UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias y Humanidades Optimización de la producción de carbonato de calcio por tres cepas del género Lysinibacillus, aisladas del suelo de una cantera, para la formación de bioconcreto. Trabajo de graduación en modalidad de Tesis presentado por Ana Marcela Morales Valenzuela para optar al grado académico de Licenciado en Bioquímica y Microbiología Guatemala, 2021 UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias y Humanidades Optimización de la producción de carbonato de calcio por tres cepas del género Lysinibacillus, aisladas del suelo de una cantera, para la formación de bioconcreto. Trabajo de graduación en modalidad de Tesis presentado por Ana Marcela Morales Valenzuela para optar al grado académico de Licenciado en Bioquímica y Microbiología Guatemala, 2021 Prefacio El presente trabajo de graduación es parte de un proyecto en conjunto del Centro de Estudios en Biotecnología CEB de la Universidad del Valle de Guatemala con Cementos Progreso. Esta tesis es la continuación de un proyecto que combina la investigación académica con la iniciativa en la industria privada, para el desarrollo de bioconcreto en Guatemala. Esta tesis me permitió combinar trabajo en laboratorio con su aplicación industrial, y observar cómo esta transferencia de tecnología y colaboración de distintas áreas de las ciencias pueden resultar en un proyecto exitoso. Me gustaría dar las gracias a mi asesor, Julio Matute por su excelente orientación y soporte durante todo el proceso de realización de mi trabajo. También me gustaría agradecer a la Doctora Pamela Pennington por su apoyo y orientación durante la realización de este trabajo. Me gustaría agradecer a mis abuelos, quienes apoyaron tanto emocionalmente como financieramente este año de estudio en Bioquímica y Microbiología, lo que me permitió llevar a finalización esta tesis y este proyecto personal llamado doble titulación. Me permito dar un agradecimiento especial a mi familia, en especial a mis padres, por su acompañamiento en la realización de este trabajo, por acompañarme y motivarme durante el tiempo que dediqué a realizarlo y por su confianza en esta tesis y en mí. iii Índice Prefacio iii Lista de figuras xii Lista de cuadros xiv Resumen xv Abstract xvi 1. Introducción 1 2. Objetivos 2 2.1. Objetivo general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2.2. Objetivos específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3. Justificación 3 4. Marco teórico 4 4.1. Biomineralización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4.1.1. Mecanismos de biomineralización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4.2. Precipitación de calcita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 4.3. Bioconcreto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 4.4. Producción de calcita mediante hidrólisis de urea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 4.5. Género Lysinibacillus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4.6. Crecimiento bacteriano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4.6.1. Curva de crecimiento bacteriano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4.6.2. Esporulación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 4.6.3. Medio de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 4.7. Microestructura de bioconcreto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 4.7.1. Microscopía electrónica de barrido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 4.7.2. Cristalografía de rayos X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 5. Metodología 13 5.1. Sitio de estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 5.2. Sujetos de estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 5.3. Enfoque, diseño y tipo de investigación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 5.4. Tipo y tamaño de muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 iv 5.5. Estudios previos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 5.6. Criterios de inclusión y exclusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 5.7. Variables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 5.8. Hipótesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 5.9. Viabilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 5.10. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 6. Resultados 22 6.1. Identificación de la cepa bacteriana con mayor producción de carbonato de calcio . . 22 6.2. Producción y recuperación de esporas de las cepas bacterianas que se aislaron del suelo de la planta cementera de Sanarate, El Progreso . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 6.3. Optimización de la producción de carbonato de calcio de las cepas bacterianas que se aislaron del suelo de la planta cementera de Sanarate, El Progreso . . . . . . . . . . 25 6.3.1. Ensayo de reparación de grietas en cubos de concreto . . . . . . . . . . . . . 26 6.3.2. Ensayo de resistencia a compresión de los cubos de concreto . . . . . . . . . 28 6.3.3. Ensayo de porcentaje de carbonato de calcio calculado a partir de difracción de rayos X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 6.3.4. Ensayo de microscopía electrónica de barrido de las grietas en cubos de concreto 36 6.3.5. Ensayo en laboratorio de titulación para suplementación de medios de preci- pitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 6.3.6. Índice para optimización de la producción de calcita . . . . . . . . . . . . . . 42 7. Análisis de resultados 44 8. Conclusiones 48 9. Recomendaciones 49 10.Bibliografía 50 Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 11.Anexos 53 v Lista de figuras 1. Tipos de polimorfismos de carbonato de calcio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2. Hidrólisis de urea para producción de carbonato de calcio. . . . . . . . . . . . . . . . 7 3. Esquema de curva de crecimiento bacteriano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 4. Calcita en microscopio electrónico de barrido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 5. Espectrograma de calcita con cristalografía de rayos X . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 6. Metodología a llevar a cabo este estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 7. Gel de electroforesis para perfil plasmídico de las cepas del estudio. . . . . . . . . . 23 8. Comparación de curvas de crecimiento bacteriano de las cepas en el estudio . . . . . 24 9. Porcentaje de reparación de grietas de cubos de concreto con distintos tratamientos. 27 10. Resistencia a compresión de cubos de concreto al día 28 . . . . . . . . . . . . . . . . 29 11. Porcentajes de carbonato de calcio obtenidos mediante difracción de rayos X. . . . . 33 12. Concentración de carbonato de calcio titulada en los tratamientos con la cepa P.4.1.A 39 13. Concentración de carbonato de calcio titulada en los tratamientos con la cepa P.5.2.A 39 14. Concentración de carbonato de calcio titulada en los tratamientos con la cepa P. 5.3.A 40 15. Concentración de carbonato de calcio titulada en los tratamientos con el medio de precipitación LUC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 16. Concentración de carbonato de calcio titulada en los tratamientos con el medio de precipitación TSUC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 17. Grieta A del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 63 18. Grieta A del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 63 19. Grieta A del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 63 20. Grieta B del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 63 21. Grieta B del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 63 22. Grieta B del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 63 23. Grieta C del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 63 24. Grieta C del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 63 25. Grieta C del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 63 26. Grieta A del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 63 27. Grieta A del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 64 28. Grieta A del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 64 29. Grieta B del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 64 30. Grieta B del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 64 31. Grieta B del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 64 32. Grieta C del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 64 33. Grieta C del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 64 34. Grieta C del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 64 35. Grieta A del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 64 vi 36. Grieta A del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 64 37. Grieta A del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 65 38. Grieta B del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 65 39. Grieta B del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 65 40. Grieta B del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 65 41. Grieta C del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 65 42. Grieta C del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 65 43. Grieta C del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 65 44. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 65 45. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 65 46. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 65 47. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 66 48. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 66 49. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 66 50. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 66 51. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 66 52. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 66 53. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 66 54. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 66 55. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 66 56. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 66 57. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 67 58. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 67 59. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 67 60. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 67 61. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 67 62. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 67 63. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 67 64. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 67 65. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 67 66. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 67 67. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 68 68. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 68 69. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 68 70. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 68 71. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 68 72. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 68 73. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 68 74. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 68 75. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 68 76. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 68 77. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 69 78. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 69 79. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 69 80. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 69 81. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 69 82. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 69 83. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 69 84. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 69 85. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 69 86. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 69 87. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 70 88. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 70 89. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 70 vii 90. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 70 91. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 70 92. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 70 93. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 70 94. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 70 95. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . 70 96. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . 70 97. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . 71 98. Grieta A del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 71 99. Grieta A del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 71 100. Grieta A del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 71 101. Grieta B del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 71 102. Grieta B del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 71 103. Grieta B del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 71 104. Grieta C del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 71 105. Grieta C del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 71 106. Grieta C del cubo 1 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 71 107. Grieta A del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 72 108. Grieta A del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 72 109. Grieta A del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 72 110. Grieta B del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 72 111. Grieta B del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 72 112. Grieta B del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 72 113. Grieta C del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 72 114. Grieta C del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 72 115. Grieta C del cubo 2 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 72 116. Grieta A del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 72 117. Grieta A del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 73 118. Grieta A del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 73 119. Grieta B del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 73 120. Grieta B del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 73 121. Grieta B del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 73 122. Grieta C del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 73 123. Grieta C del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 73 124. Grieta C del cubo 3 de cepa P.4.1.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 73 125. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 73 126. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 73 127. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 74 128. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 74 129. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 74 130. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 74 131. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 74 132. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 74 133. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 74 134. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 74 135. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 74 136. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 74 137. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 75 138. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 75 139. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 75 140. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 75 141. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 75 142. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 75 143. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 75 viii 144. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 75 145. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 75 146. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 75 147. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 76 148. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 76 149. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 76 150. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 76 151. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.2.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 76 152. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 76 153. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 76 154. Grieta A del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 76 155. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 76 156. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 76 157. Grieta B del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 77 158. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 77 159. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 77 160. Grieta C del cubo 1 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 77 161. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 77 162. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 77 163. Grieta A del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 77 164. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 77 165. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 77 166. Grieta B del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 77 167. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 78 168. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 78 169. Grieta C del cubo 2 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 78 170. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 78 171. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 78 172. Grieta A del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 78 173. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 78 174. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 78 175. Grieta B del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 78 176. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . 78 177. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 18 . . . 79 178. Grieta C del cubo 3 de cepa P.5.3.A con medio de precipitación LUC el día 30 . . . 79 179. Grieta A del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . . . . . 79 180. Grieta A del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . . . . . 79 181. Grieta A del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . . . . . 79 182. Grieta B del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . . . . . 79 183. Grieta B del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . . . . . 79 184. Grieta B del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . . . . . 79 185. Grieta C del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . . . . . 79 186. Grieta C del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . . . . . 79 187. Grieta C del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . . . . . 80 188. Grieta A del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . . . . . 80 189. Grieta A del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . . . . . 80 190. Grieta A del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . . . . . 80 191. Grieta B del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . . . . . 80 192. Grieta B del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . . . . . 80 193. Grieta B del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . . . . . 80 194. Grieta C del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . . . . . 80 195. Grieta C del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . . . . . 80 196. Grieta C del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . . . . . 80 197. Grieta A del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . . . . . 81 ix 198. Grieta A del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . . . . . 81 199. Grieta A del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . . . . . 81 200. Grieta B del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . . . . . 81 201. Grieta B del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . . . . . 81 202. Grieta B del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . . . . . 81 203. Grieta C del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación TSUC . . . . . . . . . . . . 81 204. Grieta C del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 18 . . . . . . . 81 205. Grieta C del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación TSUC el día 30 . . . . . . . 81 206. Grieta A del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . . . . . 81 207. Grieta A del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 18 . . . . . . . . 82 208. Grieta A del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 30 . . . . . . . . 82 209. Grieta B del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . . . . . 82 210. Grieta B del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 18 . . . . . . . . 82 211. Grieta B del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 30 . . . . . . . . 82 212. Grieta C del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . . . . . 82 213. Grieta C del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 18 . . . . . . . . 82 214. Grieta C del cubo 1 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 30 . . . . . . . . 82 215. Grieta A del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . . . . . 82 216. Grieta A del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 18 . . . . . . . . 82 217. Grieta A del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 30 . . . . . . . . 83 218. Grieta B del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . . . . . 83 219. Grieta B del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 18 . . . . . . . . 83 220. Grieta B del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 30 . . . . . . . . 83 221. Grieta C del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . . . . . 83 222. Grieta C del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 18 . . . . . . . . 83 223. Grieta C del cubo 2 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 30 . . . . . . . . 83 224. Grieta A del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . . . . . 83 225. Grieta A del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 18 . . . . . . . . 83 226. Grieta A del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 30 . . . . . . . . 83 227. Grieta B del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . . . . . 84 228. Grieta B del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 18 . . . . . . . . 84 229. Grieta B del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 30 . . . . . . . . 84 230. Grieta C del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación LUC . . . . . . . . . . . . . 84 231. Grieta C del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 18 . . . . . . . . 84 232. Grieta C del cubo 3 sin cepa con medio de precipitación LUC el día 30 . . . . . . . . 