UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias y Humanidades Generación de plásmido recombinante con potencial para el silenciamiento del gen Mnn1 en individuos de Drosophila melanogaster como un posible modelo de la Neoplasia endocrina múltiple del tipo 1 (MEN1) Trabajo de graduación en modalidad de Tesis presentado por Melany Yvonne Maldonado Estrada para optar al grado académico de Licenciado en Bioquímica y Microbiología Guatemala, 2023 UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias y Humanidades Generación de plásmido recombinante con potencial para el silenciamiento del gen Mnn1 en individuos de Drosophila melanogaster como un posible modelo de la Neoplasia endocrina múltiple del tipo 1 (MEN1) Trabajo de graduación en modalidad de Tesis presentado por Melany Yvonne Maldonado Estrada para optar al grado académico de Licenciado en Bioquímica y Microbiología Guatemala, 2023 Vo.°Bo.° (f) ____________________________________ Dr. Luis Diego Archila Díaz Tribunal Examinador: (f) _______________________________________ Dr. Luis Diego Archila Diaz (f) _______________________________________ MSc. Anna Yunuen Soto Fernández (f) _______________________________________ MSc. Luisa Fernanda Mejía Rivera Fecha de aprobación: Guatemala, 10 de enero de 2023 Prefacio En primer lugar, me gustaría agradecer a Dios por acompañarme y guiarme a lo largo de mi carrera; por darme la fuerza y coraje en los momentos que más necesitaba; por haberme dado sabiduría y entendimiento para culminar mi carrera; y, sobre todo, por la bendición de llenarme de aprendizajes, experiencias y felicidad en mi vida. A mis padres, gracias a su apoyo pude concluir mi carrera, lo cual he anhelado tanto tiempo. Gracias por creer en mí y en todas las metas que me he trazado a lo largo de mi vida. A mis hermanos, por ser una fuente de inspiración para mí. Ellos me han brindado las herramientas para desarrollarme intelectual y moralmente. A mi prometido, por su incondicional apoyo y cariño; gracias por creer en mí, por escucharme y motivarme a seguir adelante; gracias por brindarme consejos siempre tan oportunos. A Dr. Diego Archila por darme la oportunidad de trabajar en este proyecto, por su asesoramiento y apoyo; por ayudarme a resolver problemas y, sobre todo, por contribuir a mi formación académica. A MSc. Luisa Mejía por su asesoramiento y apoyo durante la fase experimental del presente trabajo. Gracias por sus consejos, tiempo y supervisión. Al Departamento de Bioquímica y Microbiología y al Centro de Estudios en Biotecnología (CEB) por brindar los fondos y las instalaciones necesarias para realizar la investigación. También por contribuir constantemente al avance de la ciencia en el país. A nuestra casa de estudios, Universidad del Valle de Guatemala, por brindar educación de excelencia que contribuye a nuestra formación como profesionales que buscan soluciones y mejoras para nuestro país. Índice Lista de figuras .................................................................................................................................. VIII Lista de cuadros .................................................................................................................................... IX Resumen ................................................................................................................................................. X Abstract ................................................................................................................................................. XI 1. Introducción ........................................................................................................................................ 1 2. Objetivos ............................................................................................................................................. 2 2.1 Objetivo general ............................................................................................................................. 2 2.2 Objetivos específicos ..................................................................................................................... 2 3. Justificación ........................................................................................................................................ 3 4. Marco teórico ...................................................................................................................................... 4 4.1 Cáncer ............................................................................................................................................ 4 4.1.1 Biología celular ....................................................................................................................... 4 4.1.2 Epidemiología ......................................................................................................................... 6 4.2 Tumores neuroendocrinos (NET, por sus siglas en inglés) ............................................................ 7 4.2.1 Definición y heredabilidad ..................................................................................................... 7 4.2.2 Síndromes neuroendocrinos .................................................................................................... 8 4.3 Modelos animales para MEN1 ..................................................................................................... 14 4.3.1 Drosophila melanogaster como un modelo de estudio para la función de la menina .......... 15 4.3.2 Biología de Drosophila melanogaster .................................................................................. 16 4.4 Ingeniería genética ....................................................................................................................... 17 4.4.1 Clonación molecular ............................................................................................................. 17 4.4.2 Transformación bacteriana ................................................................................................... 20 4.4.3 RNAi ..................................................................................................................................... 23 5. Marco metodológico ......................................................................................................................... 27 5.1 Objetivo general ........................................................................................................................... 27 5.2 Objetivos específicos ................................................................................................................... 27 5.3 Enfoque, diseño y tipo de investigación ....................................................................................... 27 5.4 Población, muestra y unidad de análisis ....................................................................................... 27 5.5 Variables ...................................................................................................................................... 27 5.6 Instrumentos y técnicas ................................................................................................................ 28 5.7 Estrategia...................................................................................................................................... 28 5.8 Alcances y limitaciones ............................................................................................................... 28 5.9 Bioética ........................................................................................................................................ 29 5.10 Estadísticos ................................................................................................................................ 29 5.11 Materiales y métodos ................................................................................................................. 29 6. Resultados ......................................................................................................................................... 33 6.1 Comparación de la cantidad de ARN extraído de individuos machos y hembras de D. melanogaster en diferentes tiempos de la vida adulta. .................................................................................................... 33 6.2 Síntesis exitosa de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN extraído de individuos adultos de D. melanogaster. .................................................................................................................................. 34 6.3 Amplificación exitosa del gen Mnn1 con secuencias del promotor T7 incorporadas en individuos macho y hembra de D. melanogaster. ....................................................................................................... 35 6.4 Inserción exitosa del fragmento amplificado en el vector plasmídico pCR™2.1-TOPO®. ......... 38 7. Discusión ........................................................................................................................................... 40 8. Conclusiones ..................................................................................................................................... 48 9. Recomendaciones ............................................................................................................................. 49 10. Referencias bibliográficas .............................................................................................................. 50 11. Anexos ............................................................................................................................................. 68 11.1 Procedimiento Normado de Operación ...................................................................................... 68 11.1.1 Preparación de medio de cultivo para las cepas de Drosophila melanogaster ................... 68 11.1.2 Tratamiento de material plástico para la eliminación de ARNasa ...................................... 71 11.1.3 Extracción y cuantificación de ARN de individuos adultos de Drosophila melanogaster. 73 11.1.4 Síntesis de ADN complementario a partir de ARN extraído de Drosophila melanogaster. .............................................................................................................................................................. 79 11.1.5 Amplificación del gen Mnn1 de Drosophila melanogaster mediante reacción en cadena por polimerasa (PCR) y visualización de productos de PCR por electroforesis en gel de agarosa. ............ 85 11.1.6 Purificación de productos de reacción en cadena por polimerasa (PCR) por centrifugación. .............................................................................................................................................................. 92 11.1.7 Ligación del fragmento de gen Mnn1 con el vector plasmídico pCR2.1™-TOPO® ......... 96 11.2 Mediciones cuantitativas de laboratorio ..................................................................................... 99 VIII Lista de figuras Figura 1. Los ocho marcadores distintivos del cáncer junto con dos características claves recientemente identificadas. ................................................................................................................................................... 5 Figura 2. Mapa global de la incidencia de los tipos de cáncer a nivel mundial en 2020. ......................... 6 Figura 3. Tumores asociados en MEN1 ................................................................................................... 9 Figura 4. Terapias utilizadas para el tratamiento de MEN1 incluyendo: análogos de somatostatina, inhibidores de RTK, iniciadores de mTOR, antagonistas de 𝛽-catenina, y moduladores epigenéticos......... 