las cuales están formadas por los ríos Quiscab, Panajachel y la sub-cuenca Azul (Castillo & Edith, 2016). 1. Características La cuenca tiene un origen volcánico esto provoca que se tenga un 79% del suelo no apto para cultivos (Recinos & Ruiz, 2012). El Lago es altamente vulnerable y susceptible a los cambios en sus diferentes áreas de captación de agua por ser una cuenca endorreica, lo cual significa que es cerrada. Los departamentos (Totonicapán y El Quiché) que se encuentran alrededor de Sololá, son importantes debido a que estos tienen 15 un impacto directo para la degradación de los recursos naturales, por lo mismo es indispensable que tengan un manejo adecuado de sólidos y líquidos que se producen (AMSCLAE, 2017). Por lo anterior, la cuenca fue declarada “Área protegida de Reserva de Uso Múltiple” por medio del decreto no. 64-97 del Congreso de la República y correspondió a que la cuenca está siendo degradada por lo tanto la recuperación y conservación de la calidad ambiental y ecológico, es importante (AMSCLAE, 2017). 2. Actualidad El Lago sufre diferentes problemas de contaminación entre los cuales se encuentran químicos, biológicos y físicos. Entre los químicos están los fertilizantes agrícolas, plaguicidas, jabones, detergentes, aceites, lubricantes y combustibles. En los biológicos se encuentran los desechos humanos y de animales domésticos, hospitalarios, plantas de tratamientos, entre otros y los físicos se encuentran desechos sólidos (Recinos & Ruiz, 2012). 3. Ecología Con el tiempo se han ido realizando diferentes estudios en los cuales se ha demostrado que en el Lago se ha ido degradando todo el ecosistema. En el año 2008, ocurrió la primera floración de cianobacterias principalmente por Dolichospermum, Microcystis y Limnoraphis; en el año 2009 ocurrió la segunda (AMSCLAE, 2017). Se ha tenido preocupación de estos microorganismos por el aumento de los florecimientos, por lo que esto ocasiona una reducción en el turismo, por lo tanto, la reducción de medios de subsistencia para las comunidades y los daños en la salud por las toxinas. Por lo mismo, se ha creado el proyecto financiado por la USAID llamado Unidos por el Lago de Atitlán, con el fin de documentar las condiciones actuales del Lago de Atitlán y así encontrar posibles soluciones (Sudeep Chandra, Margaret Dix, Eliška Rejmánková, Virginia Mosquera, 2013). 4. Toxinas producidas por cianobacterias En la mayoría de los ambientes acuáticos se puede encontrar toxinas producidas por cepas de cianobacterias de varias especies. Según Whitman et al. (1998), la mayoría de las procariotas se encuentran en aguas saladas y dulces, especialmente las cianobacterias autótrofas. Estas han sido uno de los principales filos procarióticos que han colonizado varios hábitats tales como aguas frescas, salobres, marinas, termales, hipersalinos, suelos y desiertos. La única limitante para el crecimiento de estas es el pH ya que tiene a preferir condiciones neutras o básicas. La presencia de toxinas tiene un impacto ambiental, salud humana y animal, turismo, recreación y acuicultura. Entre las toxinas que se presentan comúnmente son: hepatoxinas (microcistina y nodularina), cilindrospermopsina, nodularin, neurotoxinas, antoxinas y saxitoxina. Estas pueden ser producidas por procariotas en particular las cianobacterias estas representan uno de los principales 16 filamentos bacterianos que exhiben las características generales de bacterias Gram-negativo entre estas se encuentran Microcystis, Planktothrix, Oscillatoria, Anabaena, Anabaenopsis, Nostoc, Hapalosiphon, Snowella y Woronichinia (Valério, Chaves, & Tenreiro, 2010) G. Código de barras de ADN El código de barras (DNA barcording, en inglés) es una herramienta que se ha utilizado para la identificación de especies basada en secuencia de ADN, esta técnica compara toda la estructura del genoma y expresión. Estos códigos de barras de ADN consisten en un estándar de secuencias cortas de ADN (400- 800pb) que al inicio se deben de generar y caracterizar fácilmente para todas las especies del mundo. Los criterios que se debe de cumplir para la elaboración de un código de barras de ADN son: contener una genética significativa a nivel de especie y divergencia, poseer sitios flanqueantes conservados para el desarrollo de cebadores universales de PCR para su amplia aplicación taxonómica y tener una longitud corta de secuencia para facilitar las capacidades actuales de extracción de ADN y amplificación (Kress & Erickson, 2008). Al usar el código de barras de ADN, se refiere al uso de secuencias de ADN cortas y estandarizadas como marcadores para el reconocimiento de especies. Para realizar un trabajo de bioinformática de código de barras de ADN se debe de seguir un flujo de trabajo (ver Figura 8) para producir productos con representación limpia y confiable para obtener información sobre la taxonomía de la muestra desconocida por medio de algoritmos que permiten la comparación de secuencias de ADN junto con bibliotecas de secuencias de ADN. Es importante realizar una biblioteca completa antes de la exploración de códigos de barras de ADN para el reconocimiento de especies (Wilson, Sing, & Jaturas, 2019). Los programas *Codoncode Aligner, PrinseQ y Bioedit son programas utilizados para el análisis de secuencias de los genomas. 