84 233. Grieta A del cubo 1 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 84 234. Grieta A del cubo 1 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 84 235. Grieta A del cubo 1 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 84 236. Grieta B del cubo 1 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 84 237. Grieta B del cubo 1 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 85 238. Grieta B del cubo 1 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 85 239. Grieta C del cubo 1 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 85 240. Grieta C del cubo 1 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 85 241. Grieta A del cubo 2 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 85 242. Grieta A del cubo 2 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 85 243. Grieta A del cubo 2 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 85 244. Grieta B del cubo 2 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 85 245. Grieta B del cubo 2 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 85 246. Grieta B del cubo 2 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 85 247. Grieta C del cubo 2 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 86 248. Grieta C del cubo 2 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 86 249. Grieta C del cubo 2 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 86 250. Grieta A del cubo 3 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 86 251. Grieta A del cubo 3 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 86 x 252. Grieta A del cubo 3 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 86 253. Grieta B del cubo 3 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 86 254. Grieta B del cubo 3 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 86 255. Grieta B del cubo 3 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 86 256. Grieta C del cubo 3 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 86 257. Grieta C del cubo 3 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 87 258. Grieta C del cubo 3 cepa P.4.1.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 87 259. Grieta A del cubo 1 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 87 260. Grieta A del cubo 1 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 87 261. Grieta A del cubo 1 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 87 262. Grieta B del cubo 1 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 87 263. Grieta B del cubo 1 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 87 264. Grieta B del cubo 1 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 87 265. Grieta C del cubo 1 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 87 266. Grieta C del cubo 1 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 87 267. Grieta C del cubo 1 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 88 268. Grieta A del cubo 2 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 88 269. Grieta A del cubo 2 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 88 270. Grieta A del cubo 2 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 88 271. Grieta B del cubo 2 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 88 272. Grieta B del cubo 2 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 88 273. Grieta B del cubo 2 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 88 274. Grieta C del cubo 2 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 88 275. Grieta C del cubo 2 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 88 276. Grieta C del cubo 2 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 88 277. Grieta A del cubo 3 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 89 278. Grieta A del cubo 3 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 89 279. Grieta A del cubo 3 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 89 280. Grieta B del cubo 3 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 89 281. Grieta B del cubo 3 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 89 282. Grieta B del cubo 3 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 89 283. Grieta C del cubo 3 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 89 284. Grieta C del cubo 3 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 89 285. Grieta C del cubo 3 cepa P.5.2.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 89 286. Grieta A del cubo 1 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 89 287. Grieta A del cubo 1 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 90 288. Grieta A del cubo 1 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 90 289. Grieta B del cubo 1 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 90 290. Grieta B del cubo 1 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 90 291. Grieta B del cubo 1 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 90 292. Grieta C del cubo 1 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 90 293. Grieta C del cubo 1 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 90 294. Grieta C del cubo 1 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 90 295. Grieta A del cubo 2 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 90 296. Grieta A del cubo 2 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 90 297. Grieta A del cubo 2 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 91 298. Grieta B del cubo 2 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 91 299. Grieta B del cubo 2 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 91 300. Grieta B del cubo 2 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 91 301. Grieta C del cubo 2 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 91 302. Grieta C del cubo 2 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 91 303. Grieta C del cubo 2 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 91 304. Grieta A del cubo 3 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 91 305. Grieta A del cubo 3 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 91 xi 306. Grieta A del cubo 3 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 91 307. Grieta B del cubo 3 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 92 308. Grieta B del cubo 3 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 92 309. Grieta B del cubo 3 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 92 310. Grieta C del cubo 3 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . . 92 311. Grieta C del cubo 3 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 18 . . . . . . . . . 92 312. Grieta C del cubo 3 cepa P.5.3.A sin medio de precipitación el día 30 . . . . . . . . . 92 313. Grieta A del cubo 1 control sin cepa ni medio de precipitación . . . . . . . . . . . . 92 314. Grieta A del cubo 1 control sin cepa ni medio de precipitación el día 18 . . . . . . . 92 315. Grieta A del cubo 1 control sin cepa ni medio de precipitación el día 30 . . . . . . . 92 316. Grieta B del cubo 1 control sin cepa ni medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . 92 317. Grieta B del cubo 1 control sin cepa ni medio de precipitación el día 18 . . . . . . . 93 318. Grieta B del cubo 1 control sin cepa ni medio de precipitación el día 30 . . . . . . . 93 319. Grieta C del cubo 1 control sin cepa ni medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . 93 320. Grieta C del cubo 1 control sin cepa ni medio de precipitación el día 18 . . . . . . . 93 321. Grieta A del cubo 2 control sin cepa ni medio de precipitación . . . . . . . . . . . . 93 322. Grieta A del cubo 2 control sin cepa ni medio de precipitación el día 18 . . . . . . . 93 323. Grieta A del cubo 2 control sin cepa ni medio de precipitación el día 30 . . . . . . . 93 324. Grieta B del cubo 2 control sin cepa ni medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . 93 325. Grieta B del cubo 2 control sin cepa ni medio de precipitación el día 18 . . . . . . . 93 326. Grieta B del cubo 2 control sin cepa ni medio de precipitación el día 30 . . . . . . . 93 327. Grieta C del cubo 2 control sin cepa ni medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . 94 328. Grieta C del cubo 2 control sin cepa ni medio de precipitación el día 18 . . . . . . . 94 329. Grieta C del cubo 2 control sin cepa ni medio de precipitación el día 30 . . . . . . . 94 330. Grieta A del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación . . . . . . . . . . . . 94 331. Grieta A del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación el día 18 . . . . . . . 94 332. Grieta A del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación el día 30 . . . . . . . 94 333. Grieta B del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . 94 334. Grieta B del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación el día 18 . . . . . . . 94 335. Grieta B del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación el día 30 . . . . . . . 94 336. Grieta B del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . 94 337. Grieta B del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación el día 18 . . . . . . . 95 338. Grieta B del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación el día 30 . . . . . . . 95 339. Grieta C del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación . . . . . . . . . . . . . 95 340. Grieta C del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación el día 18 . . . . . . . 95 341. Grieta C del cubo 3 control sin cepa ni medio de precipitación el día 30 . . . . . . . 95 342. Imagen SEM para grieta representativa de biocemento medio TSUC cepa P.4.1.A y espectros de fluorescencia representativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 343. Imagen SEM para grieta representativa de biocemento medio TSUC cepa P.5.2.A y espectros de fluorescencia representativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 344. Imagen SEM para grieta representativa de biocemento medio TSUC cepa P.5.3.A y espectros de fluorescencia representativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 345. Imagen SEM para grieta representativa de biocemento medio LUC cepa P.4.1.A y espectros de fluorescencia representativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 346. Imagen SEM para grieta representativa de biocemento medio LUC cepa P.5.2.A y espectros de fluorescencia representativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 347. Imagen SEM para grieta representativa de biocemento medio LUC cepa P.5.3.A y espectros de fluorescencia representativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 xii Lista de cuadros 1. Variables para la producción y recuperación de esporas de las cepas bacterianas que se aislaron del suelo de la planta cementera de Sanarate, El Progreso. . . . . . . . . 15 2. Variables para la optimización de la producción de carbonato de calcio de las cepas bacterianas que se aislaron del suelo de la planta cementera de Sanarate, El Progreso 15 3. Resultados de las pruebas bioquímicas realizadas a las cepas del estudio para su identificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 4. Cinética del crecimiento bacteriano de las cepas en el estudio . . . . . . . . . . . . . 24 5. Recuperación de esporas bacterianas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 6. Medias de porcentajes de reparación de grietas de las cepas bacterianas. . . . . . . . 26 7. Comparación estadística de reparación de grietas de cada cepa según cada medio de precipitación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 8. Comparación estadística de reparación de grietas de cada medio de precipitación según cada cepa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 9. Comparación estadística de reparación de grietas de cada medio de precipitación con cada cepa en pares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 10. Medias de resistencia a compresión de cubos de concreto bajo distintos tratamientos 29 11. Comparación estadística de resistencia a compresión de cada cepa según cada medio de precipitación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 12. Comparación estadística de resistencia a compresión de cada medio de precipitación según cada distinta cepa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 13. Medias de porcentajes de carbonato de calcio obtenidos por difracción de rayos X . 