13 Figura 5. Etapas del desarrollo de D. melanogaster ............................................................................... 16 Figura 6. Mapa genómico del vector pCR™2.1TOPO .......................................................................... 20 Figura 7. Tamizaje azul blanco en cepa E. coli XL1-Blue para la detección de clones de plásmido recombinante. ................................................................................................................................................ 22 Figura 8. Vías de siRNA y miRNA que inducen el silenciamiento de ARNm de interés mediante el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) ................................................................................ 24 Figura 9. Métodos de inducción del silenciamiento en Drosophila melanogaster mediante el dsRNA. 26 Figura 10. Comparación de la concentración de ARN extraído de individuos machos y hembras en las diferentes etapas adultas, día 3 (n = 4), día 5 (n = 4) y día 10 (n = 4) de D. melanogaster ........................... 33 Figura 11. Amplificación de productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen Act5C a partir de ADNc de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster.. .......................................... 35 Figura 12. Amplificación de fragmento del gen Mnn1 con secuencia de promotor T7 añadidas a partir de ADNc de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster. .......................................................... 36 Figura 13. Primera ronda de amplificación de fragmento del gen Mnn1 a partir de ADNc de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster. ............................................................................................ 37 Figura 14. Segunda ronda de amplificación de fragmento del gen Mnn1 con las secuencias del promotor T7 a partir del producto de PCR amplificado anteriormente. ........................................................................ 38 Figura 15. Electroforesis en gel de agarosa para visualizar la ligación del fragmento del gen Mnn1 en el plásmido. ....................................................................................................................................................... 39 IX Lista de cuadros Cuadro 1. Variables controladas por el investigador. ............................................................................. 28 Cuadro 2. Variables no controladas por el investigador. ........................................................................ 28 Cuadro 3. Secuencias de oligos para PCR. ............................................................................................. 30 Cuadro 4. Valores de pureza del ARN extraído de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster mediante el equipo NanoDrop™ ............................................................................................ 34 Cuadro 5. Valores de pureza de ADNc de las muestras de machos y hembras de D. melanogaster mediante el equipo NanoDrop™ ................................................................................................................... 34 Cuadro 6. Cuantificación de ARN extraído de individuos adultos machos de D. melanogaster mediante el equipo NanoDrop™ .................................................................................................................................. 99 Cuadro 7. Cuantificación de ARN extraído de individuos adultos hembras de D. melanogaster mediante el equipo NanoDrop™ ................................................................................................................................ 100 Cuadro 8. Cuantificación de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN extraído de individuos adultos machos de D. melanogaster mediante el equipo NanoDrop™ ....................................................... 100 Cuadro 9. Cuantificación de ADNc a partir de ARN extraído de individuos adultos hembras de D. melanogaster mediante el equipo NanoDrop™ .......................................................................................... 101 X Resumen La neoplasia endocrina múltiple tipo 1 (MEN1) es un síndrome tumoral raro causado por mutaciones puntuales en el gen Men1 que codifica para la menina. La investigación de la menina en el desarrollo de MEN1 es limitado. Actualmente, se han reportado tres organismos modelos dicha enfermedad: pez cebra, murinos y Drosophila melanogaster. Se ha determinado que el gen Men1 humano contiene una alta ortología con el gen Mnn1 de D. melanogaster, siendo un excelente modelo para la enfermedad. El objetivo del estudio fue la generación de plásmido recombinante pCR2.1-TOPO-Mnn1 con el potencial de silenciamiento del gen Mnn1 en D. melanogaster como un organismo modelo de MEN1. Para ello, se llevó a cabo el aislamiento de ARN de individuos adultos machos y hembras de la mosca, seguido de la síntesis de ADN complementario (ADNc). La amplificación del gen Mnn1, con la secuencia del promotor T7 en ambos sentidos, fue alcanzada con dos métodos distintos: PCR convencional y PCR anidado. Seguidamente, se realizó la inserción del fragmento del gen Mnn1 en el vector plasmídico, pCR2.1™-TOPO® y fue visualizado en un gel de agarosa. En conjunto, los resultados demostraron que se alcanzó la producción exitosa de un plásmido recombinante con el potencial de silencimiento del gen Mnn1 en individuos adultos de D. melanogaster. En futuras investigaciones se recomienda la generación de distintos fragmentos del gen Mnn1 para evaluar la eficiencia de silenciamiento en experimentos in vivo. También, la optimización de PCR para alcanzar una amplificación reproducible para el fragmento del gen diana. XI Abstract Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) is a rare tumor syndrome caused by point mutations in the Men1 gene encoding menin. Research based on menin in the development of MEN1 is limited. Currently, three model organisms for MEN1 have been reported: zebrafish, murine, and Drosophila melanogaster. It has been determined that the human Men1 gene contains high orthology with the Mnn1 gene in D. melanogaster, thus being an excellent model to study the biology of this disease. The main aim of this study was to generate a recombinant plasmid pCR2.1-TOPO-Mnn1 with the potential to silence the Mnn1 gene in D. melanogaster as a model organism for Men1. For this purpose, RNA isolation from adult male and female individuals of the fly was carried out, followed by the synthesis of complementary DNA (cDNA). Using polymerase chain reaction (PCR) the Mnn1 gene was amplified with the T7 promoter sequence in both directions. Next, the Mnn1 gene fragment was inserted into the plasmid vector, pCR2.1™-TOPO® and was visualized on an agarose gel. Taken together, these results show that the successful production of a recombinant plasmid with the potential to silence the Mnn1 gene was achieved with potential to be used in adult D. melanogaster individuals. In future research, the generation of different fragments of the Mnn1 gene is recommended to evaluate the silencing efficiency in in vivo experiments. Also, PCR optimization to achieve reproducible amplification for the target gene fragment. 1 1. Introducción Históricamente los modelos animales permiten comprender el funcionamiento de los genes involucrados en procesos fisiopatológicos, así como el desarrollo clínico de la enfermedad. En el caso del cáncer, los modelos animales han sido fundamentales para el estudio de la biología del tumor, el funcionamiento del gen y para futuros estudios preclínicos que conducen a la generación de nuevas terapias. Para el estudio de la neoplasia endocrina múltiple tipo 1 (MEN1) se han utilizado diversos modelos animales mediante la introducción de mutaciones causantes de pérdida de función en los ortólogos del gen Men1 en humanos. Los posibles modelos animales actualmente disponibles para MEN1 son Danio rerio (pez cebra), murinos, y Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) (Mohr & Pellegata, 2017). La mosca de la fruta se ha destacado como organismo modelo; posee una corta esperanza de vida y a su vez, un tiempo de generación rápido. Además, el mantenimiento es de bajo costo y cuenta con métodos bien establecidos para la alteración del genoma. También, ha demostrado su similitud genética en humanos, ya que incluye el gen Mnn1 que es ortólogo al gen Men1 humano. Esto representa una ventaja para el estudio de la menina, debido a que cuenta con un 46% de identidad global con la menina humana (Brandi et al., 2021). Actualmente se han descrito tres estudios donde se generan deleciones del gen Mnn1 en embriones de D. melanogaster. Estos estudios establecieron las bases del funcionamiento del gen en los procesos celulares. Recientemente, en una investigación se observó que la expresión del gen Mnn1 es mayor durante la etapa adulta de la mosca, y muy baja durante las etapas tempranas del ciclo de vida (Vidaurre Pinto, 2022). A pesar de que la mosca de la fruta ha demostrado su gran potencial en el estudio de cáncer, la cantidad de estudios para MEN1 es muy reducida, limitando la comprensión del funcionamiento del gen Mnn1 durante el desarrollo de la enfermedad. El presente trabajo de graduación en modalidad de tesis tiene como objetivo generar plásmido recombinante con potencial para el silenciamiento del gen Mnn1 en individuos de D. melanogaster como un posible modelo de MEN1. Esto brindará las herramientas necesarias para producir líneas transgénicas de mosca de la fruta y permitirá comprender a mayor profundidad el funcionamiento de la menina, así como el papel fisiológico en la regulación celular. 2 2. Objetivos 2. 1 Objetivo general Generar el plásmido recombinante, pCR2.1-TOPO-Mnn1, con potencial de silenciamiento del gen Mnn1 en individuos adultos de Drosophila melanogaster. 2.2 Objetivos específicos • Comparar la cantidad de ARN extraído de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster en diferentes tiempos de la vida adulta. • Producir ADN complementario (ADNc) a partir de ARN extraído de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster. • Amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el fragmento del gen Mnn1 con la secuencia del promotor T7 añadida en ambos sentidos. • Realizar la inserción del fragmento amplificado mediante PCR en el vector plasmídico pCR™2.1-TOPO® con potencial de silenciamiento del gen Mnn1 en D. melanogaster. 3 3. Justificación Los tumores neuroendocrinos (NET) representan un pequeño segmento de cánceres de baja prevalencia en la población. La neoplasia endocrina múltiple tipo 1 (MEN1) es el grupo de NET más frecuente, en su gran mayoría causado por mutaciones puntuales en el gen Men1, que codifica para la proteína menina (McDonnell et al., 2019). Sin embargo, su investigación es muy limitada para entender a profundidad el papel de la menina en la regulación celular; así como durante el desarrollo de MEN1. El potencial de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta ) como un modelo animal ha sido ampliamente explorado para el entendimiento de muchos procesos fisiopatológicos incluidos enfermedades infecciosas, cardiometabólicas, neurodegenerativas, cáncer, entre otras (Belmonte et al., 2020; Gracheva et al., 2022; Mirzoyan et al., 2019b). Sin embargo, para el estudio de MEN1 únicamente se han descrito tres modelos generados mediante la deleción de segmentos del gen Mnn1 de la mosca (Busygina et al., 2004; Cerrato et al., 2006; Papaconstantinou et al., 2005). El diseño de un plásmido recombinante con potencial del silenciamiento del gen Mnn1 de la mosca de la fruta, permitirá generar líneas transgénicas de mosca con la posibilidad de replicar el aspecto celular y clínico de MEN1. De esta forma, se podrán realizar estudios más detallados sobre el efecto de la menina como supresor de tumores, así como de activador y represor de múltiples vías de señalización indispensables en el funcionamiento celular. Actualmente, en Guatemala no se ha establecido ninguna línea de investigación con la mosca de la fruta. Este proyecto es un gran precedente en la investigación biomédica del país. Por primera vez se tendrán las herramientas para poder generar organismos transgénicos de D. melanogaster; dando paso a diversas líneas de investigación sobre cáncer, neurología, cardiología y metabolismo, entre otras enfermedades de interés a nivel nacional. 