17 Figura 7. Flujo de trabajo para código de barras para ADN (Wilson et al., 2019) H. Extracción de ADN El objetivo de extracción de ADN es separarlo de proteínas, membranas y otro material celular contenido de la célula que se extrae. Este proceso se requiere un manejo cuidadoso del material biológico para evitar contaminación y el entrecruzamiento con otro ADN. Los diferentes procedimientos tienen tres pasos básicos: lisar las células, separar el ADN de los componentes celulares, aislar el ADN y precipitar con un alcohol (Elkins, 2013). El método de extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico se basa en la solubilidad del ADN, proteínas y lípidos en solventes orgánicos. Es útil para la extracción de ADN de pequeños volúmenes (<0.4mL) a concentraciones ≤1 mg/mL (Richlen & Barber, 2005). Los reactivos cumplen ciertas funciones: fenol desnaturaliza las proteínas y estas se encuentran en la interfaz entre lo acuoso y lo orgánico, el cloroformo estabiliza las fases y el alcohol isoamílico evita la formación de espuma en la mezcla y ayuda en la separación de las fases orgánicas y acuosas. Por lo tanto la combinación de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico es utilizado para la eliminación de contaminantes proteicos y en la estabilización. Por otro lado, la enzima proteinasa K ayuda en la digestión de proteínas, incluyendo las nucleasas. Isopropanol contribuye a la precipitación de ADN. El ADN se sedimenta después de la etapa de precipitación, se lava con etanol al 70% para eliminar sales y pequeñas moléculas orgánicas y se debe de resuspender en tampón a una concentración adecuada (Moore, 1998). Posterior a la extracción de ADN es necesario realizar una cuantificación del material genético, esto se puede realizar por medio de un espectrofotómetro el cual usa la absorbancia/transmisión de luz a través de 1. Recolección de muestra 2. Métodos moleculares - Extracción ADN - Amplificación ADN (PCR) 3. Secuenciación - Secuenciación por Sanger - Secuenciación de alto rendimiento 4. Edición de secuencia -Codoncode Aligner* 5. Proceso de lectura - Codoncode Aligner - PrinseQ* 6. Alineamiento de secuencias - Bioedit* 7. Barcode of Life Datasystmes - Descargar FASTA - Agregar a GENBANK 8. Asignar nombres taxonómicos a códigos de barras - Identificación - GENBANK BLAST 9. Agregar los códigos de barras de ADN en unidades taxonómicas operativas 18 un líquido para determinar la concentración de la muestra que se está analizando. Las moléculas absorben diferentes longitudes de onda de luz en diversos grados y la mayoría tiene una longitud de onda específica que absorben al máximo. Al medir la absorbancia de la muestra se puede estimar la concentración de una muestra. Para medir con precisión la concentración de una sustancia en función de su absorbancia, se debe conocer la longitud de onda de la luz que la muestra absorbe al máximo. En el caso de ADN y ARN, la absorbancia máxima es de 260nm. La proteína absorbe al máximo a 280nm y la proporción de ácido nucleico a proteína (260/280) se usa generalmente como un indicador de la pureza de las muestras de ADN (Pachchigar, Khunt, & Hetal, 2011). Otra técnica para la cuantificación de ADN es por fluorometría, la cual se basa en los estados vibracionales y electrónicos de las moléculas. Primero la muestra se excita mediante la absorción de un fotón de luz y luego la molécula desciende luego a los distintos niveles de vibración del estado basal, emitiendo un fotón en el proceso y así se crea la fluorescencia que es detectada por el quipo (Promega Corporation, 2017). I. Marcadores universales 16S y 18S El ARN ribosomal 16S (ARNr) es un componente de la subunidad pequeña 30S de los ribosomas de las células procariotas. Los genes del ARNr 16S han sido clasificados como objetivos para estudios filogenéticos y taxonomía bacteriana debido a que se encuentra una copia al menos en su genoma y en el genoma mitocondrial (Arena-Ortiz & Chiappa-Carrera, 2017). La región variante, V1-V9, de los genes 16 ARNr (ADNr) se han utilizado para la identificación de especies (Baker, Smith, & Cowan, 2003). Para los ADNr 16S, los cebadores (15–20 nucleótidos (nt)) están ubicados en las regiones conservadoras que flanquean una región objetivo utilizado para el análisis filogenético. Los primeros conjuntos de cebadores fueron diseñados mediante el uso de regiones conservadoras de secuencias de ADNr 16S de diferentes especies y fueron nombrados de acuerdo con sus posiciones en Escherichia coli 16S ADNr (Wang & Qian, 2009). El ARNr 18S es el centro activo de síntesis de proteínas en la subunidad ribosómica 40S. El aumento de la cantidad de ribosomas, conlleva a aumentos en la cantidad de ARN por lo tanto la transcripción y síntesis de proteínas son proporcional a los aumentos en 18S ARNr (Hayashi, 2014). El ARNr se encuentra presente en todas las células vivas con una función altamente conservada y hay algunas diferencias entre secuencias en eucariotas en comparación con procariotas. En procariotas, la región V6 ha sido considerada la región más variable por lo tanto ha sido adecuada para estudios de biodiversidad en procariotas, pero esta región está más conservada en eucariotas y por lo tanto se evita. Por otro lado, la región V4 es la región variable para eucariotas. En diversos estudios han aplicado esta región en evaluaciones de la composición de comunidades de microoganismos. Para estudios de diversidad eucariota han sugerido que las regiones variables, siendo V4 yV9 los mejores candidatos (Hadziavdic et al., 2014). Los números de la Figura 8 indican las posiciones de inicio y fin de las regiones variables. 