32 14. Comparación estadística de porcentaje de carbonato de calcio de cada cepa según cada medio de precipitación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 15. Comparación estadística de porcentaje de carbonato de calcio de cada medio de pre- cipitación según cada distinta cepa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 16. Cantidad de cristales de calcita localizados en SEM bajo distintos tratamientos. . . . 36 17. Medias de controles en ensayo de titulación para concentración de carbonato de calcio en medios de precipitación con suplementación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 18. Medias de tratamientos en ensayo de titulación para concentración de carbonato de calcio en medios de precipitación con suplementación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 19. Comparación estadística de porcentaje de carbonato de calcio de cada cepa según cada medio de precipitación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 20. Comparación estadística de porcentaje de carbonato de calcio de cada medio de pre- cipitación según cada distinta cepa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 21. Índice para optimización de producción de calcita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 22. Resultados prueba de concepto en cubos de concreto en seco. . . . . . . . . . . . . . 43 23. Lecturas de densidad óptica para las curvas de crecimiento para la cepa P.4.1.A . . 53 xiii 24. Lecturas de densidad óptica para las curvas de crecimiento para la cepa P.5.2.A . . 53 25. Lecturas de densidad óptica para las curvas de crecimiento para la cepa P.5.3.A . . 54 26. Conteos de las curvas de crecimiento para la cepa P.4.1.A . . . . . . . . . . . . . . . 55 27. Conteos de las curvas de crecimiento para la cepa P.5.2.A . . . . . . . . . . . . . . . 56 28. Conteos de las curvas de crecimiento para la cepa P.5.3.A . . . . . . . . . . . . . . . 57 29. Datos originales para recuperación de biomasa con el método propuesto . . . . . . . 57 30. Monitoreo de reparación de grietas para todas las cepas con medio TSUC . . . . . . 58 31. Monitoreo de reparación de grietas para todas las cepas con medio LUC . . . . . . . 59 32. Monitoreo de reparación de grietas para todas las cepas sin medio . . . . . . . . . . 60 33. Datos originales de resistencia a compresión para medios TSUC, LUC y control a diferentes edades de curado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 34. Datos originales de cristalografía de rayos x para cuantificar calcita en las muestras de biocemento con medios TSUC, LUC y controles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 xiv Resumen El concreto es un material esencial en la construcción, pero con el paso del tiempo sufre de fractu- ras que comprometen su resistencia y durabilidad. Para la reparación de las grietas es posible utilizar microorganismos biomineralizadores del género Lysinibacillus, aislados del suelo de una planta de producción de cemento en un estudio previo. El presente estudio utilizó pruebas de microbiología como batería bioquímica y perfil plasmídico para la caracterización de tres cepas de Lysinibacillus. Además se estudió el crecimiento y esporulación de las tres cepas mediante una curva de crecimien- to, choque térmico y floculación. Finalmente se analizó cómo las esporas de estas cepas mejoran la resistencia y permiten el sellado de grietas, en cubos de concreto utilizando dos distintos medios de precipitación (LUC y TSUC). Se realizaron pruebas de estereoscopía para llenado de grietas, re- sistencia a compresión, cristalografía de rayos X, microscopía electrónica de barrido y titulación de carbonato de calcio. Se observa que la combinación de la cepa P.4.1.A con el medio de precipitación LUC tiene la mayor cantidad de carbonato de calcio por cubo de concreto. La cepa P.5.3.A con el medio de precipitación LUC tiene el mayor porcentaje de rellenado de grietas y mayor resistencia a compresión. Se concluye que la combinación recomendada para aplicación industrial es la cepa P.5.3.A con el medio de precipitación LUC. xv Abstract Concrete is an essential material in construction, but over time it suffers from fractures that compromise its strength and durability. For the repair of cracks, it is possible to use biomineralizing microorganisms of the genus Lysinibacillus, isolated from the soil of a cement production plant in a previous study. The present study used microbiology tests such as biochemical battery and plasmid profile for the characterization of three strains of textit Lysinibacillus. In addition, the growth and sporulation of the three strains were studied by means of a growth curve, heat shock and flocculation. Finally, it was analyzed how the spores of these strains improve resistance and allow the sealing of cracks, in concrete cubes using two different means of precipitation (LUC and TSUC). Stereoscopic tests were performed for crack filling, compressive strength, X-ray crystallography, scanning electron microscopy, and calcium carbonate titration. It is observed that the combination of the P.4.1.A strain with the LUC precipitation medium has the highest amount of calcium carbonate per concrete cube. The P.5.3.A strain with the LUC precipitation medium has the highest percentage of crack filling and the highest resistance to compression. It is concluded that the recommended combination for industrial application is the P.5.3.A strain with the LUC precipitation medium. xvi CAPÍTULO 1 Introducción Existen dos materiales esenciales para la industria de construcción debido a su amplio uso: el concreto y el acero. El concreto es una mezcla de cemento, agua y diversos minerales. El cemento se compone de calcita (en forma de piedra caliza) y arcillas calcinadas (Neville y Brooks, 1987). Debido al desgaste con el tiempo; contacto con sustancias corrosivas; y debido a movimientos telúricos, el concreto llega a sufrir fracturas. Estas grietas comprometen la dureza y resistencia de la estructura de concreto y permiten el paso del agua, la cual corroe la estructura de acero que da soporte al concreto. La reparación y restauración del concreto conlleva una serie de gastos, usuales en la industria, y el uso de lechada química. La lechada química incluye silicato de sodio, hidróxido de calcio, acrilatos y acrilamidas, que son compuestos tóxicos y dañinos para el ambiente (Seifan, Samani, y Berenjian, 2016). La biomineralización representa una alternativa biotecnológica para la reparación de las grietas en concreto. Los microorganismos biomineralizadores, como los del género Lysinibacillus, son capaces de producir carbonato de calcio en forma de calcita. La acumulación de este mineral, al entrar en contacto con el agua que penetra por las grietas, permite sellar estas fisuras, alargando la vida útil de la estructura y restableciendo la dureza y resistencia del material (Stabnikov, Jian, Ivanov, y Li, 2013; Anbu, Kang, Shin, y So, 2016). Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue evaluar la optimización de producción de carbonato de calcio en tres cepas del género Lysinibacillus para facilitar su aplicación a nivel industrial en la producción de bioconcreto. Esta optimización permitió establecer un precedente para futuras investigaciones cuyo objetivo sea la aplicación del proceso de curación del concreto utilizando bacterias biomineralizadoras. 1 CAPÍTULO 2 Objetivos 2.1. Objetivo general Optimizar la producción de carbonato de calcio en cubos de concreto por tres cepas del género Lysinibacillus, aisladas de una cantera cementera, para facilitar su aplicación a nivel industrial en la formación de bioconcreto. 2.2. Objetivos específicos Caracterizar las cepas bacterianas, mediante batería bioquímica, para poder depositarlas en un repositorio. Optimizar la producción y recuperación de esporas bacterianas de cada cepa según sus curvas de crecimiento en tripticasa soya, en escala menor a un litro. Comparar, por medio de titulación y análisis de imagen estereoscópica la cantidad y tasa de cristalización del carbonato de calcio producido por las cepas bacterianas, en medio Tripticasa soya con urea y cloruro de calcio (TSUC) y sustrato con urea y cloruro de calcio (LUC), con distintos cofactores (Hidróxido de bario, citrato de calcio y sulfato de níquel). Comparar por difracción de rayos X y microscopía electrónica de barrido, la identidad y calidad de los cristales de carbonato de calcio producidos en cubos de concreto por las cepas bacterianas en TSUC y LUC. 2 CAPÍTULO 3 Justificación La biotecnología es definida por la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE) como: “La aplicación de la ciencia y la tecnología a los organismos vivos. . . , con el fin de producir conocimientos, bienes o servicios” (OECD, 2005). La biomineralización es una alternativa biotecnológica para la industria de construcción al utilizar el metabolismo de microorganismos para la producción de calcita. Las grietas que se forman en el concreto con el paso del tiempo conlle- van un alto costo de reparación, implican lechada química, con compuestos altamente tóxicos. La producción de calcita por microorganismos biomineralizadores, permite sellar estas grietas de una forma sostenible y económicamente rentable. Para llevar la biomineralización del laboratorio a la industria, es necesario optimizar el proceso metabólico de producción de calcita. Para ello se puede realizar modificaciones genéticas sobre el microorganismo de interés o bien, modificar el ambiente del microorganismo. El adaptar el medio de cultivo para las necesidades especiales del microorganismo para la producción de calcita lleva a un aumento de la cantidad de carbonato de calcio como una alternativa a la modificación genética del mismo. También es necesario realizar pruebas piloto a escala laboratorio en cubos de concreto, para optimizar los procesos para la aplicación industrial de los microorganismos. 3 CAPÍTULO 4 Marco teórico 4.1. Biomineralización La biomineralización es un proceso metabólico que lleva a la precipitación de minerales al com- binar materia orgánica e inorgánica. Los microorganismos realizan este proceso para formar tejidos resistentes para su protección y soporte. El término biomineralización se vio por primera vez en 1924, en el libro publicado por W. J. Schmidt sobre el tema. Actualmente, se conocen 62 minerales diferentes, de distintos cationes, que pueden ser producidos (Evans, 2019; Weiner y Dove, 2003). La biomineralización se lleva a cabo en cinco fases: empezando con la delimitación del espacio celular para poder llevar a cabo el procedimiento de nucleación, seguido de la formación de la matriz, la supersaturación de iones, el control de la nucleación y termina con la detención del proceso. La detención del proceso de biomineralización ocurre cuando se alcanza el límite del espacio delimitado (Y. Chen y cols., 2019; Weiner y Dove, 2003; Achal, Mukherjee, Kumari, y Zhang, 2015). 