4 4. Marco teórico 4.1 Cáncer 4.1.1 Biología celular El cáncer ha sido motivo de una gran cantidad de estudios en países líderes en ciencia. Su estudio comprende desde los mecanismos celulares de crecimiento y proliferación celular desmedido, hasta la búsqueda de tratamientos dirigidos a la resistencia de mecanismos. El cáncer comprende un grupo de enfermedades caracterizadas por un crecimiento desmedido y anormal de células que se diseminan por naturaleza a diferentes tejidos (van Vugt & Parkes, 2022). Los marcadores del cáncer se definen como el conjunto de condiciones que son adquiridas por las células humanas durante la transición del crecimiento celular normal hasta el estado proliferativo que conduce a la formación de tumores malignos (Hanahan, 2022). Hanahan y colaboradores (2000), tras una búsqueda exhaustiva de los genotipos de células cancerosas, identificaron por primera vez las alteraciones esenciales de la fisiología celular que dictan el crecimiento maligno de tumores: autosuficiencia en las señales de crecimiento, insensibilidad a las señales inhibidoras del crecimiento, evasión de apoptosis, muerte celular (apoptosis), potencial replicativo ilimitado, angiogénesis sostenida e invasión de tejidos y metástasis (Hanahan & Weinberg, 2000). En el progreso de la investigación del cáncer posterior a esta publicación, se cuestionó la formulación original de estos marcadores. Se plantearon nuevos conceptos sobre la biología tumoral que podrían incluirse en esta lista (Hanahan & Weinberg, 2011). En la elaboración más reciente, se posee un conocimiento complejo en donde se ha podido demostrar que se comprenden hasta 10 marcadores del cáncer; los marcadores distintivos se incluyen en esta nueva representación junto con la evasión del sistema inmune y la desregulación del metabolismo celular (Figura 1, izquierda). Gracias al descubrimiento de los marcadores es posible comprender la complejidad de fenotipos y genotipos del cáncer (Hanahan, 2022) 5 Figura 1. Los ocho marcadores distintivos del cáncer junto con dos características claves recientemente identificadas. Actualmente, se incluyen ocho marcadores distintivos del cáncer junto con dos características de gran importancia. Los primeros seis marcadores fueron propuestos en 2000 y los dos marcadores emergentes fueron introducidos en 2011 (izquierda) (Hanahan, 2022). La inestabilidad genómica junto con el estado proinflamatorio, son un rasgo característico de las células tumorales. Los niveles elevados de la inestabilidad genómica se asocian al conjunto de mutaciones somáticas y hereditarias en los diferentes mecanismos de reparación de ADN. Estos defectos pueden conducir a aberraciones genómicas, uso de mecanismos de reparación no conservativos como unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés) y colapsos en las horquillas de replicación junto con ruptura de ADN de doble hebra (dsDNA). Al no contar con mecanismos de reparación en los puntos de control inmunitario de la división celular pueden sufrir mutaciones o alteraciones. Esto conduce a una proliferación celular y crecimiento descontrolado de las células que favorece la formación de tumores (van Vugt & Parkes, 2022). Los tumores son un conjunto de células huésped infiltrantes y residentes, factores secretados y matriz extracelular (Anderson & Simon, 2020a). Las células tumorales modifican ambientes moleculares y físicos de los tejidos en los que se encuentran para favorecer su crecimiento y desarrollo en el huésped (De Palma et al., 2017). Por lo tanto, la composición de los microambientes tumorales (TME, por sus siglas en inglés) varía según el tejido y el tipo de tumor, pero en su mayoría incluyen células del estroma, células inmunitarias, matriz extracelular y vasos sanguíneos (Anderson & Simon, 2020a). Además, los TME se han asociado con respuestas a los inhibidores de puntos de control inmunitario. Por ello, es de suma importancia comprender cómo el cáncer genómicamente inestable posee mecanismos de adaptación de los inhibidores del punto de control inmunitario, ya que pueden ser objetivo terapéutico (Anderson & Simon, 2020b). 6 4.1.2 Epidemiología 4.1.2.1 Contexto a nivel mundial Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 2019, el cáncer fue considerado la primera o segunda causa de muerte en adultos mayores de 70 años en 112 países aproximadamente (WHO, 2020a). Debido a la magnitud y distribución del cáncer, esto representa un obstáculo para el aumento de esperanza de vida en la mayoría de los países del mundo. En 2020, Sung y colaboradores, realizaron una investigación de la incidencia y mortalidad del cáncer a nivel mundial. La Figura 2 muestra la incidencia de cánceres más comunes y las principales causas de muerte por cáncer según el sexo (Liang et al., 2021). En los hombres, el cáncer de próstata representa el cáncer diagnosticado con mayor frecuencia (14.3%), seguido del cáncer de pulmón (14.1%), el cáncer colorrectal (10.6%) y el cáncer de estómago (7.1%). Por el otro lado, el cáncer diagnosticado con mayor frecuencia en mujeres es el cáncer de mama (11.7%) y el cáncer de pulmón (11.4%). Cabe resaltar que la incidencia de todos los cánceres fue un 19% mayor en los hombres que en las mujeres, sin embargo, las tasas varían entre regiones (Sung et al., 2021)x. Figura 2. Mapa global de la incidencia de los tipos de cáncer a nivel mundial en 2020. Incidencia del tipo de cáncer más común en cada país en (A) hombres y (B) mujeres (Sung et al., 2021). 7 Respecto al perfil de mortalidad, en las mujeres se obtuvo que el cáncer de mama y de cuello uterino son las principales causas de muerte por cáncer, seguidas del cáncer de pulmón. En cuanto a los hombres, el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte, seguido del cáncer colorrectal y de hígado (Sung et al., 2021). 4.1.2.2 Contexto en Guatemala Según la OMS en 2020, se reportaron más de 16, 000 casos de cáncer con una mortalidad de 56% en una población total de 18 millones de personas en Guatemala. Se identificó que el cáncer diagnosticado con mayor frecuencia es el cáncer de próstata (13.1%) seguido del de mama y estómago (11.0%), hígado (10.9%), cuello uterino (9.2%), leucemia (5.3%), colorrectal (4.9%), tiroides (4.1%), pulmón (2.4%) y linfoma no hodgkiniano (1.8%) (WHO, 2020b). Tomando en cuenta, que se incluyen algunos tipos de cáncer más comunes del país, la implementación de estudios epidemiológicos es sumamente importante. Esto permitirá determinar el alcance de la incidencia del cáncer, incluso en los menos frecuentes como los tumores neuroendocrinos, entre otros. 4.2 Tumores neuroendocrinos (NET, por sus siglas en inglés) 4.2.1 Definición y heredabilidad Los NET son neoplasias heterogéneas que están caracterizadas por la producción, almacenamiento y secreción de péptidos y aminas. Los NET se manifiestan en las células del sistema neuroendocrino de forma difusa y pueden diseminarse hacia otros tejidos del cuerpo humano (Hofland et al., 2018). Los NET son considerados de baja prevalencia, con presentación clínica inespecífica siendo una de las causas por las que el diagnóstico llega tarde (S. Singh et al., 2017). Las formas más comunes son a nivel del tracto gastrointestinal (48%), los pulmones (25%) y el páncreas (9%). También se han descrito en otros órganos incluidos los senos, el timo, la próstata y la piel (Raphael et al., 2017). Los NET en su mayoría, surgen esporádicamente, pero en algunos síndromes se deben a una mutación genética hereditaria como la neoplasia endocrina múltiple tipo 1 (MEN1, por sus siglas en inglés), la MEN2, el síndrome de Von Hippel-Lindau (VHL), la neurofibromatosis y la esclerosis tuberosa (Gut et al., 2015; Oronsky et al., 2017). La vía PI3K-AKT-mTOR es esencial en los pacientes, la evidencia sugiere que está involucrada en la progresión neoplásica y en la resistencia al tratamiento mediante la sobreactivación de mecanismos. También, juega un papel fundamental en el crecimiento celular, el metabolismo y la regulación de la traducción de proteínas (Jiao et al., 2011; Zanini et al., 2020). La vía diana de rapamicina en células de mamífero (mTOR) al ser frecuentemente 8 desregulada en los tumores humanos, ha sido el objetivo central en el desarrollo de nuevos tratamientos contra el cáncer. Sin embargo, el papel de los medicamentos específicos para el manejo de NET aún no se ha desarrollado por completo, debido a la variable presentación clínica de los NET, por lo que sigue siendo un desafío su estudio (Jiao et al., 2011). Los NET comprenden el 2% de las neoplasias malignas con una prevalencia de <200,000 en toda la población de Estados Unidos, por lo que es considerado como una enfermedad huérfana (Basu et al., 2010). A pesar de la rareza de los NET, Dasari y colaboradores (2017) realizaron un estudio poblacional donde demuestran que la incidencia y la prevalencia ha ido en aumento. En 1973, la incidencia de NET fue de 1.09 por 100,000 y aumentó a 6.98 personas en 2012. Se obtuvo un aumento dramático en la incidencia de pacientes mayores de 65 años, con un aumento de 8 veces a 25.3 por 100,000 personas. Esto refleja la importancia del diagnóstico temprano y el seguimiento de los pacientes para el aumento de la supervivencia (Dasari et al., 2017). 4.2.2 Síndromes neuroendocrinos 4.2.2.1 MEN1 La MEN1 es un síndrome tumoral raro que se hereda de forma autosómica dominante. Se caracteriza por la predisposición de tumores en las glándulas paratiroides en el 90% de los casos, seguido de tumores pancreáticos (60%) y los adenomas hipofisarios (40%). También, se pueden desarrollar otros tumores endocrinos como carcinoides del intestino anterior y tumores gástricos; los tumores no endocrinos son poco frecuente, incluyen tumores carcinoides del timo, tumores adrenocorticales, bronquios o estómago, tumores del sistema nervioso central (SNC), lipomas, leiomiomas, colagenomas y angiofibromas (G. Singh et al., 2020). Estudios recientes han informado un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama en mujeres diagnosticadas con MEN1 (Figura 3) (Dreijerink et al., 2014). 9 Figura 3. Tumores asociados en MEN1. Cuadro clínico de los tumores asociados en pacientes diagnosticados con el síndrome MEN1 (Adaptado de: G. Singh et al., 2020). El gen supresor de tumores Men1 ha sido el objetivo de estudio junto con la proteína codificada, menina. El diseño de estudios consiste en experimentos donde se genera una pérdida de función del gen Men1 en ratones de forma heterocigota, ya que su forma homocigota es letal en embriones. Las presentaciones clínicas de los ratones fueron tumores hipersecretores en islotes pancreáticos (insulinomas, prolactinomas e hiperplasias (Brandi et al., 2021; Harding et al., 2009). Las mutaciones del gen Men1 se asocian a la pérdida de heterocigosidad del alelo normal. Además, la proteína cumple funciones pleiotrópicas a nivel celular en la organización de cromatina, regulación de la transcripción, vías de señalización implicadas en el crecimiento y hormonas, y en la organización del citoesqueleto (Al-Salameh et al., 2021). De acuerdo con las directrices de 2012, MEN1 es diagnosticado si cumple con al menos uno de los tres criterios: 1) criterio clínico, dos o más manifestaciones clásicas; 2) criterio familiar, si tiene una manifestación clásica de MEN1 y un familiar de primer grado previamente diagnosticado con MEN1; 3) criterio genético, si tiene una mutación en el gen Men1 (Thakker et al., 2012). La detección de mutaciones permite un diagnóstico temprano antes de la aparición de marcadores bioquímicos o presentaciones clínicas (Giusti et al., 2017; Kamilaris & Stratakis, 2019). Este diagnóstico se complica en casos donde los tumores ocurren de forma esporádica, sin ningún historial familiar. Esta presentación esporádica ocurre en el 19% de los casos (Giusti et al., 2017). Las presentaciones clínicas más importantes es la aparición temprana de tumores endocrinos 10 espontáneos (antes de los 40 años) y tumores múltiples en una misma glándula u órgano (Thompson & Landry, 2021). Una vez diagnosticado el síndrome, se debe realizar el tamizaje de tumores en otras glándulas para asegurar la detección temprana de nuevos tumores. El seguimiento de los pacientes se hace con equipos multidisciplinarios que incluyen oncología, gastroenterología, endocrinología, radiología, medicina nuclear y genética (Thompson & Landry, 2021). 