19 Figura 8. Representación del gen ARNr 16S de las 9 regiones conservadas (V1-V9). Corresponden a la secuencia del genoma de Escherichia coli (Arena-Ortiz & Chiappa-Carrera, 2017) Los números de la Figura 9 indican las posiciones de inicio y fin de las regiones variables. Figura 9. Representación del gen ARNr 18S de las 9 regiones conservadas (V1-V9). Corresponden a la secuencia de S. cerevisiae (Reich & Labes, 2017) Cuadro 2. Marcadores universales 16S y 18S que se probaron en este estudio Cebadores Marcadores universales Secuencia Referencia EK82_F 18S GAAACTGCGAATGGCTC (Auinger, Pfandl, & Boenigk, 2008) Proto5_R GACGGGCGGTGTGTAC V4_F 18S CCAGCASCYGCGGTAATTCC (Bradley, Pinto, & Guest, 2016) V4_R ACTTTCGTTCTTGAT 27_F 16S AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (De Lillo et al., 2006) 1492_R GGTTACCTTGTTACGACTT 1. Reacción en cadena de la polimerasa La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es un ensayo enzimático, que permite la amplificación de un fragmento de ADN específico en un complejo de ADN. Mullis (1990) declaró que el ensayo de PCR “permite eligir el fragmento de ADN de interés y tener tanto como uno quiera”. Para realizar PCR se puede utilizar variedad de tejidos y organismos. Lo que se requiere son cantidades pequeñas de ADN para que la PCR realice suficientes copiar para analizar con métodos convencionales de laboratorio (Bruns, Ashwood, & Burtis, 2007). 20 Para cada ensayo de PCR se requiere la presencia de molde de ADN, cebadores, nucleótidos y ADN polimerasa. La ADN polimerasa es una enzima clave que une los nucleótidos individuales, las cuales son las cuatro bases: adenina, timina, citosina y guanina (A, T, C, G), que se encuentran en el ADN. Estos actúan como bloques de construcción que utiliza la ADN polimerasa para crear el producto de PCR resultante (Terpe, 2013). Los cebadores en la reacción especifican el producto de ADN exacto a amplificar. Los cebadores son fragmentos de ADN cortos con una secuencia definida complementaria al ADN objetivo que al ser detectado y amplificado sirven como un punto de extensión para que la ADN polimerasa pueda construir. Los componentes mencionados anteriormente se mezclan en un tubo de ensayo o en una placa de 96 pocillos y luego se colocan en un termociclador el cual permite hacer ciclos repetitivos de amplificación de ADN en tres pasos básicos (Garibyan & Avashia, 2013). La solución de reacción se calienta primero por encima del punto de fusión de las dos cadenas de ADN complementarias del ADN objetivo, que permite que las cadenas se separen, un proceso llamado desnaturalización. Luego se baja la temperatura para permitir que los cebadores específicos se unan a los segmentos de ADN objetivo, un proceso conocido como hibridación o recocido. Recocido entre los cebadores y el ADN objetivo ocurre solo si son complementarios en secuencia, La temperatura se eleva nuevamente, en ese momento la ADN polimerasa es capaz de extender los cebadores agregando nucleótidos a la cadena de ADN en desarrollo (ver Figura 10). Con cada repetición de estos tres pasos, el número de moléculas de ADN copiadas se duplica (Sforza, Simionato, Giacometti, Bertucco, & Morosinotto, 2012). Los resultados de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa se visualizan en electroforesis en gel. Esta es una técnica que se utiliza una corriente eléctrica que impulsa los fragmentos de ADN a través de una matriz en gel y los fragmentos de ADN se separan según su tamaño. Se debe de incluir un estándar o un marcador de peso molecular para determinar el tamaño de los fragmentos de la muestra de PCR. Estos fragmentos de ADN de la misma longitud forman una banda en el gel que se puede identificar a simple vista al teñir el gel con un pigmento que se intercala en el ADN, este puede ser bromuro de etidio o GelRed (Lee, Costumbrado, Hsu, & Kim, 2012). 21 Figura 10. Diagrama del proceso de la reacción en cadena de la polimerasa (Loftus, 2015) 22 VI. ANTECEDENTES La investigación de microalgas ha ido incrementando en los últimos años ya que estas constituyen una fuente sostenible de biomasa para la producción de biofertilizantes, biombustibles, alimento, entre otros. Desde 1975, estos microorganismos han sido de mucha importancia en áreas de bioproductos y ecología química. Aproximadamente 500 especies de algas son utilizadas como complementos alimenticios humanos, y cerca de 160 especies son comercialmente valiosas. Desde 1,979 en India se ha utilizado microalgas para el uso de fertilizantes en donde realizan un inóculo mixto el cual es secado y mezclado con el suelo en cultivos de arroz (Braida et al., 2015). Se ha encontrado que las microalgas tienen capacidad fitorremediadora lo cual consiste en la eliminación o biotransformación de contaminantes de un medio. Los compuestos son captados por la biomasa algal y pueden ser recuperados por su cosecha, teniendo como objetivo la eliminación de contaminantes y producción de biomasa con fines comerciales. La biomasa de estos microorganismos a lo largo del tiempo ha proporcionado productos biotecnológicos con usos en la industria alimenticia, salud y medicina humana, alimentos para animales y biocombustibles. Por lo anterior, es importante el uso de microalgas para los