4.1.1. Mecanismos de biomineralización La biomineralización puede llevarse a cabo en tres mecanismos: mineralización controlada bioló- gicamente (BCM por sus siglas en inglés); mineralización inducida biológicamente (BIM); y minera- lización mediada biológicamente (BMM) (Castro-Alonso y cols., 2019). El mecanismo de la BCM puede ser intracelular, extracelular o intercelular. Este proceso se logra con la comunicación intercelular utilizando macromoléculas de exopolisacáridos. En este mecanismo, el organismo controla la nucleación, la composición, la localización y la morfología de los cristales producidos con su actividad metabólica. Un ejemplo es la formación de huesos en mamíferos (Castro- Alonso y cols., 2019). En la BMM, no se utiliza actividad biológica intracelular o extracelular. La formación de mine- rales se da gracias a la interacción de matrices orgánicas con compuestos orgánicos e inorgánicos. Un ejemplo de BMM es la formación de cristales en la matriz extracelular sin necesidad de acti- vidad biológica directa, pero la cristalización ocurre gracias a la presencia de materia orgánica en la superficie celular. En la BIM, la actividad celular es limitada en la nucleación o localización y el microorganismo controla la formación del mineral a partir de vesículas o matrices orgánicas. Los cristales BIM se generalizan por una baja cristalinidad y un amplio rango de tamaños y morfologías. 4 En este mecanismo la precipitación es indirecta y ocurre por la interacción de iones en el medio ambiente con subproductos del metabolismo del microorganismo (Castro-Alonso y cols., 2019). Algunos ejemplos de biomineralización es la formación de huesos en mamíferos, que ocurre me- diante BCM, la formación de estromatolitos calcáreos y esteras microbianas que ocurre a través de BIM y la a formación de cristales en la matriz extracelular sin necesidad de actividad biológica directa mediante BMM (Castro-Alonso y cols., 2019). 4.2. Precipitación de calcita El proceso de biomineralización para la precipitación de carbonato de calcio puede dar como resultado ocho diferentes polimorfos, siendo los tres mayoritarios la calcita, aragonito y vaterita. Las estructuras de estos polimorfos pueden ser diferenciadas mediante microscopía electrónica de barrido, como se observa en la Figura 1. El polimorfo más estable es la calcita, debido a su estructura cuboidea rectangular. La calcita, combinada con el aragonito y dolomita, conforman el 15% de los sedimentos terrestres. La calcita es utilizada en la industria de construcción en forma de piedra caliza y mármol para la producción de cemento y hormigón (Dietrich, 2013). El polimorfo de CaCO3 obtenido en un proceso de biomineralización depende del microorganis- mo utilizado, su concentración y actividad de la ureasa, cuando la ruta metabólica activada es la hidrólisis de urea. El polimorfo también puede variar según factores externos como pH, temperatura y concentraciones de urea y calcio. En industria se busca obtener calcita en la producción de carbo- nato de calcio y se puede utilizar distintas fuentes de calcio para obtener dicho polimorfo. Acetato de calcio es una fuente de calcio si se desea obtener vaterita en su mayoría, al igual que el lactato de calcio (Chaparro-Acuña, Becerra-Jiménez, Martínez-Zambrano, y Rojas-Sarmiento, 2018; Anbu y cols., 2016). Figura 1: Tipos de polimorfismos de carbonato de calcio. Descripción: Fotografías tomadas a través de microscopio electrónico de barrido. a) Calcita b) Aragonito c) Vaterita (Hernández-Hernández y cols., 2008) La formación de cristales de calcita mediante microorganismos, o MICP por sus siglas en in- glés es el proceso más común dentro de la biomineralización. Anteriormente el término utilizado era calcificación, refiriéndose al proceso especialmente con carbonato de calcio. El proceso ocurre espontáneamente cuando se encuentra una solución con exceso de iones de calcio y productos meta- bólicos de carbonato secretados por las células del microorganismo. Estos metabolitos se unen con calcio para la precipitación de calcita insoluble (Castro-Alonso y cols., 2019; Anbu y cols., 2016; Chaparro-Acuña y cols., 2018). La precipitación de calcita es un proceso que puede ocurrir a través de distintos procesos me- 5 tabólicos, dependiendo del microorganismo que esté produciendo el mineral. Entre los procesos que han demostrado precipitación de calcita se encuentran la oxidación anaeróbica de sulfitos, formación de polímeros extracelulares, fotosíntesis e hidrólisis de urea, siendo este último el proceso más estu- diado y distribuido en la naturaleza. Durante la hidrólisis de urea, es la enzima ureasa que media el proceso, y la calidad de los cristales depende de factores del medio como pH, concentración de carbonos inorgánicos disueltos (DIC), la concentración de iones de calcio y los sitios de nucleación (Castro-Alonso y cols., 2019; Anbu y cols., 2016; Chaparro-Acuña y cols., 2018). 4.3. Bioconcreto El cemento es usado como material de construcción para robustecer el suelo. Sin embargo, la pro- ducción de cemento tiene un impacto ecológico significativo en todas las etapas de su producción. Globalmente, la producción de cemento representa el 5% del total de energía industrial y es respon- sable del 8.6% de la producción de dióxido de carbono causado por el hombre (Miller, Horvath, y Monteiro, 2016). Un método alternativo al concreto para endurecer los suelos es la lechada química. Esta contiene silicato de sodio, cloruro de calcio, hidróxido de calcio, acrilatos y acrilamidas. Su composición hace que la lechada química sea un proceso sumamente costoso y tóxico, para tanto el hombre, como para el ambiente (Stabnikov y cols., 2013). La precipitación de calcita incitada por microorganismos hace viable el sellado de fracturas de apertura fina (<100µm) de una estructura, lo que mejora la resistencia del material y aumenta la durabilidad de este (Tobler, Minto, El Mountassir, Lunn, y Phoenix, 2018). Todo esto se debe a la reducida absorción de agua del material. En 1990, JP Adolf y su equipo patentaron la técnica de restauración de piedra decorativa MICP con el nombre de "Biodeposición". Esta patente expiró en 2010 (Adolphe, Loubière, Paradas, y Soleilhavoup, 1990). Hoy, este material se llama bioconcreto. Bioconcreto se define como un hormigón tratado con microorganismos que precipitan el carbonato de calcio para cerrar las grietas del cemento. Esta capacidad, denominada autorreparación, convierte al bioconcreto en una alternativa atractiva al cemento convencional. El bioconcreto no solo se es autorreparable (permitiendo así una reducción de gastos de reparación), sino que su fabricación es más sostenible que el cemento convencional (Stabnikov y cols., 2013; Seifan y cols., 2016). De igual manera, reduce la permeabilidad del cemento, disminuyendo su erosión por congelación y descongelación. Asimismo, participa en la defensa de superficies de concreto contra el ingreso de sustancias dañinas (Anbu y cols., 2016; Chaparro-Acuña y cols., 2018; Castro-Alonso y cols., 2019). 4.4. Producción de calcita mediante hidrólisis de urea La hidrólisis de urea es un proceso metabólico mediado por la ureasa (EC 3.5.1.5) y la anhidrasa carbónica (EC 4.2.1.1). En la Figura No.2 se observa la ruta metabólica para producción de CaCO3 en Lysinibacillus descrita mediante análisis computacional genético (Morales, 2020). La hidrólisis de urea es una serie de reacciones químicas que se dividen en dos etapas, mediadas por la ureasa. En la primera, un mol de urea se hidroliza a amoniaco y carbamato (reacción 1). En la siguiente fase el carbamato se hidroliza a amoniaco y ácido carbónico (reacción 2). La anhidrasa carbónica convierte el ácido carbónico en bicarbonato (reacción 3) y los moles de amoniaco se convierten en amonio por hidrólisis (reacción 4). Luego, el bicarbonato busca estabilidad y reacciona dando lugar al ion carbonato y agua, utilizando los iones hidrógeno de la conversión a bicarbonato y los iones hidroxilo de la hidrólisis de amoniaco (reacción 5). Los iones hidroxilo restantes aumentan el pH del medio. Por último, el ion carbonato creado reacciona con un ion de calcio formando carbonato de calcio (reacción 6). El amonio y carbonato son liberados del citoplasma celular y al entrar en contacto con los iones de calcio, atraídos por la carga negativa de la superficie celular, se forma el precipitado de carbonato de calcio de forma extracelular (Dhami, Alsubhi, Watkin, y Mukherjee, 2017; Chou, 6 Aydilek, Seagren, y Maugel, 2008; Castro-Alonso y cols., 2019). CO(NH2)2 + H2O → NH2COOH + NH3 (1) NH2COOH + H2O → NH3 + H2CO3 (2) H2CO3 ↔ HCO3 - + H+ (3) 2NH3 + 2H2O → 2NH4 + + 2OH- (4) HCO3 - + H+ + 2OH- → CO3 2- + 2H2O (5) Ca2+ + CO3 2- → CaCO3 (6) Las ureasas (EC 3.5.1.5) pertenecen a la superfamilia de las amilohidrolasas y fosfotriesterasas. Son metaloenzimas con níquel en su centro activo. Por otro lado, la anhidrasa carbónica (EC 4.2.1.1) es también una metaloenzima, pero utiliza zinc en lugar de níquel en su centro activo (Nelson y Cox, 2018). Figura 2: Hidrólisis de urea para producción de carbonato de calcio. Descripción: Ruta metabólica utilizada por los microorganismos para la producción de calcita a partir de hidrólisis de urea, con ejemplificación de las enzimas necesarias y los genes involucrados (Morales, 2020) 4.5. Género Lysinibacillus El género Lysinibacillus es uno de los géneros que producen CaCO3 mediante biomineralización, por lo cuál puede ser aplicado en bioconcreto. Este género pertenecía previamente al género Bacillus. Este género es de la familia Bacillaceae y del filo Firmicutes. Los microorganismos Lysinibacilllus son Gram positivas, ubicuas, móviles, aeróbicas o anaeróbicas facultativas. Su morfología es baciliar, con forma de varilla. Los Lysinibacillus son formadores de endosporas. Existen 26 especies reporta- das de este género. Este género demuestra interés en diversas investigaciones debido a su aplicación 7 industrial de distintos campos por sus habilidades biopesticidas, de biorremediación, capacidad an- timicrobiana y baja patogenicidad en humanos. Su especie representativa es L. sphaericus (Kayath y cols., 2019). 4.6. Crecimiento bacteriano El crecimiento bacteriano es un proceso complejo que involucra numerosas reacciones anabólicas y catabólicas. La finalidad de estas reacciones es la división celular. Cada microorganismo tiene sus propias especificaciones de nutrientes y condiciones para su crecimiento óptimo. El descubrimiento esta información se lleva a cabo en estudios controlados en laboratorio, utilizando cultivos puros de cada microorganismo. Existen dos posibles escenarios para el estudio del crecimiento bacteriano: el cultivo en lote o cultivo continuo. En el cultivo por lote se evalúa el crecimiento bacteriano con una cantidad establecida de substrato añadido al lote. En cambio, en el cultivo continuo el sustrato se añade en un flujo constante, manteniendo la concentración del sustrato constante en el medio de cultivo. Ambos escenarios de crecimiento bacteriano se han estudiado tanto fisiológicamente como descrito matemáticamente. Esta información puede ser utilizada para optimizar el medio de cultivo y cantidad de nutrientes para cierto microorganismo para un desarrollo específico de un metabolito de interés (Maier y Pepper, 2015). 