4.2.2.2 Menina como un supresor de tumores involucrado en diferentes vías de señalización La función de la menina ha sido de gran interés para poder entender la fisiopatología de MEN1 en humanos. Por lo que muchos estudios se han realizado sobre la función del gen Men1 y la menina en muchos organismos, incluidos Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), murinos; y más recientemente, líneas celulares humanas (Abi-Rafeh et al., 2022; Monazzam et al., 2020; Papaconstantinou et al., 2010). La predisposición de tumores en pacientes con MEN1 se debe a la mutación en la línea germinal del gen Men1. En 1997, se identificó por primera vez el locus genético en el cromosoma 11q13 que consta de 10 exones (Lemos & Thakker, 2008). Desde su descubrimiento, se han detectado aproximadamente 1300 mutaciones patogénicas a lo largo de la secuencia del gen (Khatami & Tavangar, 2018). La mayor parte de las mutaciones son causadas por deleciones e inserciones, seguido de las mutaciones de pérdida de sentido, mutaciones en el sitio de empalme, y en algunos casos la deleción completa del gen que conducen a la pérdida de función de la menina (Lemos & Thakker, 2008). Actualmente, se sabe que la menina se encuentra distribuida de forma ubicua, con mayor actividad en el núcleo. Sin embargo, una pequeña fracción de esta proteína se encuentra en la membrana de las vesículas; indicando un posible rol de comunicación y señalización entre células (He et al., 2016). Esto se puede corroborar al entender que la menina no codifica para ninguna enzima. Además, sus aminoácidos no presentan posibilidad de ser dominios funcionales, por lo que se puede inferir que su función como supresor de tumores es puramente mediante la interacción proteína-proteína. El rol de regulador de transcripción de la menina se ha descrito en factores de transcripción (de iniciación o elongación), mecanismos de reparación de ADN, y más recientemente asociada a un complejo proteico nuclear (que incluyen los miembros del grupo tritorax) que promueve la metilación de histonas H3 y lisina 4 (Cheng et al., 2019; Feng et al., 2017; Kamilaris & Stratakis, 2019). Desde hace más de una década, la interacción de la menina como regulador transcripcional de diferentes factores de transcripción había sido descrita. Inicialmente, se describió en levaduras una función represora del factor de transcripción JunD, elucidando 11 a su vez el mecanismo represor de la desacetilación de histonas (Agarwal et al., 1999; Gobl et al., 1999). Posteriormente, se estableció que c-Myc (protooncogén) interactúa directamente con la menina (Brès et al., 2009). Actualmente, se ha establecido la importancia de JunD en la proliferación celular con una interacción directa entre c-Myc (Elliott et al., 2019). Por lo tanto, se infiere que las mutaciones o la pérdida de función en la menina conducen a una sobreexpresión de JunD y, por consiguiente, el aceleramiento de la proliferación celular y activación de vías de señalización posteriores. Los primeros hallazgos de la función de la menina también fueron asociados a la vía de señalización PIK3K/AKT, la vía de crecimiento y proliferación más importante a nivel celular. Los datos revelaron que ratones con pérdida de funciones del gen Men1 desarrollaron insulinoma. Además aumentó la proliferación de células β y el tamaño de los islotes (Yang et al., 2010). Este efecto fue posible replicarlo al tratar células de insulinoma INS1 con altas concentraciones de glucosa, confirmando la activación de la menina mediante FOXO1, una diana de la vía PI3K/AKT (Zhang et al., 2012). También se ha identificado que la pérdida de función del gen Men1 en ratones está asociado a la acumulación de -catenina en tejido fibroblástico y endocrino (Cao et al., 2009). Es bien sabido que la regulación anormal del factor de transcripción - catenina, siendo este un factor clave en la señalización de la vía Wnt, está asociado a eventos de carcinogénesis temprana (Wei et al., 2019). El efecto de supresor de tumores ha sido asociado al rol como antagonista del sistema de transición epitelial-mesenquimal (EMT, por sus siglas en inglés) (Cheng et al., 2019). Ha sido bien descrito que la activación de EMT es considerada la mayor promotora de metástasis (Krebs et al., 2017; Skrypek et al., 2017). Por lo tanto, mutaciones puntuales en el gen que codifica para la menina, generan una falta de regulación de EMT, promoviendo la migración celular en sitios cancerígenos. Por otro lado, el rol de la menina se extiende a estar implicado en diferentes mecanismos de reparación, esto mediante su fosforilación en respuesta en una variedad de daño al ADN. Además, fue establecido que en mutaciones asociadas a Men1, no se activan los mecanismos de reparación de ADN dependientes de fosforilación (Francis et al., 2011). Específicamente, se ha establecido una asociación de la menina con la proteína del grupo D2 de anemia Fanconi (FANCD2, por sus siglas en inglés) (Marek et al., 2008). FANCD2 es un heterodímero que permite la ejecución de la señalización para la reparación de ADN. También previene el colapso de los horquillas de replicación durante la fase S del ciclo celular (Liang et al., 2021). En células con mutaciones del gen Men1, no es posible la activación de FANCD2, llevando a la inactivación de los mecanismos de reparación de ADN. La acumulación de ADN dañado contribuye en gran medida a la inestabilidad genómica; uno de los marcadores más importantes en la mayoría de los cánceres (Hanahan, 2022; Negrini et al., 2010). A pesar de la acumulación de células con inestabilidad genómica y cromosomal, estas células deben multiplicarse para tener un efecto tumorigénico. Por lo tanto, mecanismos de regulación de proliferación son afectados por la pérdida de funciones de la menina. 12 El regulador más importante de la proliferación, el crecimiento y la muerte celular es la proteína p53 con función supresora de tumores (Marei et al., 2021). Investigaciones previas han establecido la asociación de la menina en condiciones normales con el aumento de la actividad de p53 demostrando su rol como supresor de tumores (Bazzi et al., 2008; Falchetti et al., 2009). A pesar del papel tan importante de p53 en la homeostasis celular, únicamente 4% de los NETs presentan mutaciones del gen Tp53, mientras el 44% presenta mutación del gen Men1 (Scarpa et al., 2017; Sigel et al., 2018). Sin embargo, se ha establecido que la menina presenta una función colaborativa más fuerte con pRB y PTEN; otros importantes supresores de tumores y no con p53 (Xu et al., 2020). Esto había sido propuesto por Loffler y colaboradores en 2012, donde demostraron que mutaciones en p53 y menina no tiene un efecto sinérgico, más bien, tiene un efecto aditivo en la progresión tumoral (Loffler et al., 2012). 4.2.2.3 Tratamientos utilizados para MEN1 El tratamiento más utilizado para MEN1 es la intervención quirúrgica. Sin embargo, en casos donde el paciente presenta tumores multiorgánicos, y con mayor capacidad migratoria, la cirugía es contraindicada. Debido a la baja incidencia de MEN1, es muy difícil la investigación clínica para la evaluación de posibles drogas terapéuticas. Para el tratamiento general de NET se utilizan drogas que tienen como diana al receptor de somatostatina (SSTR), mTOR, y receptores tirosina quinasa (RTK) (Brandi et al., 2021; Pavel et al., 2016). La primera línea de tratamiento comprende a los análogos de somatostatina (SSAs) son la primera línea de tratamiento farmacológico para NET uniéndose a SSTR1-5 expresados en tumores asociados a MEN1. En 2008 se describió el efecto estimulador de la somatostatina sobre la expresión de la menina mediante la inhibición de la proteína quinasa A (Mensah-Osman et al., 2008). Los SSA tiene un mecanismo farmacológico basado en el bloqueo de la vía de señalización SSTR tenido efectos antisecretores y antiproliferativos; todo esto facilita el control sintomático mediante la hipersecreción hormonal y reduciendo la progresión tumoral (Rinke et al., 2017). También se han explorado moduladores epigenéticos. La menina es un regulador de la arquitectura de histonas por la vía de metiltransferasas y complejos deacetilasas, teniendo efecto a la expresión génica. Estudios clínicos son JQ1 han mostrado reducción en la secreción de hormonas mediada por la inhibición de bromodominios y motivos extra terminales (BET) de la enzima histona deacetilasa (HDAC) en pacientes con NET pancreático asociado a MEN1 (Lines et al., 2020). Otro enfoque ha sido la inhibición de HDAC5 mediante el fármaco LMK-235 que ha mostrado reducción significativa de la proliferación y aumento de apoptosis en líneas celulares de NET pancreático (He et al., 2016). 13 Anteriormente se describió que la menina también promueve la fosforilación de 𝛽- catenina, resultando en la inhibición de la vía de señalización Wnt (Frost et al., 2018). El inhibidor de 𝛽-catenina, PRI-724, ha mostrado reducción significativa del NET pancreático en líneas celulares. Mismos resultados fueron confirmados en ensayos preclínicos con ratones, por lo que actualmente este medicamento se encuentra en ensayos clínicos (Jin et al., 2020). En la Figura 4 se muestra las terapias farmacológicas más utilizadas para el tratamiento de MEN1, así como las vías de señalización bloqueadas o activadas para cada grupo de medicamentos. Figura 4. Terapias utilizadas para el tratamiento de MEN1 incluyendo: análogos de somatostatina, inhibidores de RTK, iniciadores de mTOR, antagonistas de 𝛽-catenina, y moduladores epigenéticos. Abreviaciones: RTK; receptores tirosina quinasa, mTOR; diana de rapamicina mamífero (Frost et al., 2018). El reemplazo génico es una vía que sigue en exploración debido a los avances en la terapia génica. La inyección de material genético recombinante con el gen Men1 ha sido prometedor en ratones al aumentar la expresión de menina, seguido de reducción en la proliferación celular (Harding et al., 2009). 