problemas ambientales existentes en todo el mundo en la actualidad (Hernández-Pérez & Labbé, 2014). En Guatemala en el año 2,009 el Instituto de Recursos Energéticos de la Universidad Galileo evaluó el porcentaje de aceites y ácidos grasos de microalgas que se encuentran en el Lago de Amatitlán por medio de la formación de biomasa para producción de biodiesel y se encontró que las óptimas son los aceites de Chlorella sp. y Monoraphidium griffithii (Díaz, 2011). En el año 2015, se estudió si la microalga Chorella vulgaris encontrada también en el Lago de Amatitlán era óptima para la obtención de ácidos grasos con el interés alimentario y se encontraron presencia de ácidos grasos saturados, monoisaturados y poliinsaturados para consumo alimenticio (Brisset et al., 2018). En el año 2013 se realizó un estudio en el Lago de Atitlán el cual consistía determinar las variaciones espaciales y temporales de fitoplancton en función de las variables temperatura y concentración de nutrientes en los diferentes sitios de lago, y se concluyó que los primeros meses del año se encontraba mayor diversidad de microorganismos. Las especies dominantes para el periodo de tiempo del estudio fueron Aulacoseira granulata (Bacillariophyta), Coelastrum sp. (Chlorophyta) y Limnoraphis robusta (Ochaeta, 2014). Para completar estudios previos se elaboró la optimización de extracción de ADN y su amplificación de los marcadores 16S y 18S para su posterior análisis de código de barras de ADN (DNA barcording) para funciones taxonómicas y evaluar su potencial como materias primas sustitutas de bajo costo e impacto ambiental. 23 VII. METODOLOGÍA A. Sitio de estudio El estudio se realizó en dos cuerpos de agua de origen artificial y natural. El cuerpo de agua natural fue el Lago de Atitlán exactamente en Panajachel, ubicado en el Departamento de Sololá, Guatemala. El cuerpo de agua artificial fue un humedal ubicado en Sanarate, El Progreso. B. Sujetos de estudio Microrganismos eucariotas y procariotas en muestras de agua de ambos cuerpos de agua de origen natural y artificial. C. Diseño, enfoque y tipo de investigación La investigación fue de diseño no experimental transversal debido a que no se realizaron cambios intencionales en las variables independientes para evaluar su efecto en las variables dependientes. El diseño de este estudio fue experimental con enfoque cualitativo. D. Tipo y tamaño de muestra Se utilizaron muestras de agua de dos diferentes cuerpos de agua (artificial y natural). El tamaño de muestra total fue de 17 muestras, las cuales se dividieron en 11 muestras del cuerpo de agua natural y 6 muestras del cuerpo de agua artificial. Los muestreos se realizaron en los meses de julio (artificial) y septiembre (natural). Los 6 puntos del cuerpo de agua natural se tomaron de la siguiente manera: 2 puntos en entradas de aguas residuales, 2 puntos medios y 2 puntos en la salida de agua; con el fin de observar alguna diferencia de microorganismos en los diferentes puntos. El tipo de muestreo del estudio fue no probabilístico por conveniencia. 24 E. Criterios de inclusión y exclusión Los criterios de inclusión para el estudio son aquellos cuerpos de agua dulce y que el agua no sea en corriente como, por ejemplo: lagunas, lagos, estanques, etc. Los criterios de exclusión son todos aquellos cuerpos de agua salado y agua como lo son ríos y océanos. F. Variables (conceptualización y operacionalización) Cuadro 3. Variables dependientes e independientes Número de variable Variable Definición Naturaleza Interrelación Unidades de medición 1 Concentración de ADN Cantidad de ADN genómico en un determinado volumen Cuantitativa Dependiente 𝜇𝑔/𝑚𝐿 2 Presencia o ausencia de bandas en gel de agarosa 0.8% Productos de PCR utilizando cebadores específicos Cualitativa Dependiente pb 3 Volumen de muestra Cantidad de microorganismos Cuantitativa Independiente mL 4 Patrón enzima de restricción Produtos de PCR utilizando enzima de restricción RsaI Cualitativa Dependiente pb 25 G. Metodología Figura 11. Flujo de trabajo (Los números corresponden a los objetivos específicos) H. Toma de muestra Lago Atitlán y Humedal artificial El proceso de toma de muestra se llevó a cabo en dos diferentes cuerpos de agua para los cuales se tomaron en botes autoclaveables 300mL de muestra en los puntos asignados según la técnica descrita en el Procedimiento de Operación Estándar No. 1 (POE No. 1-9.3) que se encuentra en la sección de Anexos. En el humedal artificial ubicado en Sanarate se tomaron 6 puntos, se sujetó la botella con una mano y con la otra 26 se retiró la tapa, se lavó varias veces la botella antes de tomar la muestra final, se invirtió la botella completamente y se sumergió a una profundidad de 0.2m por debajo de la superficie y se giró hacia arriba y hacia la corriente, al estar llena se retiró y se volvió a colocar la tapa. Por otro lado, para el procedimiento de toma de muestra del Lago de Atitlán se siguió el Protocolo establecido por los Laboratorios de Análisis y Monitoreo, Centro de Estudios Atitlán de la Universidad del Valle de Guatemala Altiplano el cual consistió en utilizar botella Van Dorn para sumergirla a distintas profundidades en el centro del Lago, en cada toma de muestra se necesitó lavar 3 veces el bote antes de tomar la muestra definitiva. Para la toma de muestra de la superficie se llenó el bote sumergiéndolo lateralmente con la boca en