4.6.1. Curva de crecimiento bacteriano Para el estudio del crecimiento bacteriano se utiliza un cultivo en lote de un aislado puro de microorganismos en condiciones ambientales y condiciones de nutrientes controlados. En dichas condiciones el crecimiento bacteriano puede medirse como una función de tiempo, obteniendo una curva de crecimiento. Esta curva incluye fase de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. Cada fase representa una etapa distinta del crecimiento bacteriano, asociado a cambios fisiológicos del cultivo celular. Estas fases se pueden observar en la curva de crecimiento bacteriano de la Figura 3. Una curva de crecimiento bacteriano se realiza en laboratorio al medir el número celular en el cultivo en un periodo de tiempo. Para esta medición de número de células puede utilizarse métodos como densidad óptica en espectrofotometría, conteo en Placa Petri de unidades formadoras de colonias (UFC) y conteo por microscopía utilizando una cámara de Neubauer (Maier y Pepper, 2015). Fase de latencia La primera fase que se observa en cultivo por lotes es la fase de latencia. En esta fase la tasa de crecimiento es cero. Este periodo de tiempo ocurre después de colocar un inóculo en medio de cultivo fresco. En esta fase ocurre la adaptación fisiológica del microorganismo a las condiciones del medio. Esto puede requerir de tiempo para la inducción de ARN mensajero específico y síntesis de proteínas según los requerimientos del nuevo medio de cultivo. Esta fase puede durar de minutos a horas y se puede controlar según el tipo de medio y el tamaño del inóculo inicial (Maier y Pepper, 2015; Monod, 1949). Fase exponencial La segunda fase de crecimiento es la fase exponencial. En este periodo se observa un crecimiento exponencial, es decir el crecimiento más rápido posible bajo las condiciones del cultivo por lote. En esta fase se aumenta exponencialmente el número de células en un tiempo determinado. Durante esta fase el crecimiento celular se puede expresar matemáticamente con la siguiente ecuación: 8 Figura 3: Esquema de curva de crecimiento bacteriano. Descripción: Una curva de crecimiento bacteriano típica. Se pueden comparar las fases de crecimiento (Maier y Pepper, 2015). dX/dt = µX donde X es el número de células, t es tiempo y µ es la tasa de crecimiento específico. El tiempo que tarda una célula en dividirse es conocido como el tiempo de generación (Maier y Pepper, 2015; Monod, 1949). Fase estacionaria La tercera fase de crecimiento es la fase estacionaria. En esta fase no hay crecimiento neto. En esta fase todavía existe crecimiento y división celular, simplemente existe un balance entre el número de células en división y el número de células que mueren. Esta fase se alcanza cuando la fuente de carbono o demás nutrientes se terminaron (Maier y Pepper, 2015; Monod, 1949). Fase de muerte La última fase de crecimiento es la fase de muerte. Esta fase se caracteriza por una pérdida neta de células vivas. Esta fase es exponencial, aunque a una menor tasa que la fase de crecimiento exponencial. Debido a que las células muertas permanecen en el medio, si se determina la curva de crecimiento mediante densidad óptica en lugar de mediante conteo en Placa Petri, esta fase puede no ser evidente (Maier y Pepper, 2015; Monod, 1949). 4.6.2. Esporulación Las especies bacterianas tienen distintos mecanismos de adaptación cuando se someten a condi- ciones ambientales selectivas. Uno de los mecanismos de supervivencia más comunes es la formación 9 de esporas. Las esporas bacterianas son la forma más inactiva de bacterias ya que exhiben un meta- bolismo y respiración mínimos y una producción de enzimas reducida. Las bacterias Grampositivas son más conocidas por producir esporas intracelulares conocidas como endosporas. Las endosporas se forman dentro de las células bacterianas y son comunes en especies de Bacillus y Clostridium. Las endosporas pueden resistir la inactivación con etanol y sobrevivir a temperaturas de hasta 150°C, pueden proteger a las células de radiación ultravioleta, a pH extremos, sequía y agotamiento de nutrientes. Las endosporas vuelven a germinar en células vegetativas cuando las condiciones ambientales que la rodean favorecen el crecimiento y la reproducción bacteriana. El proceso de formación de esporas conlleva una serie de pasos. Comienza con la replicación de ADN bacteriano, seguida de la formación de preespora, continúa con la formación de corteza entre las membranas interna y externa para encerrar a la espora. Finalmente, la capa de espora externa rodea la endospora antes de su liberación. La tinción de muestras bacterianas inactivas con verde de malaquita como tinte primario y safranina como tinte de contraste da como resultado la aparición de endosporas ovaladas verdes encerrados dentro de células bacterianas vegetativas rosadas (Basta y Annamaraju, 2020). 4.6.3. Medio de cultivo Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La variedad de medios de cultivo se debe a la diversidad metabólica de los microorganismos, por lo cual no existe un cultivo universal adecuado para todos. Algunos de los componentes habituales de los medios de cultivo son el agar, extractos, peptonas, fluidos corporales, sistemas amortiguadores, indicadores de pH, agentes reductores y/o agentes selectivos. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo, los extractos y peptonas proporcionan nutrientes, especialmente proteínas, nitrógenos y sales minerales. Los fluidos corporales aportan factores de crecimiento e inhibidores para algunas bacterias. Los sistemas amortiguadores permiten mantener el pH dentro del rango óptimo para crecimiento bacteriano y los indicadores detectan variaciones debido a fermentación y otros procesos metabólicos. Los agentes reductores crean condiciones en el medio para permitir crecimiento de microorganismos anaerobios o microaerófilos y los agentes selectivos permiten frenar el crecimiento a determinados microorganismos (Tanner, 2007). Existen medios de cultivo generales, que son aquellos que permiten el crecimiento de una gran variedad de microorganismos. También se encuentran los medios de enriquecimiento, que favorecen el crecimiento de determinado tipo de microorganismo sin inhibir el crecimiento de los demás. Los medios selectivos permiten el crecimiento de un tipo específico inhibiendo el desarrollo de los demás y los medios diferenciales ponen de manifiesto propiedades de un determinado tipo de microorganismo (Tanner, 2007). Se puede utilizar una composición específica de medio de cultivo para optimizar la producción de carbonato de calcio en especies del género Lysinibacillus. Para dicha optimización el medio debe de incluir cloruro de calcio para aumentar la carga negativa de la membrana y facilitar la atracción de iones de calcio, también aportados por este compuesto, para la formación del mineral. También se debe mejorar la actividad de la ureasa, al ser la enzima responsable de la producción de calcita por hidrólisis de urea. Para mejorar la actividad de la ureasa se debe utilizar un medio pobre en nitrógeno, con un pH básico de aproximadamente 8, También se debe adicionar níquel, debido a que es un compuesto necesario para la ureasa, al ser una metaloenzima. Se ha observado que el bario y citrato aumentan la actividad de la ureasa. Se debe evitar los iones de litio, magnesio, zinc o yodo, ya que actúan como inhibidores de la ureasa (Al-Thawadi, 2011). 10 4.7. Microestructura de bioconcreto Para su aplicación industrial y optimización es necesario conocer a fondo la microestructura del bioconcreto desarrollado bajo ciertas condiciones y con cada microorganismo específico. Para estudiar los cambios a micro niveles de la estructura de concreto durante la reparación mediante biomineralización se utilizan la tomografía computarizada de rayos X, la microscopía electrónica de barrido y la espectroscopía de dispersión de energía mayoritariamente. 4.7.1. Microscopía electrónica de barrido El microscopio electrónico de barrido (SEM) es un tipo de microscopio electrónico diseñado para estudiar las superficies de objetos sólidos. Este microscopio utiliza un haz de electrones enfocados de energía baja como sonda de electrones que escanea sobre la muestra. Este microscopio produce imágenes de alta resolución, por lo que pueden ser examinadas a una alta magnificación. Para preparación de muestra solo se requiere que sean conductoras, ya que el funcionamiento depende del haz de electrones. En el microscopio electrónico de barrido la muestra generalmente se recubre con una capa de carbono o de un metal como el oro para darle propiedades conductoras (Britannica, 2013). El microscopio electrónico de barrido tiene aplicaciones variadas, desde la industria petroquímica o metalurgia hasta la medicina forense. Los análisis realizados en este microscopio proporcionan da- tos como textura, tamaño y forma de la muestra. En geología se realizan investigaciones geomineras, cristalográficas, mineralógicas y petrológicas. Para estudio de materiales se realiza caracterización microestructural de materiales, identificación y análisis de fases cristalinas y transiciones de fases en materiales como cerámicos, semiconductores, polímeros y minerales. También se puede determinar el grado de cristalinidad y presencia de defectos en la muestra. Esta técnica se utiliza para con- trol de calidad en industria textil, electrónica y en medicina forense, botánica y biomedicina para comprender la estructura de la muestra a nivel microscópico (Penagos, 2013). 4.7.2. Cristalografía de rayos X La cristalografía de rayos X ha sido una herramienta fundamental en el desarrollo de campos de la ciencia y la biología. Esta técnica permite averiguar la estructura, mecanismo molecular y actuación de moléculas biológicas como las proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos. También puede ser utilizada para el diseño de fármacos. La cristalografía de rayos X permite visualizar objetos que se pueden detectar a simple vista y requieren de radiación electromagnética de cierta longitud de onda para poder visualizarse. A diferencia de la luz visible, los rayos X no pueden ser focalizados con facilidad, por lo que se separa el proceso en dos operaciones de forma simultánea. La primera fase se encarga de la difracción. La difracción de una sola molécula es demasiado débil para medirse, pero el grado interno de un cristal permite medir la difracción de sus moléculas, obteniendo una estructura más detallada. La información de la estructura cristalina permite conocer las posiciones de los átomos en el espacio y el estado de vibración térmica (Kumar y cols., 2013). 11 Figura 4: Calcita en microscopio electrónico de barrido Descripción: Visualización de calcita producida por precipitación microbiana en microscopio electrónico de barrido (Kumar, Prabhakara, y Pushpa, 2013). Figura 5: Espectrograma de calcita con cristalografía de rayos X Descripción: Patrón generado por bioconcreto en cristalografía de rayos X (Kumar y cols., 2013). 12 CAPÍTULO 5 Metodología Figura 6: Metodología a llevar a cabo este estudio Descripción: Diagramación de metodología a llevar a cabo en este estudio. La primera sección cumple con los objetivos específicos 1 y 2. La segunda sección con el objetivo 3 y la sección 3 con el objetivo 4. Fuente: Autoría propia 13 5.1. Sitio de estudio El presente estudio se llevó a cabo en la ciudad de Guatemala, Guatemala en las instalaciones de la Universidad del Valle de Guatemala: Laboratorio del Departamento de Bioquímica y Microbiología y Laboratorio del Centro de Estudios en Biotecnología de la misma universidad. 5.2. Sujetos de estudio Los sujetos de estudio fueron bacterias aisladas del suelo del género Lysinibacillus, productoras de carbonato de calcio y obtenidas de la cementera de Cementos Progreso ubicada en Sanarate, El Progreso. 5.3. Enfoque, diseño y tipo de investigación Esta investigación tuvo un enfoque combinado dominante, siendo el enfoque cuantitativo el do- minante, y un diseño experimental verdadero. 5.4. Tipo y tamaño de muestra Se utilizaron bacterias aisladas del suelo seleccionadas de manera discrecional, debido a su efec- tividad en la producción de carbonato de calcio. 