14 4.3 Modelos animales para MEN1 Los modelos animales del cáncer han sido una gran herramienta para la comprensión de la biología del tumor y su progresión, el estudio de la función y expresión de genes, y el desarrollo de experimentos para implementar nuevas terapias (Mohr & Pellegata, 2017). La menina es una proteína altamente conservada en una variedad de especies que contienen homología en las secuencias entre el gen humano Men1. También, se identificó la conservación de JunD y MLL humana entre especies como ratones, ratas, Danio rerio (pez cebra) y la mosca de la fruta. A pesar de que no se ha identificado una correlación genotipo-fenotipo en MEN1, el uso de modelos animales permite la comprensión del gen y la menina en la tumorigénesis de los diferentes sistemas de los organismos (Wiedemann & Pellegata, 2016). Hasta la fecha, se han descrito modelos animales para MEN1 que cuentan con un fenotipo similar y tienen potencial para estudiar su patogenia. Estos modelos animales se generan mediante la introducción de mutaciones que conducen a la pérdida de función del gen ortólogo humano Men1 (Mohr & Pellegata, 2017). Desde hace 50 años el pez cebra ha sido utilizado como un modelo animal para el estudio de trastornos del desarrollo. Recientemente, se descubrió su potencial para la investigación de cáncer (Cagan et al., 2019). Las ventajas de este modelo radican en la numerosa progenie, la fácil evaluación de los embriones debido a su transparencia y la conservación de órganos vertebrados (Vitale et al., 2014). Adicionalmente, cuenta con una variedad de herramientas genéticas para la manipulación del genoma. Desde el 2000, Manickam y colaboradores describieron un gen denominado Men1 ortólogo al gen humano, que codifica para una proteína con un 80% de similitud con la menina humana (Manickam et al., 2000). También, se identificó la conservación de unión de menina con JunD en el pez cebra. Esto posiciona al pez cebra como un modelo prometedor para MEN1. Sin embargo, su mantenimiento tiene un costo muy elevado, requiere de entrenamiento y equipo especializado para su manipulación. La principal razón del uso de murinos es que se asemejan a la enfermedad humana en términos del espectro tumoral y los cambios hormonales. En el caso de MEN1, los ratones han demostrado una pérdida de función de Men1 que conduce a un fenotipo clave con el síndrome (Mohr & Pellegata, 2017). En la actualidad, se han generado 4 líneas de ratones transgénicos que incluyen deleciones del gen Men1. Cada modelo abordó diferentes exones del gen, A pesar de sus similitudes genotípicas con el síndrome humano, los murinos han sido poco utilizados en estudios preclínicos y moleculares. Son considerados más adecuados para establecer imágenes para el diagnóstico y el seguimiento de la enfermedad (Wiedemann & Pellegata, 2016). La mosca de la fruta ha demostrado su potencial como organismo modelo en cáncer y en las bases de la herencia del ADN. En 2006 se revelaron genes de importancia en la tumorigénesis que se conservan entre el hombre y la mosca como Notch, Shh, Wnt y Men1 15 (Beller & Oliver, 2006). Las ventajas del organismo son los tiempos cortos de cortos y, por consiguiente, numerosa progenie. También, se incluyen los bajos costos de mantenimientos y que los métodos están bien establecidos para modificar el genoma (Roberts, 2006). D. melanogaster cuenta con el gen Mnn1 que es ortólogo al gen humano Men1. Codifica una proteína que es 46% idéntica con la menina humana. Actualmente se demostró una interacción entre la menina y la JunD humana (Cerrato et.al., 2006). Por lo tanto, es útil para brindar información sobre la función de menina como regulador de la transcripción y la reparación del ADN, y sus implicaciones en la tumorigénesis (Nainu et al., 2020). 4.3.1 Drosophila melanogaster como un modelo de estudio para la función de la menina. En el 2004, en la elucidación de la función de Men1, Busygina y colaboradores generaron por primera vez el alelo mutante nulo de Mnn1 y se caracterizó el fenotipo de la pérdida de función de la menina en D. melanogaster. Gracias a estos datos, revelaron que Mnn1 pertenece a los genes de cáncer autosómicos dominantes que están involucrados en el mantenimiento de la integridad genómica (Busygina et al., 2004). Seguidamente, en 2005, Papaconstantinou y colaboradores demostraron el rol que tiene la menina en la respuesta al estrés activando proteínas de procesamiento de estrés como Hsp70 en embriones de la mosca (Papaconstantinou et al., 2005). Por primera vez, se utilizó la técnica de ARN interferencia (RNAi, por sus siglas inglés) para el gen Mnn1 en esta especie, demostrando su potencial en la investigación de genética funcional. Cerrato y colaboradores (2006) también generaron líneas de moscas con deleciones del gen Mnn1 estableciendo la relación entre el gen Mnn1 y la vía de señalización de los heterodímeros JunD/Fos en D. melanogaster (Cerrato et al., 2006). Esta vía de señalización es la principal reguladora de tumorigénesis, diferenciación, apoptosis, respuesta inmune y estrés tanto en vertebrados como en mosca (Kockel et al., 2001; Mechta-Grigoriou et al., 2001). En resumen, se han generado tres cepas de D. melanogaster a través de la introducción de deleciones en Mnn1 que conducen a la pérdida de expresión de la menina en moscas. Por lo tanto, se estableció la función del gen Mnn1 en la regulación de los procesos celulares. Sin embargo, se ha realizado poca investigación desde entonces. El estudio de la menina en D. melanogaster ha sido muy limitado, principalmente por la baja cantidad de animales transgénicos generados. Sin embargo, para poder estudiar un proceso fisiopatológico en cualquier organismo modelo, es indispensable conocer la función del gen de interés en condiciones fisiológicas normales. Por lo que recientemente se estableció el patrón de expresión del gen Mnn1 durante los diferentes estadios de vida de la mosca. Vidaurre en 2021 estableció que la expresión relativa del gen es mayor durante la etapa adulta de la mosca; y muy baja durante los estadios iniciales de vida (Vidaurre Pinto, 2022). Esta observación es coherente a la función supresora de tumores del gen Mnn1, ya que, durante la etapa adulta de la mosca, existen procesos celulares de reparación más complejos. Además, la alta expresión del gen en moscas adultas sugiere 16 que durante esta etapa es la adecuada para llevar a cabo el silenciamiento de gen, ya que se obtendrá mayor efecto fenotípico. 4.3.2 Biología de Drosophila melanogaster La mosca de la fruta es un organismo ampliamente utilizado en la investigación biomédica, la comprensión de sus procesos fisiológicos ha permitido adaptar este organismo al estudio de una variedad de enfermedades, que incluyen: enfermedades metabólicas, cardiacas, hepáticas, neurodegenerativas y cáncer, entre otras (Baenas & Wagner, 2019; Guida et al., 2019; Mariano et al., 2020; Mirzoyan et al., 2019a; Moraes & Montagne, 2021). Por lo que tienen el potencial de ser herramientas que permitan modelar enfermedades y poder responder preguntas acerca de los mecanismos fisiopatológicos o farmacológico de importancia clínica. 4.3.2.1 Ciclo de vida de Drosophila melanogaster D. melanogaster tiene un ciclo de vida corto, por lo que su crianza permite obtener grandes cantidades de individuos. Este insecto tiene un ciclo de vida que se puede dividir en cuatro estadios: embrión, larva, pupa y adulto (Figura 5). Figura 5. Etapas del desarrollo de D. melanogaster (Basa en Vidaurre Pinto, 2022). 17 Las hembras liberan aproximadamente 100 embriones por día, el desarrollo de estos embriones dura 24 horas. El embrión desarrollado, se convierte en una larva. Se han descrito tres instares larvarios para D. melanogaster, el correcto desarrollo del adulto depende del abastecimiento correcto de nutrientes durante esta etapa (Fernández-Moreno et al., 2007; Moraes & Montagne, 2021). La mosca de la fruta debe madurar durante el estadio pupario, donde se lleva a cabo la metamorfosis completa del cuerpo. En esta etapa el tejido larvario de degrada y los órganos adultos se desarrollan completamente. El adulto se forma entre 9-10 días después de la fertilización del huevo (Ugur et al., 2016). El adulto vive entre 30-60 días (Johnson & Stolzing, 2019). 4.3.2.2 Genética de Drosophila melanogaster El genoma de D. melanogaster ha sido elucidado previamente, llevando a identificar un estimado de 180 millones bases distribuidos en cuatro pares de cromosomas (Adams et al., 2000; Bosco et al., 2007; Brown & Celniker, 2016). El primer par son los cromosomas sexuales incluyendo el cromosoma X y Y con pocos genes, y en su mayoría compuesto por heterocromatina. Los cromosomas 2 y 3 son muy grandes, mientras que el cromosoma 4 es muy pequeños, estos últimos de características autosómicas (Hales et al., 2015). Debido a muchos proyectos acerca de la comprensión del genoma de la mosca de la fruta, actualmente se tienen bases de datos que permiten comprender la genética de Drosophila incluyendo información acerca del efecto de los estadios de la mosca, expresión de genes, patrones de corte y empalme alternativos, promotores, y estructura de cromatina (Boley et al., 2014). Además, de la comprensión del genoma de la mosca de la fruta, es importante resaltar que el 75% de los genes causantes de enfermedad en humanos presentan homología funcional en las moscas (Chaouch & Lasko, 2021; Ugur et al., 2016); por lo que este organismo tiene un gran potencial como modelo de enfermedades. 4.4 Ingeniería genética 4.4.1 Clonación molecular En términos generales la clonación molecular se describe como el aislamiento de un fragmento de ADN y su inserción a través de un vector para su propagación. Una vez aislados los fragmentos, es posible generar una gran cantidad de copias de ADN in vitro (Lessard, 2013b). Desde 1987, cuando se reportó por primera vez la clonación de genes de Escherichia coli, ha sido posible llevar a cabo la clonación en otros como promotores, secuencias no codificantes, oligonucleótidos, secuencias de ADN al azar, entre otros 18 (Dallas et al., 1987; Nguyen et al., 2004). Los avances recientes de la clonación molecular en la microbiología clínica incluyen aplicaciones en el contexto de infecciones polimicrobianas, antígenos recombinantes, vacunas recombinantes, sondas de diagnóstico, péptidos antimicrobianos y citoquinas recombinantes (Sharma et al., 2014). También se ha utilizado para la conservación animal, generación de organismos modelos y aceleración de procesos de multiplicación en ganado, entre otras aplicaciones (Negash, 2017). Es tanta la importancia de esta técnica, que recientemente se desarrolló un clon de ADN complementario (ADNc) para el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS- CoV-2) (Xie et al., 2021). La clonación molecular consiste en el aislamiento de fragmentos de ADN de interés, la ligadura del inserto en un vector de clonación, la transformación de plásmidos recombinantes en un hospedero adecuado para la propagación y la selección de huéspedes que incluyen el plásmido previsto (Lessard, 2013b). Existen tres métodos dependientes de ligasa para la ligación de productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) a un plásmido: ligación de extremo corto (blunt-end, por sus siglas en inglés), ligación de extremo cohesivo y clonación TA (Yao et al., 2016). El uso de enzimas de restricción ha aumentado la eficiencia de la clonación molecular, ya que permite identificar la secuencia específica de ADN y llevar a cabo la ruptura de la doble hebra de ADN. Por lo tanto, la elección de las enzimas es un paso crítico en el diseño de clonación. Sin embargo, la técnica tradicional de digestión-ligación no siempre es viable, ya que requiere que tanto el vector como los fragmentos de interés cuenten con sitios de restricción (Ashwini et al., 2016). La ligación de extremo corto de un fragmento de ADN en un plásmido linealizado es frecuente, sin embargo, no es del todo eficiente (Kolganova et al., 2018). Por otro lado, la ligación cohesiva es la más utilizada para la clonación molecular, ya que es posible generar extremos cohesivos en el inserto de ADN de interés mediante enzimas de restricción; este inserto con los extremos cohesivos se pueden ligar al plásmido con extremos cohesivos. Sin embargo, este método puede dificultarse debido a la presencia de sitios de digestión internos en el fragmento (F. Chen et al., 2021; Motohashi, 2019). La clonación TA es la técnica más simple y eficiente para la incorporación del productos de PCR en un plásmido. La mayor ventaja es que en la mayoría de los experimentos no hace uso de la enzima ligasa (Yao et al., 2016). Dadas las dificultades de esta técnica, nuevas alternativas han surgido en las últimas décadas, las cuales proporcionan una mayor eficiencia de clonación. Esto incluye la clonación de productos PCR con vectores T, la cual ha sido crucial para comprender las bases de la genética, biotecnología, biología sintética, farmacia, bioquímica proteica, entre otras (Celie et al., 2016; Nichols, 2003). La clonación TA dependiente de la Taq polimerasa se incluye en los vectores T. La actividad transferasa de esta enzima permite la adición de una sola desoxiadenosina (A) en los extremos 3´ del producto PCR. Los productos se mezclan con el vector que cuenta con secuencias complementarias de 3´desoxitimindina (T); la ADN ligasa cataliza la unión entre las hebras de ADN por enlaces fosfodiéster y, 19 por tanto, la unión entre el vector y el inserto. La clonación TA permite la clonación de fragmentos de ADN amplificados por PCR, sin el uso de enzimas de restricción. Esta técnica se utiliza cuando no se cuenta con sitios de restricción (Aranishi & Okimoto, 2004; Holton & Graham, 1991; Motohashi, 2019). 