dirección de la corriente. Las muestras se almacenaron en hielera y se transportaron a 4°C aproximadamente para su posterior análisis. Se siguió el procedimiento del POE No. 1-9.2 que se encuentra en la sección de Anexos. Para la preservación de muestras se colocaron en tubos falcon® 50mL de muestra, se filtraron con Whatman 1 (poro 11um) y entre cada muestra se lavó el embudo con etanol 70%, cloro y agua estéril. Se centrifugó a 15,000rpm por 15 minutos, a unas de las muestras se agregó RNAlater según el peso y se almacenó a 4°C por 24 horas para la extracción de ADN. Las demás muestras se congelaron a -20°C hasta su posterior uso. I. Extracción de ADN El proceso de extracción de ADN genómico se llevó a cabo con las muestras de los diferentes cuerpos de agua. Para el cuerpo de agua artificial se extrajo ADN en muestras frescas y congeladas, en cambio, para el cuerpo de agua natural se extrajo ADN en muestras frescas. El procedimiento de extracción fue optimizado en las diferentes fases de los métodos convencionales de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico siguiendo los pasos del POE No.2 que se encuentra en la sección de Anexos. Se utilizó buffer de lisis CTAB con 0.2% 𝛽- mercaptoetanol (Sigma Aldrich) y proteinasa K, se centrifugó a 5,500rpm por 15 minutos se retiró sobrenadante y se agregó 1mL de buffer de lisis previamente preparado y se dejó digerir por 1 hora a 60°C. Se maceró con pistilo estéril y se añadió fenol:clorofomo:alcohol isoamílico (25:24:1) (Merck) y se mezcló. Se realizó otra centrifugación a alta velocidad a 4°C por 10 minutos y se pasó sobrenadante a un tubo de 2mL, se añadió isopropanol frío y se dejó incubar por 1 hora a -20°C, se realizó una centrifugación a 4,000xg por 15 minutos y se realizaron lavados con etanol 70% al pellet y se realizó una última centrifugación a máxima velocidad a 4°C por 5 minutos y el pellet fue resuspendido en 50uL de TE (Promega). Se dejó una noche a 4°C y se midieron las concentraciones con NanoDropTM One (Thermo Fisher Scientific) (espectrofotometría) y QuantiFluor® One dsDNA System (fluorometría). 27 J. Análisis de cebadores El análisis de cebadores se realizó por medio de estudios previos para su elección y se analizaron por medio de la página NCBI (Primer-BLAST y SILVA). En donde se colocaron las secuencias de los cebadores y se seleccionó el organismo que se quiere analizar. Los parámetros que se tomaron en cuenta es la similitud, mayor número de entrada, temperatura, contenido GC y los organismos que este puede analizar. Cuadro 4. Secuencia de cebadores utilizados en este estudio Cebadores Secuencia EK82_F GAAACTGCGAATGGCTC Proto5_R GACGGGCGGTGTGTAC V4_F CCAGCASCYGCGGTAATTCC V4_R ACTTTCGTTCTTGAT 27_F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492_R GGTTACCTTGTTACGACTT K. PCR 16S ADNr y 18S ADNr Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el kit PlantinumTM II Hot-Start PCR Master Mix (2X) (Invitrogen) y se utilizó un marcador de peso molecular para determinar el tamaño de los fragmentos de 100pb (TrackIt). Se siguió el procedimiento de POE No.3 que se encuentra en la sección de Anexos. Los cebadores utilizados para 18S son V4_F y V4_R, EK82_F y Proto5_R para la PCR 16S se utilizaron cebadores universales (27_F y 1492_R) (ver Cuadro 4). Los productos se observaron en un gel de agarosa 0.8% de 6cm de largo el cual se corrió a 100v por 25min. La reacción de amplificación de cada cebador se realizó en termociclador siguiendo los siguientes programas: Cuadro 5. Condiciones termociclador PCR 16S (27_F y 1492_R) y 18S (Ek82_F y Proto5_R) Ciclos Temperatura Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial 94C 3 min 1 Desnaturalización Alineamiento Extensión 94C 52C 72C 1min 1min 2min 10 Extensión final 72C 5min 1 Hold 4C ∞ - 28 Cuadro 6. Condiciones termociclador PCR 18S cebadores V4_F y V4_R Ciclos Temperatura Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial 95C 5 min 1 Desnaturalización Alineamiento* Extensión 95C 70C 72C 30s 45s 10min 25 Desnaturalización Alineamiento Extensión 94C 50C 72C 30s 45s 1min 20 Extensión final 72C 5min 1 Hold 4C ∞ - *Alineamiento: Se bajo un 1C en cada ciclo para cumplir los 25 ciclos. L. Diseño de cebadores universales 18S Se utilizaron secuencias de los programas de NCBI y SILVA para el alineamiento de 18S de microalgas eucariotas identificadas en la caracterización microscópica (sección G) en el programa CLC Sequence Viewer 7.7.1. Luego, el conceso de las secuencias se colocaron en Primer-BLAST para obtener los posibles cebadores y fueron analizados en Oligo-Analyzer. M. Enzima de restricción RsaI para productos PCR 16S y 18S Los productos de PCR 16S y 18S se les colocó 0.5uL de enzima de restricción RsaI y se incubaron por 2 horas a 37℃ y 10 minutos a 4℃. Los productos se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa 2%. N. Caracterización microscópica Las muestras de agua se fijaron con Lugol 2% para su caracterización microscópica y se siguió el procedimiento de POE No. 1-9.4. Para esto se prepararon tubos cónicos con 49mL de muestra y 1mL de Lugol para la conservación de plancton para su posterior análisis morfológico, se utilizaron diferentes guías para la identificación entre ellas se utilizaron: Guía práctica de identificación de Fitoplancton (AMSCLAE), Identification guide (Manaali Whenua Landcare Research) y el libro Freshwater Algae segunda edición (Bellinger, E & Sigee, D). Se observarán hasta aumento 100X. 29 O. Conteo de células por cámara Neubauer Las muestras fijadas con Lugol 2% se dejaron reposar durante 4 semanas aproximadamente, se les quitó el sobrenadante y se dejaron con 5mL. Se lavó la cámara Neubauer y el cubreobjeto con agua destilada y alcohol, se secaron con kimwipe, estos lavados se realizaron en cada muestra. Se puso el cubreobjeto encima de la cámara y se removió el cultivo para homogenizarlo y se tomaron 20uL de la muestra y se puso la punta de la pipeta en una de las ranuras de la cámara y, por capilaridad, las células se distribuyen en la cámara. Si se creaba en la cámara una burbuja de aire se debía repetir el procedimiento. Se colocó la cámara en el microscopio para realizar la observación, se contó en los cuadros grandes (ver Figura 10). Se observaron hasta aumento 10X. Figura 12. Cuadros de cámara Neubauer (El conteo de células se realizó en los cuadros resaltados en verde) (# 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜) ∗ (𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛) 𝑉ó𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 Ecuación 1. Fórmula para conteo de células 30 VIII. RESULTADOS A. Toma de muestra-Puntos de muestreo En la Figura 13, se observan los seis diferentes puntos de muestreo que se realizó en el humedal artificial en el mes de julio de 2019. Figura 13. Diagrama del humedal artificial con la localización de los puntos de muestreo. H = humedal. 31 En la Figura 14, se observa las coordenadas del punto del Centro Weiss del Lago de Atitlán en donde se tomaron a 10 diferentes profundidades (0-300m) en el mes de septiembre de 2019. Figura 14. Localización del centro Weiss muestreado en el Lago de Atitlán B. Optimización del método de extracción de ADN por medio de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico de muestras frescas y congeladas de diferentes cuerpos de agua En los Cuadros 7 y 8, se presentan los valores de cuantificación del ADN con sus respetivas purezas en las diferentes muestras frescas de los dos diferentes cuerpos de agua, obtenidas mediante de la optimización del método de extracción de ADN por medio de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). Las purezas adecuadas son A260/280 es aproximadamente 1.8 y el rango de A260/230 es de 2.0-2.1. Se encontró que el valor máximo fue para la muestra 1H del humedal artificial 126.17±59.87ng/mL y el valor mínimo para la muestra a una profundidad de 100m del Lago de Atitlán 1.77±1.07ng/mL mediante la cuantificación por espectrofotometría. Para la cuantificación con fluorometría se encontró que el valor máximo fue para la muestra 1H del humedal artificial 4.6±1.94ng/mL y el valor mínimo para la muestra del Lago de Atitlán a 40m 0.0060±0.0052ng/mL. Además, se presentan los valores correspondientes a la medición de las demás muestras por espectrofotometría y por fluorometría de cada una de las muestras. La extracción de las muestras congeladas del humedal artificial se realizó en duplicado con excepción para los puntos 3 y 4 debido a que no se tenía suficiente muestra. 14°42’23.182” N; 91°11’13.901” O 32 Cuadro 7. Comparación de dos métodos de cuantificación de ADN por medio de espectrofotometría y fluorometría de muestras frescas del humedal artificial. Identificación de muestras Concentración fluorometría (ng/uL) Concentración espectrofotometría (ng/uL) A260/280 Pureza A260/230 1H* 4.6±1.94 126.17±59.87 1.52±0.09 1.53±0.86 2H* 4.3±3.76 56.07±4.50 1.66±0.03 2.50±0.57 3H* 0.5±0.45 27.67±2.63 1.40±0.05 3.65±1.57 Ac1H 0.7±1.01 7.73±2.30 1.93±0.24 0.68±4.44 Ac2H 3.9±2.98 11.23±3.53 2.11±0.46 0.42±2.06 Ac3H 1.3±0.83 11.57±3.78 2.24±0.20 4.32±3.08 *1H, 2H, 3H corresponden a los puntos de muestreo en el humedal artificial (ver Figura 12). Se obtuvo Ac1H, Ac2H, Ac3H debido a que en las muestras originales se obtuvo una concentración alta de ADN. Por lo que éstas se diluyeron con buffer TE y se centrifugaron, la parte acuosa se separó y se colocaron en tubos nuevos. En donde, Ac: Acuosa, ±: desviación estándar, A: Absorbancia, 260/280: Contaminación por proteínas o fenol residual, 260/230: Residuos de fenol o carbohidrato. Concentración por fluorometría se realizó por QuantiFluor® One dsDNA System y espectrofotometría por NanoDropTM One (Thermo Fisher Scientific). Además, se presentan los valores de pureza medidos por NanoDropTM. Cuadro 8. Comparación de dos métodos de cuantificación de ADN por medio de espectrofotometría y fluorometría de muestras frescas del centro de Lago Atitlán a distintas profundidades. Identificación de muestras Concentración fluorometría (ng/uL) Concentración espectrofotometría (ng/uL) A260/280 Pureza A260/230 L.1 0.0075±0.0061 2.30±0.75 1.86±0.46 0.78±0.13 L.2 0.0213±0.0100 24.37±0.47 1.31±0.02 1.12±0.03 L.3 0.0122±0.0065 7.63±0.21 1.38±0.04 0.93±0.02 L.4 0.0253±0.0209 55.80±11.26 1.44±0.15 0.74±0.42 L.5 0.0060±0.0052 7.90±0.30 1.36±0.04 3.15±0.59 L.6 0.0635±0.0771 3.07±1.85 1.92±0.28 0.35±0.08 L.7 0.0665±0.0327 72.40±0.26 1.30±0.01 1.29±0.02 L.8 0.0441±0.0106 33.77±0.31 1.38±0.01 1.00±0.01 L.9 0.0193±0.0130 1.77±1.07 1.74±0.50 5.23±3.52 L.10 0.0391±0.0328 53.87±0.12 1.35±0.01 1.12±0.01 L.11 0.0167±0.0136 37.23±0.32 1.30±0.01 1.51±0.02 A1* 0.0279±0.0112 3.07±1.18 1.89±0.83 0.46±0.11 33 *En donde A1 corresponde al blanco del método de extracción, ±: desviación estándar, A: Absorbancia, 260/280: Contaminación