5.5. Estudios previos Este proyecto conjunto de la Universidad del Valle de Guatemala, el Centro de Estudios en Bio- tecnología y Cementos Progreso comenzó en el 2018. Bajo este proyecto se realizaron dos estudios que dieron lugar a el presente estudio. El primero titulado "Determinación de biomineralización a partir de bacterias de suelo y subsiguiente formulación de medio de cultivo a base de desechos industriales para la biorreparación de microgrietas en concreto"(Heredia, 2019). En este primer es- tudio se aislaron distintas cepas bacterianas de una cantera cementera y se comprobó su capacidad de biomineralización mediante hidrólisis de urea. El segundo se titula Ïdentificación de la ruta me- tabólica para producción industrial de calcita por hidrólisis de urea en Lysinibacillus sphaericus mediante análisis computacional genético de Sporosarcina, Bacillus y Lysinibacillus spp.(Morales, 2020). En este estudio se describió la ruta metabólica de las especies del género Lysinibacillus para la producción de CaCO3 mediante hidrólisis de urea in sílico a partir de un análisis computacional genético. 5.6. Criterios de inclusión y exclusión Se excluyeron aquellas bacterias aisladas del suelo de la cementera de Cementos Progreso cuya producción de carbonato de calcio sea menor a las bacterias que se incluyen. Se incluyeron las tres cepas de bacterias que tengan mayor producción comprobada de carbonato de calcio del género Lysinibacillus spp. 14 5.7. Variables En el Cuadro No.1 se describen las variables a controlar durante la producción y recuperación de esporas de las cepas bacterianas. Estas variables alteran la tasa de duplicación y el tiempo de consumo de nutrientes de las cepas bacterianas. Entre mayor el número de células bacterianas se encuentren en el medio mayor será la recuperación de esporas. En el Cuadro No. 2 se describen las variables a controlar en la producción de carbonato de calcio de las esporas bacterianas. Al igual que en el Cuadro No.1 estas condiciones deben de ser reguladas para optimizar la producción de calcita. Cuadro 1: Variables para la producción y recuperación de esporas de las cepas bacterianas que se aislaron del suelo de la planta cementera de Sanarate, El Progreso. Variable Definición Tipo Unidades de medición Temperatura Temperatura de incubación de crecimiento de las bacterias. Cuantitativo °C Tiempo Tiempo de crecimiento de las bacterias. Cuantitativo Horas Agitación Velocidad de agitación de incubadora para el crecimiento bacteriano Cuantitativo cm3 Absorbancia Turbidez del medio de cultivo según concentración bacteriana Cuantitativo - Conteo celular Número de células por mililitro en cada punto de crecimiento bacteriano Cuantitativo Cel/ml Conteo de esporas Número de esporas recuperadas mediante esporulación y floculación Cuantitativo Cantidad de esporas Cuadro 2: Variables para la optimización de la producción de carbonato de calcio de las cepas bacterianas que se aislaron del suelo de la planta cementera de Sanarate, El Progreso Variable Definición Tipo Unidades de medición Temperatura Temperatura de la incubadora para el crecimiento bacteriano. Cuantitativo °C Tiempo Tiempo de crecimiento de las bacterias. Cuantitativo Horas Volumen Volumen de EDTA para titulación de carbonato de calcio Cuantitativo mL Concentración de carbonato de calcio Concentración de carbonato de calcio producida por cada cepa bacteriana Cuantitativo g/mL Presencia de precipitado Precipitado de carbonato de calcio Cualitativo Presente/ ausente 5.8. Hipótesis Objetivo 1 • Hipótesis nula 1: ◦ - La cepa bacteriana con mayor producción de carbonato de calcio no es una cepa de Lysinibacillus sphaericus. • Hipótesis alternativa 1: ◦ La cepa bacteriana con mejores índices de calidad en cubos de concreto de carbonato de calcio es una cepa de Lysinibacillus sphaericus. Objetivo 2 • Hipótesis nula 2: ◦ Al realizar una curva de crecimiento no se puede encontrar el tiempo de incubación apropiado para la detención de la curva y consiguiente esporulación de las cepas bacterianas aisladas de una cementera en Sanarate, El Progreso • Hipótesis alternativa 2: ◦ Al realizar una curva de crecimiento se puede encontrar el tiempo de incubación apropiado para la detención de la curva y consiguiente esporulación de las cepas bacterianas aisladas de una cementera en Sanarate, El Progreso. • Hipótesis nula 3: 15 ◦ No es factible la recuperación de esporas bacterianas mediante esporulación por cho- que térmico y floculación con cloruro de calcio. • Hipótesis alternativa 3: ◦ Es factible la recuperación de esporas bacterianas mediante esporulación por choque térmico y floculación con cloruro de calcio. Objetivo 3 • Hipótesis nula 4: ◦ No existe una diferencia significativa en la cantidad de carbonato de calcio producida en el medio TSUC en comparación a la cantidad producida en sustrato LUC con y sin cofactores. • Hipótesis alternativa 4: ◦ Existe una diferencia significativa en la cantidad de carbonato de calcio producida en el medio TSUC en comparación a la cantidad producida en sustrato LUC con y sin cofactores. • Hipótesis nula 5: ◦ Existe una diferencia significativa en la calidad de carbonato de calcio producida en el medio TSUC en comparación a la cantidad producida en sustrato LUC. • Hipótesis alternativa 5: ◦ No existe una diferencia significativa en la cantidad de carbonato de calcio producida en el medio TSUC en comparación a la cantidad producida en sustrato LUC con y sin cofactores. Objetivo 4 • Hipótesis nula 6: ◦ No existe una diferencia significativa en la calidad de carbonato de calcio producida en el medio TSUC en comparación a la cantidad producida en sustrato LUC. eHipótesis alternativa 6: • ◦ Existe una diferencia significativa en la calidad de carbonato de calcio producida en el medio TSUC en comparación a la cantidad producida en sustrato LUC. 5.9. Viabilidad Para llevar a cabo este estudio se contó con la autorización del departamento de Bioquímica y Microbiología de la Universidad del Valle de Guatemala, de utilizar las instalaciones de laboratorio del departamento para llevar a cabo la parte microbiológica de este estudio. No se requirió una revisión de bioética para este estudio. La elección de los géneros de bacterias que se utilizan en este estudio se fundamenta en cepas productoras de calcita obtenidas en los terrenos de Cementos Pro- greso S.A. y analizadas por el Centro de Estudios en Biotecnología (CEB) de la Universidad del Valle de Guatemala. Se contó con la aprobación de ambas instituciones para la realización de este estudio. Cabe mencionar que para poder cumplir con los objetivos descritos anteriormente tenía acceso a los equipos requeridos. En la Universidad del Valle de Guatemala tuve acceso a autoclave, incubadora con agitación, espectrofotómetro, microscopio, cámara de Neubauer, baño térmico, centrifugadora, balanzas, horno de secado, cámara de electroforesis y transiluminador. En los laboratorios CETEC de Cementos Progreso tuve acceso a estereoscopio, prensa hidraúlica, microscopio electrónico de barrido, difractor de rayos X y mezcladora. 16 5.10. Materiales y métodos 1. Identificación de las cepas bacterianas I Preparación de medios para batería bioquímica 1) Prueba de motilidad Se seleccionó una colonia aislada del cultivo realizado. Se picó la colonia con un asa en punta e inoculó en medio SIM pinchando una sola vez en el centro. Se incubó a 36°C por 120 horas y se examinó cada 24 horas Resultado positivo: Crecimiento bacteriano a través del medio, no únicamente en el asado. 2) Prueba de oxidasa Se seleccionó una colonia aislada del cultivo realizado. Se sumergió papel filtro en solución de reactivo de Kovac (1% tetrametil-p- fenilediamina dihidrocloruro en agua) Se observó el cambio de color en 10 segundos Resultado positivo: cambió de color a morado o azulado. 3) Prueba de fijación de nitrógeno Se prepararon 500mL de medio Burk (10g de dextrosa, 0.41g de KH2PO4, 0.52g de K2HPO4, 0.05g de Na2SO4, 0.2g de CaCl2, 0.1g de MgSO4*7H2O, 0.005g de FeSO4*7H2O, 0.0025g de Na2MoO4*2H2O y 15g de agar, con ajuste de pH a 7) Se sembraron placas con cada bacteria y se dejaron incubando 24h, después se re- aislaron en nuevas cajas y dejaron incubando 24 horas más. Se repitió el proceso 5 veces. Resultado positivo: crecimiento bacteriano. 4) Prueba de solubilización de fosfatos Se preparó medio de agar nutritivo suplementado con 5% lectina y medio agar nutritivo suplementado con 5% Ca3(PO4)2 Se sembraron colonias en ambas placas y se observó crecimiento tras incubación por 4-5 días. Se interpretó un resultado positivo como un halo de solubilización alrededor del crecimiento bacteriano. 5) Prueba de producción de amoniaco Se preparó medio urea con indicador de pH fenolftaleína, que viró rosa en pH básico. Se incubaron placas inoculadas por 24 horas a 37°C. Resultado positivo: Cambio de color de agar a rosa intenso. Se utilizó la metodología descrita por (Benavides y Hermida, 2008; Hashmi, Binds- chedler, y Junier, 2020) II Perfil plasmídico de las cepas bacterianas Se realizó un cultivo de 8 horas en caldo tripticasa soya de las tres cepas bacterianas. Se centrifugó 1.5mL de cultivo bacteriano a 10,000 g por 30 segundos. Se desechó el sobrenadante y se resuspendió en 100uL de solución de 25mM tris-HCl pH8, 50mM de glucosa y 10mM EDTA. Se mezcló la solución en vortex por 2 minutos. Se añadió 200uL de 0.2N de NaOH y 1.0% de SDS. Se incubó 5 minutos en hielo y se añadió 150uL de solución de 120mL de 5M acetato de potasio, 23mL de ácido acético glacial y 57mL de agua destilada. incubó por 5 minutos en hielo y se centrifugó por 5 minutos a 12,000g. 17 Se desplazó el sobrenadante a un nuevo tubo y se agregó 700uL de etanol 100resus- pendió el precipitado en 25uL de buffer TE, Se preparó un gel de agarosa 1.5% y se corrieron las muestras a 100V por 45 minutos. 2. Crecimiento de cepas bacterianas y producción de esporas I Producción y recuperación de esporas de las cepas bacterianas que se aislaron del suelo de la planta cementera de Sanarate, El Progreso. 1) Producción de esporas de las cepas bacterianas productoras de carbonato de calcio a ′ Medición de curvas de crecimiento bacteriano. Se prepararon 400mL de caldo tripticasa de soya según las instrucciones del fabricante ajustando el pH a 8. Se inoculó el caldo con 1 colonia de la bacteria aislada del suelo de la planta cementera de Sanarate, El Progreso y se dejó incubando 48 horas a 37°C y 190rmp en una incubadora con agitación. Se prepararon 4 litros de caldo tripticasa de soya según las instrucciones del fabricante y se ajustó el pH a 8. Se dividió el medio en tres Erlenmeyer de 1L con 900mL de medio de cultivo y tres Erlenmeyer de 250mL con 225mL de medio de cultivo. Se inoculó el nuevo medio preparado con el cultivo de 48 horas de la bacteria. Los Erlenmeyer de 1L se inocularon con 100mL del cultivo bacteriano y los Erlenmeyer de 250mL se inocularon con 25mL del cultivo bacteriano. Se incubaron los 6 Erlenmeyer inoculados a 37°C y 190rpm. Cada hora y media se tomó un mililitro de cada Erlenmeyer para medir creci- miento celular a OD600. Además, se tomó un mililitro para conteo en placa de Neubauer. Esta metodología fue modificada de (T. Chen y cols., 2019; Heredia, 2019) 2) Recuperación de esporas bacterianas a ′ Esporulación y recuperación de esporas bacterianas mediante floculación Se realizaron cultivos en Erlenmeyer hasta fase exponencial, identificada por la curva de crecimiento previa. Se colocaron en un baño de agua a 80°C por 15 minutos para fomentar la generación de esporas. Se tomaron 5mL para realizar conteo de esporas en placa. Se añadieron 3.5g/L de cloruro de calcio dihidratado a los Erlenmeyer. Se colocaron a 90rpm por 5 minutos y luego a 40rpm por 10 minutos para la formación de flóculos. Se dejaron en reposo la suspensión por 30 minutos y se recuperaron los flóculos mediante centrifugación. Se dejaron secar los flóculos en horno para el secado de esporas. Se pesaron las esporas secadas y se calculó la eficiencia de recuperación de acuerdo con el conteo bacteriano de la curva de crecimiento. Esta metodología fue modificada de (Luna, Lopes, y Massarani, 2005; Guidi, Lehner, Lüthy, y Tonolla, 2013) b′ Tinción de esporas Se realizó un frotis con las esporas recuperadas mediante floculación Se cortó papel filtro del tamaño del frotis y se colocó encima del frotis. Se colocó el frotis con papel filtro en un asa y malla con un soporte de metal, para colocar por debajo un mechero. Se encendió el mechero y se colocó verde de malaquita sobre el papel filtro, manteniéndolo húmedo durante 5 minutos. 