4.4.1.1 Vectores plasmídicos Los plásmidos son los vectores más utilizados en la investigación de clonación molecular. Ha sido una herramienta para la investigación de la estructura, función y, evolución de genes y células (Lessard, 2013a). También, ha jugado un papel importante en el estudio de la ingeniería genética, proteica y metabólica (Nora et al., 2019). Los plásmidos se pueden replicar a un alto número de copias en bacterias y contienen un sitio de clonación múltiple que permite insertar un fragmento de ADN. La selección de un marcado, así como un gen de resistencia a antibióticos permite la selección de bacterias recombinantes, es decir que incluyan el plásmido de interés. También, se suele incluir un marcador detectable con β-galactosidasa y un sitio de clonación múltiple que permite la ligación de los insertos en un marco de lectura predecible. Por tanto, un vector de clonación permite la transcripción de un gen clonado y la traducción de la proteína (Pashley & Kendall, 2003; Sue et al., 2012). Desde la aparición del primer plásmido, pBR322, muchos otros se han derivado de este para una amplia variedad de funciones. Las modificaciones incluyen la adición de más sitios de restricción, marcadores de selección, aumento de estabilidad, cambios en el número de copias y adición de señales para facilitar la secreción de proteínas (Nora et al., 2019). Incluso, se han desarrollado reservorios de plásmidos utilizados en diferentes campos de investigación (Galata et al., 2019). Actualmente, uno de los vectores comerciales más importante y ampliamente utilizado para la clonación molecular es el plásmido pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, 2021). La eficiencia de incorporación de productos de PCR en el plásmido pGEM®-T ha sido comparada con otros plásmidos de este tipo; y ha demostrado la producción de alto número de recombinantes usando un amplio rango de tamaño de inserto (0.5-3kb) (Litterer, 2009). Sin embargo, recientemente, se han desarrollado vectores plasmídicos que permitan la incorporación de un producto de PCR de forma más eficiente. La clonación mediada por topoisomerasa I de Vaccinia, conocida como clonación TOPO, ha sido ampliamente utilizada en la investigación biológica y biomédica. Fue desarrollada por Shuman (1992) mediante el estudio de la topoisomerasa I del virus Vaccinia; capaz de catalizar la transferencia específica de hebras durante la recombinación genética (Shuman, 1992). La principal ventaja de esta técnica es que no necesita enzimas de restricción ni ligasa de ADN (Udo, 2015). Existen vectores TOPO comercialmente disponibles, sin embargo, el vector pCR™2.1TOPO de Invitrogen es el más utilizado. La 20 eficiencia de transformación de los vectores TOPO ha demostrado ser superior a la de otros vectores T, al utilizar insertos de pequeño tamaño (<1kb) (Litterer, 2009). En la Figura 5 se puede observar el mapa genómico del plásmido comercial pCR™- 2.1TOPO. Este plásmido tiene un marcador de selección en forma de resistencia a ampicilina, así como un promotor T7 en la localización de inserción de fragmento de interés. A este segmento se le conoce como sitio de clonación múltiple (MCS, por sus siglas en inglés). El MCS se encuentra en la región correspondiente al operón lac, específicamente en el fragmento del gen lacZ, que codifica para la enzima -galactosidasa, involucrada en el metabolismo de lactosa en bacterias (Thermo Fisher Scientific, 2022). Figura 6. Mapa genómico del vector pCR™2.1TOPO. El plásmido pCR™-2.1TOPO presenta resistencia a ampicilina como un marcador de selección. También cuenta con un operón lac con sitios de clonación múltiple y un promotor T7 (Invitrogen, 2019). 4.4.2 Transformación bacteriana Los vectores de clonación proporcionan una estructura sólida para que el inserto de ADN se pueda reproducir y propagar en bacterias, para ello es necesario que se lleve a cabo la transformación bacteriana (Carter & Shieh, 2015). Esto se describe como el proceso de transferencia horizontal de genes, done las bacterias toman material genético del medio ambiente en el que se encuentran (Johnston et al., 2014). La primera vez que se informó sobre la transformación bacteriana natural fue en 1928 con Streptococcus pneumoniae, una bacteria Gram positiva (Griffith, 1928). Desde entonces, se conoce un total de 82 especias 21 que son naturalmente transformables, siendo E. coli la especie bacteriana más común para el flujo de trabajo de clonación (Johnsborg et al., 2007; Lorenz & Wackernagel, 1994). El proceso de transferencia requiere de bacterias denominadas células competentes. Es decir, que tienen la capacidad de captar el material genético extracelular y de responder a cambios en el entorno. Dado que la mayoría de las especies bacterianas cuentan con una competencia natural muy baja o incluso inexistente, es necesario recurrir a la preparación de células competentes (Johnston et al., 2014). En 1970, se describió por primera vez la competencia artificial de E. coli (Mandel & Higa, 1970). Las células bacterianas fueron tratadas con calcio (𝐶𝑎2+) y expuestas a una temperatura elevada. Desde entonces, este método se convirtió en la base de transformación por choque térmico (Green & Sambrook, 2021). 4.4.2.1 Métodos de transformación El método de transformación que se utiliza depende de la preparación de las células competentes utilizada. La transformación puede ser por choque térmico o electroporación. La elección del método dependerá de la eficiencia de transformación que se quiera alcanzar (Green & Sambrook, 2021). En el choque térmico, las células competentes se mezclan en una solución que incluye el plásmido de interés y se exponen brevemente a una temperatura elevada. El tratamiento catiónico junto con el choque térmico favorece la permeabilidad de la membrana celular haciéndola más apta para integrar material genético extracelular (Sambrook et al., 1989). A pesar de que es un método relativamente simple, el mismo es el más utilizado para la clonación rutinaria (Swords, 2003). Un método alternativo es la electroporación que implica el uso de un electroporador que induce a las células competentes y al ADN a un pulso de campo eléctrico de alto voltaje. Esto permite la formación de poros transitorios en las membranas celulares, lo cual da la entrada al ADN en las células (Lessard, 2013b; Sambrook et al., 1989). Este método presenta una mayor eficiencia en la captación de ADN plasmídico y una producción más rápida de células competentes (Woodall, 2003). 4.4.2.2 Tamizaje Azul Blanco El método de tamizaje más popular en la investigación es el tamizaje azul/blanco usando plásmidos como vectores. La técnica hace uso del funcionamiento del operón lac. Este operón es el sistema más regulado y estudiado en bacterias, siendo ejemplo de cómo los procariotas regulan la expresión de genes la respuesta a las condiciones nutricionales del medio (Meiklejohn & Gralla, 1989). 22 El operón lac codifica para las proteínas encargadas del transporte y metabolismo de lactosa. Está constituido de tres genes estructurales: lacZ, codifica para la enzima degradadora de lactosa -galactosidasa, hidrolizando la lactosa en glucosa y galactosa; lacY, que codifica para la enzima -galactosidasa permeasa, que facilita el transporte de lactosa al interior de la bacteria; y lacA, que codifica para la enzima galactosidasa transacetilasa, sin función claramente descrita (McDonnell et al., 2019). El tamizaje azul/blanco es utilizado en plásmidos vectores que contienen un péptido en un sitio múltiple de clonación (MCS). El funcionamiento se basa en la utilización de un análogo de lactosa, el 5-bromo4-cloro-3-indolil--D-galactósido (X-Gal). Cuando el operón lac es interrumpido por un inserto de ADN en el MCS, la colonia resultante es de color blanco. Esto debido a la ausencia de la enzima -galactosidasa en funcionamiento (Lawrence, 2002). Por otro lado, cuando el inserto no es acoplado correctamente en el MSC, la enzima funciona correctamente hidrolizando al X-Gal, produciendo colonias azules. La inducción del operón lac se puede realizar mediante la adición de isopropilil - D-tiogalactopiranosa (IPTG) en el medio (Sambrook et al., 1989). A pesar de que este método es simple, es posible obtener resultados falsos-positivos, incluyendo la presencia el operón lac intacto sin la síntesis correcta de las enzimas. Por lo tanto, es necesario corroborar el acoplamiento correcto del inserto (orientación y posición) dentro de MCS, esto mediante la secuenciación de fragmentos (Sambrook et al., 1989). Figura 7. Tamizaje azul blanco en cepa E. coli XL1-Blue para la detección de clones de plásmido recombinante. Las colonias azules indican que el inserto no fue acoplado adecuadamente o que no hay inserto. Las colonias blancas indican que el inserto se acopló de forma correcta (Padmanabhan et al., 2011). 23 4.4.3 RNAi 4.4.3.1 Visión biológica del RNAi Desde el descubrimiento del RNAi, la comprensión de la regulación génica ha evolucionado. El RNAi se describió por primera vez como micro ARN (miRNA, por sus siglas en inglés) y fue utilizado para manipular la expresión génica en un nemátodo Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1991; Guo & Kemphues, 1995). Fue hasta 1998, que Fire y colaboradores, demostraron que el dsRNA es efectivo para producir interferencia en un sistema biológico (Fire et al., 1998). El mecanismo mediante el cual el RNAi funciona consiste en dos fases; una fase inicial y otra efectora (Figura 6). En la fase inicial se genera el ARN de interferencia pequeño (siRNA, por sus siglas en inglés). El siRNA es producido mediante el procesamiento de dsRNA por la endonucleasa Dicer-1, este mecanismo fue identificado por primera vez en Drosophila (Jiang et al., 2005). La proteína Dicer ha sido ampliamente estudiada debido a su rol tan importante en el procesamiento de dsRNA; es conocido que es una endorribonucleasa de gran tamaño (Shabalina & Koonin, 2008). La fase inicial finaliza con la unión del siRNA a la proteína Argonauta (Ago2) (MacRae et al., 2008). La fase efectora hace uso del siRNA unido a Ago2. La proteína Ago2 une únicamente una hebra del siRNA, la hebra restante es descartada y degradada inmediatamente. La interacción entre el siRNA y Ago2 ha sido elucidada, mostrando que al asociarla estas dos moléculas, existe una estabilización del sistema de chaperonas, causando el desenrollamiento del siRNA en forma de doble hebra y finalmente la degradación de la hebra pasajera (Iwasaki et al., 2010). Posteriormente, Ago2 cargada, se une a otras proteínas estabilizadoras formando el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC; por sus siglas en inglés). El complejo proteico RISC realiza una vigilancia celular, uniendo ARNm con una hebra complementaria de siRNA cargada a Ago2 (Wilson & Doudna, 2013a). La unión se hace mediante una guía de 2-5 nucleótidos que sirven como secuencia semilla e inician la unión al ARNm diana, causando el silenciamiento. 