por proteínas o fenol residual, 260/230: Residuos de fenol o carbohidrato. Concentración por fluorometría se realizó por QuantiFluor® One dsDNA System y espectrofotometría por NanoDropTM One (Thermo Fisher Scientific), L.1: 0m, L.2: 10m, L.3: 20m, L.4: 30m, L.5: 40m, L.6: 50m, L.7: 60m, L.8: 80m, L.9: 100m, L.10: 200m y L.11: 300m. Además, se presentan los valores de pureza medidos por NanoDropTM. En el Cuadro 9, se presentan los valores de cuantificación del ADN con sus respetivas purezas en las diferentes muestras congeladas del humedal artificial, obtenidas mediante de la optimización del método de extracción de ADN por medio de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). Se encontró que el valor máximo fue para la muestra 1A 334.50±0.92ng/mL y el valor mínimo para la muestra 6A 25.17±0.32ng/mL para la cuantificación con Nanodrop. Para la cuantificación por flurometría se encontró que el valor máximo fue para la muestra 4A 4.31±2.11ng/mL y el valor mínimo para la muestra 1A y 5B 0.30±0.22ng/mL. Además, se presentan los valores correspondientes a la medición de las demás muestras por espectrofotometría y por fluorometría de cada una de las muestras. Cuadro 9. Comparación de dos métodos de cuantificación de ADN por medio de espectrofotometría y fluorometría de muestras congeladas de humedal artificial. Identificación de muestras Concentración fluorometría (ng/uL) Concentración espectrofotometría (ng/uL) A260/280 Pureza A260/230 1AH* 0.68±0.11 334.50±0.92 1.51±0 2.05±0 1BH* 0.30±0.22 215.83±0.75 1.45±0.01 1.87±0.01 2AH* 0.68±0.05 424.10±4.07 1.6±0.01 1.90±0.11 2BH* 0.36±0.06 290.03±121.56 1.51±0.09 1.82±0.02 3AH* 1.42±0.52 170.73±0.32 1.49±0 1.73±0.04 4AH* 4.31±2.11 83.60±0.10 1.85±0.03 2.30±0.03 5AH* 0.64±0.09 173.50±0.52 1.41±0.01 2.04±0.02 5BH* 0.30±0.04 36.43±0.46 1.34±0.01 2.0±0.04 6AH* 0.68±0.08 25.17±0.32 1.47±0.02 2.91±0.08 6BH* 0.41±0.29 51.77±0.67 1.41±0.01 2.38±0.13 Blanco 0.09±0.08 6.47±0.06 1.33±0.04 5.85±12.41 *En donde Blanco corresponde al blanco del método de extracción. Las extracciones se realizaron en duplicado. A representa la primera extracción y B la segunda extracción. ±: desviación estándar, A: Absorbancia, 260/280: Contaminación por proteínas o fenol residual, 260/230: Residuos de fenol o carbohidrato. Concentración por fluorometría se realizó por QuantiFluor® One dsDNA System y 34 espectrofotometría por NanoDropTM One (Thermo Fisher Scientific). Además, se presentan los valores de pureza medidos por NanoDropTM. En la Figura 15, se presenta la variación de los valores de concentración según la cuantificación por medio de espectrofotometría en muestras frescas y congeladas por medio de un diagrama de caja y bigote. Se observa en las muestras frescas menor variación en la cuantificación de ADN en cambio en las muestras congeladas se puede observar mayor variación en los datos y se puede observar datos a típicos. Sin embargo, se observó que las muestras congeladas tienen una mayor concentración con una media de 164.74±139.59 ng/mL que las frescas que tiene una media de 40.07±45.85ng/mL. Figura 15. Diagrama de dispersión de cuantificación por medio de espectrofotometría en muestras frescas y congeladas del humedal artificial. 1: Muestras frescas 2: Muestras congeladas En la Figura 16, se presenta la variación de los valores de concentración según la cuantificación por medio de fluorometría en muestras frescas y congeladas por medio de un diagrama de caja y bigote. Se observa en las muestras frescas menor variación en la cuantificación de ADN en cambio en las muestras congeladas se puede observar mayor variación en los datos y se puede observar datos a típicos. Sin embargo, se observó que las muestras congeladas tienen una mayor concentración con una media de 0.99±1.18ng/mL que las frescas tiene una muestra media de 2.56±1.93ng/mL. Además, se puede observar que los datos se encuentran debajo de la mediana y en las muestras congeladas se encuentran tres datos atípicos. 35 Figura 16. Diagrama de dispersión de cuantificación por medio de fluorometría en muestras frescas y congeladas del humedal artificial. 1: Muestras frescas 2: Muestras congeladas Se decidió realizar la prueba estadística no paramétrica Krukal-Wallis para determinar si existía una diferencia significativa entre las muestras frescas y congeladas. Se escogió esta prueba debido a que los datos no presentaban normalidad ni varianza constante. En los Cuadros 10 y 11 se presentan los resultados obtenidos en la prueba estadística. Cuadro 10. Prueba estadítica Kruskal-Wallis para muestras frescas y congeladas. Kruskal-Wallis Valor p Muestras frescas y congeladas 6.467e-06 Hipótesis: • Ho: Todas las muestras provienen de la misma población (distribución). • Ha: Al menos una muestra proviene de una población con una distribución distinta. Debido a que el valor p es menos a alfa (0.05) se rechaza Ho, por lo que se puede concluir que al menos una muestra proviene de una población con una distribución distinta. Cuadro 11. Prueba Post-Hoc Métodos Valor p 1 y 4* 0.0040 2 y 3* 0.0043 3 y 4* 0.0004 36 *1= Muestras frescas cuantificadas por espectrofotometría, 2= Muestras frescas cuantificadas por fluorometría, 3= Muestras congeladas cuantificadas por espectrofotometría, 4= Muestras congeladas cuantificadas por fluorometría. Hipótesis: • Ho: No existe diferencia significativa entre las muestras congeladas y muestras