18 Se dejó enfriar el frotis. Se lavó con agua destilada. Se tiñó con safranina por un minuto y se lavó con agua destilada. Se observó la tinción en microscopio. Esta metodología fue modificada de (Kozuka y Tochikubo, 1991; Heredia, 2019) c′ Conteo de esporas bacterianas Se realizaron diluciones seriadas hasta 10-8 con 1mL de cultivo bacteriano ex- puesto a choque térmico. Se observaron las diluciones seriadas de 10-6 y 10-7 en cámara de Neubauer y contaron las esporas en cada dilución. Se calculó el porcentaje de recuperación de esporas bacterianas. Esta metodología fue modificada de (Kozuka y Tochikubo, 1991) d ′ Reactivación de esporas Se colocó 0.01g de esporas en agar tripticasa soya preparado según las especi- ficaciones del fabricante y con pH ajustado a 8. Se incubaron por 48 horas a 37°C. Se observó crecimiento bacteriano después de ese periodo de tiempo. Esta metodología fue modificada de (Kozuka y Tochikubo, 1991) 3. Optimización de la producción de carbonato de calcio de las cepas bacterianas que se aislaron del suelo de la planta cementera de Sanarate, El Progreso. I Comparación de medios TSUC y LUC en la producción de carbonato de calcio. Se prepararon 180 Eppendorf de 1.5mL con 1mL cada una de las siguientes soluciones: TSUC, TSUC con 1% hidróxido de bario, TSUC con 10µM sulfato de níquel y TSUC con 20mM citrato de calcio, LUC con 1% hidróxido de bario, LUC con 10µM sulfato de níquel y LUC con 20mM citrato de calcio. Se inocularon Eppendorf de cada solución con 2.5 * 107 esporas por pulgada cúbica de cada una de las cepas bacterianas y 1 Eppendorf sirvió de control Se titularon 3 Eppendorf de cada solución a las 24 horas, 3 Eppendorf a los 3 días, 3 Eppendorf a los 7 días, 3 Eppendorf a los 15 días y 3 Eppendorf a los 30 días de la siguiente forma: Se ajustó el pH de cada Eppendorf para la titulación a 10 utilizando NaOH Se añadieron unas 2-3 gotas de eriocromo negro 0.5% (p/v) a cada muestra y se tituló con EDTA 0.01M hasta alcanzar un color azul del indicador. La precipitación total de carbonato de calcio se calculó en base al volumen de EDTA agregado al cambio de color. Se realizó el procedimiento en triplicado. Esta metodología fue modificada de (Hashmi y cols., 2020) II Comparación de calidad de cristales de carbonato de calcio producidos por las cepas bacterianas. Con la colaboración de Cementos Progreso, se generaron 39 cubos de concreto mezcla con alta resistencia inicial (ARI+) normados según ASTMC109, con modificación de 3 cubos por ensayo, en escala 1:50 con un mortero de concentración 2.5 x 107 esporas por pulgada cúbica, el medio necesario para el volumen de agua a agregar y una proporción de 1:2.75 de volumen de arena. Se ensayaron las tres cepas, con ambos medios, además de controles para cada cepa y medio, un blanco y un tratamiento en seco. Se agrietaron los cubos de concreto mediante prensa hidráulica Toni Technik, modelo ToniPACT II, según la norma ASTMC 109, después de 24 horas de curado en cámara con humedad al 95% y 23°C y 72 horas de secado a temperatura ambiente. 19 Se identificaron las grietas para monitorear la producción de carbonato de calcio por parte de las bacterias utilizando el estereoscopio marca LEICA, modelo MZ10F, con cámara LEICA MC170 ubicado en el Centro de Investigación y Desarrollo (CETEC), de Cementos Progreso. Se sumergieron los cubos en agua con medio TSUC o sustrato LUC, según el trata- miento, a una temperatura de 21-25°C y se monitorearon las grietas por estereoscopía, con estereoscopio marca LEICA, modelo MZ10F, con cámara LEICA MC170 HD, en aumento 2.5X, cada 15 días por 30 días. Se midió el porcentaje de reparación de grietas según el cambio de la longitud de las grietas seleccionadas, utilizando las fotografías del monitoreo por estereoscopía y el Software de análisis para medición de imágenes Digimizer. Se cortó el cubo de concreto después de los 30 días para su observación en microscopio electrónico de barrido. Se visualizó la muestra en el microscopio electrónico de barrido ubicado en CETEC, marca JEOL, modelo JSM-IT500, con espectroscopía de fluorescencia de AZtec por Oxford Instruments, obteniendo así la imagen de los cristales de carbonato de calcio y el espectro de fluorescencia de los puntos observados. Los colaboradores de CETEC cortaron el cubo de concreto después de su agrieta- miento y curado para realizar un análisis de mineralogía mediante cristalografía de rayos X en difractómetro de rayos X marca Paralytical Empyream serie 2. Se obtuvo los porcentajes de carbonato de calcio en la muestra de acuerdo a la cristalografía de rayos X. Esta metodología fue modificada de (Lutfian, 2020) III Estudio de resistencia a compresión de cubos de concreto Con la colaboración de Cementos Progreso, se generaron 144 cubos de concreto ARI+ normados según ASTMC109 escala 1:50 con un mortero de concentración 2.5 x 107 esporas por pulgada cúbica, el medio necesario para el volumen de agua a agregar y una proporción de 1:2.75 de volumen de arena. Se añadirá medio en estado sólido, tanto TSUC como sustrato LUC. Se agrietaron los cubos de concreto mediante prensa hidráulica Toni Technik, modelo ToniPACT II según la norma ASTMC 109, después de 24 horas de curado en cámara con humedad al 95% y 23°C y 1, 3, 7 y 28 días de curado en agua saturada con cal a 23°C. Se anotó el valor de la presión ejercida por la prensa hidráulica hasta que se agrietaron los cubos de concreto. Esta metodología fue modificada de (Harshali, Mitali, Neha, y Pragati, 2016) IV Clasificación de las cepas bacterianas según su producción de carbonato de calcio Se midió el porcentaje de grieta cubierto por carbonato de calcio del inicio al final del periodo de producción de carbonato de calcio, midiendo los micrómetros de las grietas mediante estereoscopio. Se midió el porcentaje de cubos de calcita en la fotografía de microscopía electrónica de barrido realizada. Este porcentaje se obtuvo de la división con el mayor número de cubos de calcita que se encontró en los diversos tratamientos y la multiplicación por 100. Se midió la concentración de carbonato de calcio en la muestra tomada en cristalo- grafía de rayos X y la cantidad producida durante la titulación. Se tomaron estos tres factores, se sumaron y dividió el total entre 300 para dar un número entre 0 y 1. (% de grieta recubierta +% cubos de calcita en SEM +% de calcita en XRD) / 300 La bacteria con un índice más cercano a 1 es la bacteria con mejor producción de carbonato de calcio. 20 V Prueba de concepto en cubos de concreto en seco Con la colaboración de Cementos Progreso, se generaron 9 cubos de concreto ARI+ normados según ASTMC109 escala 1:50 con un mortero de concentración 2.5 x 107 esporas por pulgada cúbica de la cepa P.5.3.A, el medio de precipitación LUC nece- sario para el volumen de agua a agregar y una proporción de 1:2.75 de volumen de arena. Se realizaron los ensayos de reparación de grietas, difracción de rayos X y Microscopía electrónica de barrido. 21 CAPÍTULO 6 Resultados 6.1. Identificación de la cepa bacteriana con mayor producción de carbonato de calcio De acuerdo con la batería bioquímica realizada, las tres cepas bacterianas son cepas de la especie Lysinibacillus sphaericus, como se observa en el Cuadro No. 3. Las tres cepas mostraron capacidad fijadora de nitrógeno. La cepa denominada como P.5.3.A mostró capacidad de solubilizar fosfatos a diferencia de las otras dos cepas. Las tres cepas dieron positivo a ureasa, a la prueba de motilidad y a la prueba oxidasa. Las tres dieron negativo para solubilización de hierro. En la Figura No. 7 se puede observar el gel de electroforesis para establecer un perfil plasmídico de las cepas del estudio, donde se observan distintas bandas en los carriles de cada cepa. Cuadro 3: Resultados de las pruebas bioquímicas realizadas a las cepas del estudio para su identificación. Cepa Motilidad Oxidasa Fijación de N Solubilización de P Producción de NH3 Posible especie identificada P.4.1.A + + + - + Lysinibacillus sphaericus P.5.2.A + + + - + Lysinibacillus sphaericus P.5.3.A + + + + + Lysinibacillus sphaericus Leyenda Cuadro No.3: En este Cuadro se muestran los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas. El símbolo “+” indica un resultado positivo en dicha prueba mientras que el símbolo “-“ indica un resultado negativo. El orden de pruebas de izquierda a derecha es: Prueba de motilidad, prueba de oxidasa, prueba de fijación de nitrógeno, prueba de solubilización de fosfatos y producción de amoniaco. Fuente: Autoría propia 22 Figura 7: Gel de electroforesis para perfil plasmídico de las cepas del estudio. Descripción: El primer carril tiene una escalera de 100bp marca Novagen, el segundo y tercer carril son la cepa P.4.1.A, el cuato y quinto carril tienen la cepa P.5.2.A, el sexto y séptimo carril tienen la cepa P.5.3.A, el octavo carril tiene la cepa P.4.1.A, el noveno carril tiene la cepa P. 5.2.A y el décimo carril tiene la cepa P.5.3.A. Fuente: Autoría propia 6.2. Producción y recuperación de esporas de las cepas bac- terianas que se aislaron del suelo de la planta cementera de Sanarate, El Progreso En la Figura No. 8 se observa la curva de crecimiento bacteriano a escala de 250mL de las tres cepas en el estudio. Se puede observar que la cepa P.5.3.A y P.4.1.A se comportan de forma similar durante los primeros 300 minutos de su crecimiento, mientras que la cepa P.5.2.A tiene un tiempo de duplicación mayor, alcanzando mayor número de células en ese tiempo. Se observa que al finalizar los 500 minutos de crecimiento bacteriano la cepa P.5.3.A es la que presenta mayor número de células. En el Cuadro No. 4 se puede observar la cinética del crecimiento bacteriano de las tres cepas. De acuerdo con lo observado en las curvas de crecimiento bacteriano el tiempo de duplicación de las cepas P.4.1.A y P.5.3.A son similares, mientras que el tiempo de duplicación de P.5.2.A es menor, pero se observa tanto en la Figura No.8 como en el Cuadro No.4 en capacidad de carga, al finalizar el periodo de crecimiento exponencial el sistema de 250mL con la cepa P.5.3.A tiene la capacidad de carga para un mayor número de células y supera a la cepa P.5.2.A. 23 Figura 8: Comparación de curvas de crecimiento bacteriano de las cepas en el estudio Descripción: En el eje vertical se observa el número de células, mientras que el eje horizontal se encuentra el tiempo de crecimiento. Cada punto representa una medición realizada en esta curva de crecimiento, que se contabilizó utilizando Cámara de Neubauer. Se observa también barras de error representativas de 1 desviación estándar. Fuente: Autoría propia Una vez establecida la curva de crecimiento bacteriano se observó que la producción de esporas debía de realizarse alrededor de los 330 a 360 minutos después de la inoculación del medio de producción, previo a la fase estacionaria del crecimiento de las tres cepas. La esporulación, floculación y centrifugación dio como resultado las cantidades que se observan en el Cuadro No. 5. Se observa que la cepa P.5.2.A tiene un mayor peso recupe