24 Figura 8. Vías de siRNA y miRNA que inducen el silenciamiento de ARNm de interés mediante el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) (Wilson & Doudna, 2013b). La conservación de este mecanismo de silenciamiento en los organismos eucariotas ha permitido el diseño de estudios funcionales, así como la generación de muchos organismos modelo. Por ejemplo, en C. elegans se ha diseñado librerías in vitro de dsRNA sintético así como de dsRNA expresado en bacterias para el silenciamiento de muchos genes (Gönczy et al., 2000). Muy similar para Drosophila, donde se han realizado muchos experimentos de silenciamiento para generar modelos celulares y organismo in vivo para entender diversos procesos biológicos (Heigwer et al., 2018b). El procesamiento de siRNA mediante RNAi está involucrado en procesos vitales de la célula, crecimiento diferenciación, formación de la heterocromatina y la proliferación celular. Por tanto, 25 una disfunción del RNAi está asociada a trastornos neurológicos, enfermedades cardiovasculares y diferentes tipos de cáncer (Lu et al., 2008). 4.4.3.2 Producción de RNAi Debido a las múltiples aplicaciones del RNAi en las ciencias biológicas, la producción del dsRNA específico para inducir silenciamiento en un gen, es de gran interés para los científicos. Por lo que se buscan implementar técnicas costo-efectivas para su producción. Un método es mediante la síntesis a partir de nucleótidos, este es un enfoque muy reciente y al que se busca implementar de forma estándar en un futuro (Zotti et al., 2018). Otro método es la síntesis in vitro de dsRNA mediante una polimerasa de ARN, ARN dependiente. Para esto se han desarrollado kits muy efectivos de la empresa Thermo Scientific, Megascript™ RNAi Kit. La tercera opción, y la que más ha sido utilizada para la producción de dsRNA a gran escala, es mediante fermentación. En este proceso, el dsRNA es sintetizado mediante células transgénicas. La cepa bacteriana HT115(DE3) de E. coli es la más utilizada para estos fines. Esta cepa presenta una deficiencia de la enzima ARNasa III (Takiff et al., 1989). Por lo tanto, no es capaz de degradar el dsRNA, permitiendo la acumulación en citoplasma. Esta cepa puede expresar el gen de la polimerasa T7 de bacteriófago a partir del promotor inducible del operón lac. Al transformar esta bacteria con un plásmido de expresión que contenga secuencias del promotor T7 (como pCR™2.1- TOPO®), esta cepa puede producir grandes cantidades de dsRNA específica para una secuencia (Verdonckt & Vanden Broeck, 2022). Los métodos de inducción del silenciamiento mediante el dsRNA producido han variado en otros organismos. En Drosophila, los métodos incluyen: obtención de RNAds mediante receptores específicos en líneas celulares, baño de células en alícuotas de dsRNA (Heigwer et al., 2018a), microinyección de dsRNA en embriones, cruces entre líneas conductoras (Gal4) con moscas con expresión de dsRNA (UAS-dsRNA), y moscas con expresión de otras formas de siRNAs (Figura 7) (Heigwer et al., 2018a). 26 Figura 9. Métodos de inducción del silenciamiento en Drosophila melanogaster mediante el dsRNA. A. obtención de dsRNA. A). (A) En las células de Drosophila, los dsRNA (negro) son absorbidos por las células mediante endocitosis. Las moléculas de dsRNA/siRNA son procesadas por las proteínas Dicer-2 y R2D2 (café) en múltiples siRNA monocatenarios. Luego se incorporan en el complejo RISC, junto con Ago2 (verde) y otras proteínas (azul). Por último, se degrada el ARNm diana complementario del siRNA (rojo). (B) El RNAi se puede inducir (B) en un baño con solución acuosa de dsRNA, (C) a través de microinyecciones de dsRNA en embriones, (D) por cruce de transgénicos (Gal4) en líneas de moscas que expresan dsRNA (UAS-dsRNA), o (E) moscas que pueden expresar shRNA (UAS-shRNA) (Heigwer et al., 2018b). 27 5. Marco metodológico 5.1 Objetivo general Generar el plásmido recombinante, pCR2.1-TOPO-Mnn1, con potencial de silenciamiento del gen Mnn1 en individuos adultos de Drosophila melanogaster. 5.2 Objetivos específicos • Comparar la cantidad de ARN extraído de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster en diferentes tiempos de la vida adulta. • Producir ADN complementario (ADNc) a partir de ARN extraído de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster. • Amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el fragmento del gen Mnn1 con la secuencia del promotor T7 añadida en ambos sentidos. • Realizar la inserción del fragmento amplificado mediante PCR en el vector plasmídico pCR™2.1-TOPO® con potencial de silenciamiento del gen Mnn1 en D. melanogaster. 5.3 Enfoque, diseño y tipo de investigación La investigación tiene un enfoque cuantitativo y un diseño experimental de tipo exploratorio. 5.4 Población, muestra y unidad de análisis Los sujetos de estudio fueron individuos silvestres adultos de D. melanogaster cultivados en el laboratorio bajo condiciones estándares. La muestra definida fue de 30-35 moscas adultas machos y 25-30 moscas adultas hembras aproximadamente. En total se trabajó con 12 muestras de machos y hembras. La unidad de análisis fue la cuantificación de material genético de cada muestra por grupo. 5.5 Variables En los siguientes cuadros se describen las variables experimentales controladas por el investigador y las no controladas por el investigador. 28 Cuadro 1. Variables controladas por el investigador. Variable Definición Tipo Unidad de medición Condiciones de almacenamiento de Drosophila melanogaster Condiciones de temperatura y ciclos de luz y oscuridad Cuantitativa °C, horas de luz y de oscuridad Alimentación de la mosca Alimentación dada a las moscas adultas de D. melanogaster Cuantitativo mg de levadura, azúcar, agar y mL de agua Estadio de la mosca Etapa de desarrollo de la mosca Cualitativo Adultos Cantidad de individuos por muestra Cantidad de individuos requeridos para el peso óptimo de extracción de ARN establecido por el fabricante Cuantitativo mg de individuos de mosca Presencia del inserto de interés Presencia del inserto del gen Mnn1 ligado al vector plasmídico Cualitativo Presente/Ausente Cuadro 2. Variables no controladas por el investigador. Variable Definición Tipo Interrelación Eficiencia de amplificación de los oligos diseñados Amplificación del fragmento del gen diana con los oligos diseñados Cuantitativa Interviniente Orientación del inserto en el plásmido recombinante. Posición del inserto en el plásmido con los oligos diseñados Cualitativa Interviniente 5.6 Instrumentos y técnicas Para la recolección de datos se cuantificó las muestras de ARN y ADNc experimental. Además, se amplificó un fragmento del gen Mnn1 mediante la técnica de PCR. Seguidamente se visualizó el producto en geles de agarosa para confirmar su amplificación. 5.7 Estrategia Para la comprobación de la hipótesis se utilizó como estrategia la electroforesis en gel de agarosa. De esta forma fue posible la comparación de tamaño del plásmido pCR™2.1- TOPO® linealizado y el plásmido recombinante pCR2.1-TOPO-Mnn1. 5.8 Alcances y limitaciones El alcance de esta investigación es brindar una herramienta para la elaboración de moscas transgénicas con el silenciamiento del gen Mnn1 mediante el sistema de ARN interferencia (RNAi). Asimismo, presentar a D. melanogaster como un posible modelo de la Neoplasia Endocrina Múltiple de tipo 1 (MEN1). 29 Entre las limitaciones del estudio se encuentra que el número de muestra es bajo, sin embargo, al ser un estudio exploratorio permite contar con datos preliminares para llevar a cabo un estudio a futuro. Otra de las limitaciones es que no fue posible evaluar la orientación del inserto en el plásmido recombinante. Esto puede evaluarse mediante la secuenciación del constructo o con el uso de enzimas de restricción que hacen un corte entre el vector y el inserto para confirmar que el gen fue clonado en la orientación correcta. 5.9 Bioética No se requirió la evaluación por parte del Comité de Bioética de UVG para este estudio. En animales invertebrados como D. melanogaster la aprobación del comité de cuidados y uso de animales de la institución no es necesaria. Cabe resaltar que esta investigación cuenta con la aprobación del Departamento de Bioquímica & Microbiología. 5.10 Estadísticos 1. Tipo de muestreo: la investigación se realizó utilizando un muestreo no probabilístico por cuotas. Las moscas fueron seleccionadas basadas en la cantidad necesaria por muestra, así como aquella de estadio adulto con separación entre machos y hembras. 2. Análisis estadístico: los datos fueron analizados desde un enfoque descriptivo, exploratorio y cuantitativo. 5.11 Materiales y métodos Manejo y mantenimiento de las cepas silvestres de D. melanogaster Las cepas silvestres de D. melanogaster fueron proporcionadas por el Departamento de Bioquímica & Microbiología. Para el mantenimiento de poblaciones grandes de moscas se utilizaron botellas especializadas en D. melanogaster. Para alcanzar una condición óptima de crianza estas fueron almacenadas a temperatura ambiente (entre 22-25°C) con ciclos de luz y oscuridad (12:12 horas). La alimentación de las moscas fue basada en una dieta de levadura (40%), azúcar (50%) y agar (10%) disuelto en agua estéril. También se adicionó metil-4-hidroxibenzoato el cual actuó como conservante alimenticio y antifúngico (Caravaca & Lei, 2016). Cada 20-30 días los individuos adultos fueron transferidos a botellas con medios de cultivo frescos para reducir el crecimiento de microorganismos que pudieran contaminar el medio. Todo el material y equipo utilizado fue tratado con cloro al 10% y esterilizado con autoclave después de su uso. Sexado de moscas de la fruta Para obtener el mayor número de hembras vírgenes, se recolectaron individuos adultos entre 8-12 horas después de la ruptura del puparium. Los individuos fueron anestesiados con frío entre por períodos cortos (8-10 min). Con un estereoscopio las moscas fueron clasificadas entre machos y hembras según la morfología y estructura observada (Mestetskiy et al., 2022). Después, las moscas fueron colocadas en viales con cultivos frescos hasta su experimentación. 30 Extracción y cuantificación de ARN Inicialmente, los materiales fueron tratados con peróxido de hidrógeno (1𝐷465) 3% para inactivar las ARNasas y aumentar la eficiencia de extracción. La extracción de ARN se realizó según el protocolo estándar dado por el fabricante (Promega, 2018c). El total de individuos trabajados por muestra fue de 30mg. Después del aislamiento de ARN, se evaluó su pureza por medio de un NanoDrop ™. Finalmente, el ARN fue almacenado a -80°C hasta su uso. Síntesis de ADNc La cantidad de ARN utilizada para la producción de ADNc fue de 5µg/por reacción, esto basado en las instrucciones del fabricante y en estudios previos (Promega, 2018a; Vidaurre Pinto, 2022). También se evaluó la pureza del ADNc por medio de un NanoDrop ™. Finalmente, fue almacenado a -20°C hasta su uso. Selección de oligos para la amplificación PCR Los oligos para el gen Mnn1 fueron obtenidos de la plataforma SnapDragon de Harvard Medical School (Hu, Comjean, Roesel, et al., 2017). Esta es una herramienta especializada en el diseño de oligos para la generación de ARN doble hebra (dsRNA) en D. melanogaster. Los oligos fueron seleccionados a partir del exón FBtr0110978-5 utilizando los siguientes parámetros: tamaño fuera del objetivo de 19 nucleótidos, rango de tamaño del dsRNA deseado entre 300-600 nucleótidos y una penalización por par de oligos de 1.0. El par de oligos seleccionado fue evaluado para los siguientes criterios: valor positivo ∆G, menor cantidad de formación de homodímeros/heterodímeros, porcentaje GC adecuado, valor negativo ∆H y ∆S, y tamaño de fragmento de entre 300 y 600 pb. Como control interno de la amplificación de ADNc se utilizó el oligo para el gen de Atc5C (actina) (Taracena et al., 2022). La secuencia de los oligos utilizados se muestra en el siguiente