frescas. • Ha: Existe diferencia significativa entre las muestras congeladas y muestras frescas. Entre las muestras frescas y congeladas se observa que son significativamente diferentes debido a que el valor p es menor a alfa (0.05). C. Estandarizar la técnica molecular de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) para el marcador universal de procariotas 16S ADNr. (procariotas) y 18S ADNr (eucariotas) Se estableció una metodología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que brindara un rendimiento satisfactorio. Se utilizó el kit PlatinumTM II Hot-Start PCR Master Mix (2x) (Invitrogen) con el ADN extraído de las muestras anteriores. Esta metodología permitió la amplificación de los marcadores universales 16S (procariotas) y 18S ADNr (eucariotas). Se utilizaron los cebadores para 18S ADNr EK82_F y Proto5_R y V4_R y V4_F, para la PCR 16S se utilizaron cebadores universales (27_F y 1492_R) con una concentración de 0.4uM y se utilizó una escalera de peso molecular de 100pb (100-2,000pb) (Invitrogen). Se obtuvo amplificación de los dos marcadores universales en las muestras analizadas, sugiriendo presencia de microalgas en ambos orígenes. En las Figuras 17 y 20, se observa presencia de bandas de 1,700pb que corresponden microalgas eucariotas y en las Figuras 18 y 19, se observa presencia de bandas de 1,400pb que corresponden a procariotas. En la Figura 21, se observa presencia de una banda de 450pb y una banda inespecífica. 37 Figura 17. Productos de amplificación de PCR 18S (Ek82_F y Proto5_R) de muestras frescas y congeladas del humedal artificial en gel de agarosa 0.8%. Gel 1: Muestras frescas. En donde 1H, 2H, 3H corresponden a los puntos de muestreo en el humedal artificial (ver Figura 12) en el humedal artificial. Ac1H, Ac2H, Ac3H son las muestras de la fase acuosa. E: Escalera, C+: Hongo, C-: Bacillus, C-: Colonia 1, A: Agua. Gel 2: Muestras congeladas. En donde 1H, 2H, 3H, 4H, 5H, 6H corresponden a los puntos de muestreo en el humedal artificial (ver Figura 12). A y B corresponden a la primera y segunda extracción y a cada punto de muestreo en el humedal artificial (1-6), E: Escalera, C-: Bacillus, C+: Hongo, A: Control extracción, Ag: Agua, TE: Buffer resuspención ADN, MM: Master mix. 1 2 E 1H 2H 3H Ac1H Ac2H Ac3H C- C+ C+ A E 2,000 pb 1,500 pb 1,200 pb 1,700 pb E 1AH 1BH 2AH 2BH 3AH 4AH 5AH 5BH 6AH 6BH A C- C+ Ag MM TE 1,500 pb 2,000 pb 1,200 pb 1,700 pb 38 Figura 18. Productos de amplificación de PCR 16S (27_F y 1492_R) de muestras frescas y congeladas humedal artificial en gel de agarosa 0.8%. Gel 1: Muestras frescas. En donde 1H, 2H, 3H corresponden a los puntos de muestreo en el humedal artificial (ver Figura 12) en el humedal artificial. Ac1H, Ac2H, Ac3H son las muestras de la fase acuosa. E: Escalera, C+: Hongo, C-: Bacillus, C-: Colonia 1, A: Agua Gel 2: Muestras congeladas. A y B corresponden a la primera y segunda extracción y a cada punto de muestreo en el humedal artificial (1-6), E: Escalera, C-: Bacillus, C+: Hongo, A: Control extracción, Ag: Agua, TE: Buffer resuspención ADN, MM: Master mix. 2 1 E 1H 2H 3H Ac1H Ac2H Ac3H C+ C- A TE MM E 2,000 pb 1,500 pb 1,200 pb 1,400 pb E 1AH 1BH 2AH 2BH 3AH 4AH 5AH 5BH 6AH 6BH C+ C- A Ag TE MM 2,000 pb 1,200 pb 1,500 pb 1,400 pb 39 Figura 19. Productos de amplificación de PCR 16S (27_F y 1492_R) de muestras frescas del centro del Lago de Atitlán y muestras perservadas con RNAlater del humedal artificial en gel de agarosa 0.8%. E: Escalera, L.1: 0m, L.2: 10m, L.3: 20m, L.4: 30m, L.5: 40m, L.6: 50m, L.7: 60m, L.8: 80m, L.9: 100m, L.10: 200m y L.11: 300m, 12: P1 (Humedal), 13: P2 (Humedal), 14: Control –(extracción), 15: Control + (Hongo), 16: Agua DEPC. Figura 20. Productos de amplificación de PCR 18S (Ek82_F y Proto5_R) de muestras frescas del centro Lago Atitlán a distintas profundidades y muestras preservadas con RNAlater del humedal artificial en gel de agarosa 0.8%. E: Escalera, L.1: 0m, L.2: 10m, L.3: 20m, L.4: 30m, L.5: 40m, L.6: 50m, L.7: 60m, L.8: 80m, L.9: 100m, L.10: 200m y L.11: 300m, 12: P1 (Humedal), 13: P2 (Humedal), 14: Control –(extracción), 15: Control + (Hongo), 16: Agua DEPC. E L.1 L. 2 L.3 L.4 L.5 L.6 L.7 L.8 L.9 L.10 L.11 12 13 14 15 16 E L.1 L.2 L.3 L.4 L.5 L.6 L.7 L.8 L.9 L.10 L.11 12 13 14 15 16 1,500 pb 2,000 pb 1,200 pb 1,400 pb 2,000 pb 1,200 pb 1,500 pb 1,700 pb 40 Figura 21. Productos de amplificación de PCR 18S (V4_F y V4_R) de muestras frescas del humedal artificial en gel de agarosa 0.8%. Muestras frescas. En donde 1H, 2H, 3H corresponden a los puntos de muestreo en el humedal artificial (ver Figura 12) en el humedal artificial. Ac1H, Ac2H, Ac3H son las muestras de la fase acuosa. E: Escalera, C+: Hongo, C-: Bacillus, A: Agua y MM: Master Mix. D. Determinar diferencia de patrones de restricción en productos de PCR de 16S y 18S en los diferentes puntos de muestreo. A los productos de PCR 16S y 18S se les realizó una digestión enzimática con RsaI para determinar diferencia de patrones en los diferentes puntos de muestreo. En las muestras del Lago de Atitlán, se observa el mismo patrón para las distintas profundidades. En cambio, las muestras del humedal artificial se presentan diferentes bandas por lo que no se tiene un patrón fijo. En la Figura 22, se observa los patrones de enzima de restricción RsaI de las muestras frescas de los productos de PCR 18S del Lago de Atitlán y del humedal artificial.