cuadro. Cuadro 3. Secuencias de oligos para PCR. Oligos Dirección Secuencia 5´-3´ Tm (C°) GC (%) Tamaño de fragmento (pb) Mnn1 Sentido AACTGGGAAAACCACAGCAC 56 50 562 Antisentido AGATTTCCAGCGTGGCTCTA 56 50 T7_Mnn1 Sentido TAATACGACTCACTATAGGGAACTGGGAAAACCACAGCAC 64.5 45 603 Antisentido TAATACGACTCACTATAGGGAGATTTCCAGCGTGGCTCTA 64.4 45 Act5C Sentido CCATGTACCCAGGTATTGCT 54.4 50 134 Antisentido ATCTGTTGGAAGGTGGACAG 54.5 50 Amplificación del gen Atc5C por PCR Como control endógeno se utilizó el gen Atc5C. A partir del ADNc sintetizado se amplificó el gen de actina con los oligos previamente diseñados por Taracena y colaboradores (2022). Se realizó un PCR siguiendo las indicaciones dadas por el fabricante 31 GoTaq® Flexi DNA Polymerase y el programa del termociclador recomendado por Taracena y colaboradores (2022). Como control negativo se utilizó la mezcla de reacción de PCR. Finalmente, los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa 1.5% teñido con GelRed®® en un transiluminador UV; la escalera de peso molecular fue de 100pb marca Invitrogen™. Una vez confirmada la calidad del ADNc se procedió a amplificar el gen diana. Amplificación del gen Mnn1 por PCR touchdown Para amplificar el gen Mnn1 con la secuencia del promotor T7 incorporada en ambos sentidos se realizó un PCR siguiendo los parámetros estándar dados por el fabricante (Promega, 2018b). La concentración final utilizada fue de 1X para 5X Colorless GoTaq® Flexi Buffer, 2.5mM solución de cloruro de magnesio (𝑀𝑔𝐶𝑙2), mix de nucleótidos 0.2mM, 1.5 mM de oligos T7_Mnn1, 1.25u para la ADN polimerasa y plantilla de ADNc 1.0µg/50µL. Como control negativo se utilizó un tubo con los componentes correspondientes de la mezcla de reacción de PCR. Para aumentar la especificidad del PCR se siguió el protocolo de ciclos térmicos dado por Green (2018). En la fase uno, la temperatura de hibridación utilizada fue entre 5 °C y 10 °C por encima de la temperatura de anillamiento (Tm, por sus siglas en inglés) de los oligos con 15 ciclos; en la fase dos, entre 2 °C y 5 °C por debajo de la Tm de los oligos con 25 ciclos. Finalmente, los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa 1.5% teñido con GelRed®® en un transiluminador UV; la escalera de peso molecular fue de 100pb marca Invitrogen™. Amplificación del gen Mnn1 por PCR anidado Para aumentar la especificidad se realizó un PCR anidado (Green & Sambrook, 2019b). En la primera ronda amplificación se utilizaron los oligos específicos Mnn1. Para ello siguieron los parámetros estándar dados por el fabricante (Promega, 2018b). La concentración final utilizada fue de 1X para 5X Colorless GoTaq® Flexi Buffer, 2.5mM solución de cloruro de magnesio (𝑀𝑔𝐶𝑙2), mix de nucleótidos 0.2mM, 1.5 mM de oligos T7_Mnn1, 1.25u para la ADN polimerasa y plantilla de ADNc 1.0µg/50µL. Se utilizó como control negativo un tubo con los componentes correspondientes de la mezcla de reacción de PCR. Se siguió el protocolo de ciclos térmicos dado por Green (2018). En la fase uno, la temperatura de hibridación utilizada fue entre 5 °C y 10 °C por encima de la temperatura de anillamiento (Tm, por sus siglas en inglés) de los oligos con 15 ciclos; en la fase dos, entre 2 °C y 5 °C por debajo de la Tm de los oligos con 25 ciclos. Los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa 1.5% teñido con GelRed®® en un transiluminador UV; la escalera de peso molecular fue de 100pb marca Invitrogen™. Después de la primera ronda, los productos de PCR amplificados fueron sometidos a un segundo PCR en el cual se utilizaron los oligos específicos T7_Mnn1. Se siguieron los mismos parámetros utilizados para la primera ronda de amplificación. 32 Los productos fueron purificados siguiendo el protocolo de Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System. De esta forma el producto de PCR podría ser ligado a un vector plasmídico con mayor eficiencia. Ligación del fragmento amplificado en el plásmido pCR™2.1-TOPO® El fragmento del gen Mnn1 con secuencias de promotor T7 añadidas en ambos sentidos fue ligado al vector plasmídico pCR™2.1-TOPO® según el protocolo proporcionado por el fabricante (Invitrogen, 2019). Dado que el producto de PCR fue diluido, se realizó una incubación prolongada de aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente para aumentar la especificidad de ligación. La cantidad de productos PCR añadida f1ue de 4.0 µL. El control positivo utilizado fue el vector ligado al inserto PCR control (proporcionado por el fabricante). Mientras que el control negativo fue únicamente el vector. Las reacciones fueron observadas en un gel de agarosa 1.0 % teñido con GelRed®® y revelado en un transiluminador UV. Se utilizó una escalera de peso molecular de aproximadamente 10 kb marca Invitrogen™. Análisis estadístico La significancia de la concentración de ARN extraído de individuos machos y hembras en diferentes etapas de vida adulta de D. melanogaster fue evaluada mediante ANOVA con el software GraphPad Prism versión 8.0.2 para Windows, GraphPad Software, San Diego, California USA, www.graphpad.com http://www.graphpad.com/ 33 6. Resultados 6.1 Comparación de la cantidad de ARN extraído de individuos machos y hembras de D. melanogaster en diferentes tiempos de la vida adulta. El aislamiento de ARN es el primer paso para la generación de un plásmido recombinante con el potencial de silenciamiento de un gen. Por lo que este paso es de gran importancia para el éxito del estudio. El primer objetivo específico fue comparar la cantidad de ARN extraído en individuos machos y hembras de D. melanogaster en diferentes tiempos de la vida adulta. Figura 10. Comparación de la concentración de ARN extraído de individuos machos y hembras en las diferentes etapas adultas, día 3 (n = 4), día 5 (n = 4) y día 10 (n = 4) de D. melanogaster En la Figura 10, se muestra la concentración de ARN aislado en individuos de D. melanogaster en diferentes etapas adultas. Además, se observó en ambos individuos adultos, machos y hembras, una diferencia significativa en la concentración de ARN aislado entre el Día 3 (machos: 548.4 ng/µl ± 171 ng/µl y hembras: 495.1 ng/µl ± 95.4 ng/µl-) y Día 10 (208.1 ng/µl ± 54.9 ng/µl y 211.5 ng/µl ± 42.1 ng/µl, respectivamente) y, 34 entre el Día 5 (542.6 ng/µl ± 113.1 ng/µl y 395.9 ng/µl ± 17.1 ng/µl, respectivamente) y el Día 10. También, se observó una disminución de la concentración de ARN conforme aumenta el número de días de vida; siendo para el Día 5, 1.01 y 1.25 veces menor en machos y hembras respectivamente, en comparación al Día 3; y para Día 10, 2.63 veces y 2.34 veces menor en machos y hembras, respectivamente en comparación al Día 3. Tras la extracción de ARN de las muestras, se evaluó la pureza de este mediante su cuantificación por NanoDrop™. En el Cuadro 4, se observa la concentración y los valores de pureza obtenidos. Cuadro 4. Valores de pureza del ARN extraído de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster mediante el equipo NanoDrop™ Muestra A260/A280 A230/A260 Machos 2.25± 0.0472 2.44± 0.312 Hembras 2.33± 0.333 2.19 ± 0.419 Control 0.400 0.0500 En general, el ARN extraído presenta una pureza de ácidos nucleicos (machos: 2.14- 2.31 y hembras: 2.01-3.34) y contaminantes (machos: 2.1-2.53 y hembras: 1.58-2.83) aceptable con una desviación estándar relativamente baja entre las mediciones tanto en los individuos machos como en hembras. Por lo tanto, el ARN aislado fue óptimo para ser utilizado en procedimientos moleculares posteriores. 6.2 Síntesis exitosa de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN extraído de individuos adultos de D. melanogaster. El segundo objetivo específico planteó sintetizar ADNc a partir del ARN extraído de los individuos adultos de la mosca de la fruta. Para esto se utilizó una cantidad estándar de ARN de 5 µg por reacción. Cuadro 5. Valores de pureza de ADNc de las muestras de machos y hembras de D. melanogaster mediante el equipo NanoDrop™ Muestra Concentración (ng/µL) A260/A280 A230/A260 Machos 899.2±48.3 1.58±0.0383 1.77 ±0.210 Hembras 914.5±35.4 1.59 ±0.0265 1.87 ±0.223 Control 0.700 0.600 0.100 En el Cuadro 5, se observa que la concentración obtenida de ADNc en los individuos machos y hembras tiene una alta variabilidad entre las mediciones por muestra (machos: 820-1013 ng/µL y hembras: 840-963 ng/µL). En cuanto a la pureza de ácidos nucleicos esta se encuentra ligeramente por debajo de lo óptimo (machos:1.53-1.67 y hembras: 1.55- 1.62). Asimismo, muestra una baja variabilidad. 35 6.3 Amplificación exitosa del gen Mnn1 con secuencias del promotor T7 incorporadas en individuos macho y hembra de D. melanogaster. La calidad del ADNc sintetizado fue evaluada mediante la amplificación de un gen control, como Act5C de actina. En la Figura 11 se observa la amplificación exitosa del gen de actina. Es posible identificar fragmentos bien definidos de aproximadamente 134 pares de bases (pb). Sin embargo, es posible observar la presencia de dímeros formados durante el proceso de amplificación. Figura 11. Amplificación de productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen Act5C a partir de ADNc de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster. Condiciones trabajadas en la electroforesis: gel de agarosa 1.5% (p/v) teñido con GelRed® (1:10,000) en tampón de corrida TBE 1X a 100V durante 20 minutos; escalera de peso molecular de ADN 100pb marca Invitrogen™. Una vez amplificado dicho gen control, se prosiguió con la amplificación del fragmento del gen diana, Mnn1. A partir del ADNc obtenido, se realizó un PCR convencional con los oligos T7_Mnn1 los cuales incluyen las secuencias del promotor T7 en ambos sentidos. En la Figura 12 es posible observar la amplificación exitosa del fragmento para las muestras de machos y hembras. El producto tiene un tamaño aproximado de 603 pb, siendo correspondiente con el tamaño esperado del fragmento. A pesar de que se alcanzó la exitosa amplificación del gen diana en el experimento, no fue posible replicarlo nuevamente bajo las mismas condiciones empleadas en el PCR. Por lo tanto, fue necesario un cambio de estrategia para la amplificación de dicho gen diana. 36 Figura 12. Amplificación de fragmento del gen Mnn1 con secuencia de promotor T7 añadidas a partir de ADNc de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster. Condiciones trabajadas en la electroforesis: gel de agarosa 1.5% (p/v) teñido c on GelRed® (1:10,000) en tampón de corrida TBE 1X a 100V durante 20 minutos; escalera de peso molecular de ADN 100pb marca Invitrogen™. Esta nueva estrategia consistió en dos rondas de amplificación. En la primera ronda se amplificó el fragmento del gen Mnn1 sin las secuencias del promotor T7. Para ello, se utilizó el set de oligos específico para el gen (Mnn1). En la Figura 13 se observa la amplificación exitosa del fragmento en dos muestras de machos y hembras. Este cuenta con un tamaño aproximado de 562 pb, correspondiente a lo esperado. 37 Figura 13. Primera ronda de amplificación de fragmento del gen Mnn1 a partir de ADNc de individuos adultos machos y hembras de D. melanogaster. Condiciones trabajadas en la electroforesis: gel de agarosa 1.5% (p/v) teñido con GelRed® (1:10,000) en tampón de corrida TBE 1X a 100V durante 20 minutos; escalera de peso molecular de ADN 100pb marca Invitrogen™. En la segunda ronda se utilizó como plantilla el producto de PCR amplificado en la primera ronda. Para ello, se utilizó nuevamente el set de oligos T7_Mnn1 que incluyen la secuencia del promotor T7 en ambos sentidos. Cabe resaltar que este set de oligos es el mismo que se utilizó en la estrategia anterior (Figura 12). Esto fue realizado con el fin de aumentar la especificidad de amplificación del fragmento del gen. En la Figura 14, se muestra la amplificación exitosa del fragmento del gen con las secuencias de promotor T7 añadidas. Este muestra un tamaño aproximado de 603 pb para la muestra de machos y