UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias y Humanidades Validación de dos protocolos de clonación génica para el aislamiento de fragmentos de ADN relacionados a la resistencia al glifosato y tetraciclina proveniente de bacterias aisladas de muestras de suelos guatemaltecos. Trabajo de graduación presentado por María Cristina Bolaños Quiros, para optar al grado académico de Licenciada en Bioquímica y Microbiología Guatemala 2012   ii       iii     Validación de dos protocolos de clonación génica para el aislamiento de fragmentos de ADN relacionados a la resistencia al glifosato y tetraciclina proveniente de bacterias aisladas de muestras de suelos guatemaltecos.   iv     UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad de Ciencias y Humanidades Validación de dos protocolos de clonación génica para el aislamiento de fragmentos de ADN relacionados a la resistencia al glifosato y tetraciclina proveniente de bacterias aisladas de muestras de suelos guatemaltecos. Trabajo de graduación presentado por: María Cristina Bolaños Quiros, para optar al grado académico de Licenciada en Bioquímica y Microbiología Guatemala 2012     vii     PREFACIO Este trabajo de investigación se realizó en el Centro de Estudios de Biotecnología, en las instalaciones del laboratorio de Microbiología y Bioquímica de la Universidad del Valle de Guatemaa, como parte del proyecto de clonación de un gen de resistencia al glifosato novedoso para poder ser insertado en una planta, a manera de crear una planta transgénica resistente al glifosato. El proyecto actualmente continúa en proceso. El mismo se encuentra financiado por FODECYT (Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología) y es dirigido por la Dra. Monica Stein, quien fue la asesora también de este proyecto de investigación. Le agradezco a Dios, por darme la oportunidad de ser uno de los pocos privilegiados en Guatemala en tener acceso a una educación superior, especialmente en tan excelente universidad y por darme la fortaleza necesaria a lo largo del camino. Le agradezco a mis papás por el apoyo incondicional, por darme también la oportunidad de estar aquí y de haber cumplido mi sueño de estudiar genética. Muchas gracias a la Dra. Monica Stein, por sus excelentes cátedras, por su apoyo, su asesoría, por haberme dado la oportunidad de poder realizar esta investigación y mis prácticas profesionales con ella, por su paciencia, sus consejos, por haberme dado inspiración, por su excelente dedicación y constancia. Ella es la prueba que en Guatemala existen científicos con excelente preparación y ética profesional. Muchas gracias a la Dra. Pamela Pennington, por su apoyo, excelentes consejos y constante atención al proyecto. Gracias a la Licda. Claudia Paiz, por todo su apoyo, ayuda, asesoría y consejos. Sin ella hubiera sido difícil terminar esta investigación. Trabajar con ella fue una excelente experiencia.   viii     Le agradezco al Laboratorio de Protección Vegetal, en especial a la Licda. Margarita Palmieri, el Lic. Andrés Avalos y la Licda. Elena Dardón. Gracias por prestarme sus instalaciones , de vez en cuando, para poder realizar esta investigación. Gracias por los consejos, la asesoría y el tiempo dedicado a mis dudas y preguntas. Gracias a los maestros que me inspiraron, con su dedicación en sus cátedras, su constante entusiamo y su tiempo para resolver dudas sin importar el lugar o el momento. También son prueba que en Guatemala existen profesionales dispuestos a hacer el cambio. Finalmente, quiero agradecer a mis compañeros de clase y a mis amigos. Sin ellos mi paso por la universidad no hubiera sido el mismo. Gracias por todos los buenos momentos, por el apoyo, la paciencia, los favores y por darme la fuerza para seguir adelante. Me siento muy contenta de haber conocido a tan excelentes personas.   CONTENIDO PREFACIO ......................................................................................................................... vi   LISTA DE CUADROS ..................................................................................................... ix   LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................... xi   RESUMEN ....................................................................................................................... xvi   I.   INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1   A.   Antecedentes ............................................................................................................ 3   B.   Justificación ........................................................................................................... 26   C.   Objetivos ................................................................................................................ 27   II.   MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 28   A.   Métodos ................................................................................................................. 28   B.   Diseño experimental .............................................................................................. 46   III.   RESULTADOS ........................................................................................................ 59   IV.   DISCUSIÓN ............................................................................................................. 84   V.   CONCLUSIONES....................................................................................................101   VI.   RECOMENDACIONES.........................................................................................103   VII.   LITERATURA CITADA......................................................................................105   VIII.   APENDICE..........................................................................................................111       LISTA DE CUADROS Título Página Cuadro 1 Cultivos transgénicos resistentes al glifosato que han sido deregulados en los Estados Unidos…………..………………………………………………………….7 Cuadro 2 Cultivos bacterianos realizados y resultados esperados……………………….37 Cuadro 3 Cuantificación de ADN genómico extraído por primera vez con kit .....................…………...………………................................................................49 Cuadro 4 Cuantificación de ADN genómico extraído por el método de Trizol...............……...……………………………………………………...........……50 Cuadro 5 Cuantificación de ADN genómico extraído por el método de cloroformo:alcohol isoamílico……………………………….......................................51 Cuadro 6 Cuantificación de ADN genómico extraído por el método de kit optimizado......................….................................................................................….52 Cuadro 7 Cobertura del genoma en las bibliotecas genómicas generadas con las enzimas PstI y HindIII para el aislamiento del gen de resistencia a tetraciclina utilizando la relación vector:inserto 1:1.............................................................................56 Cuadro 8 Cobertura del genoma en las bibliotecas genómicas generadas con las enzimas PstI y HindIII para el aislamiento del gen de resistencia a glifosato utilizando la relación vector:inserto 1:1.............................................................................59 Cuadro 9 Cobertura del genoma de la muestra en las bibliotecas genómicas generadas con la enzima PstI utilizando la relación vector:inserto 1:1..............................61 Cuadro 10 CMI y valor p del clon Glifo1 calculado por el método de Kaplan Meier.......63 Cuadro 11 CMI y valor p del clon Glifo2 calculado por el método de Kaplan Meier.......66 Cuadro 12 Análisis en BLAST de la secuencia de los insertos que confieren resistencia a tetraciclina y glifosato....................................................................................70 Cuadro 13 Análisis en BLAST de la secuencia de consenso……………..……………...71   xi     Cuadro 14 Secuencia de los cebadores degenerados diseñados para la amplificación del gen parcial de resistencia al glifosato ……......……………………….72 Cuadro 15 Análisis en BLAST de la secuencia de los insertos...............................……...78 Cuadro 16 Genes 6 kb antes y 6 kb despúes de las secuencias dadas por los cebadores M13F y M13R....................................................................................……..….96 Cuadro 17 Cuantificación de ADN digerido por las enzimas PstI y Hind III luego de la purificación del mismo………………………….........…………………….111 Cuadro 18 Conteo de colonias de la biblioteca genómica y porcentaje de cobertura del genoma……...…………………………………………………..……..…119 Cuadro 19 Conteo bacteriano, promedio y desviación estándar de E.coli DH5α………120 Cuadro 20 Conteo bacteriano, promedio y desviación estándar de Mx3……………….120 Cuadro 21 Conteo bacteriano, promedio y desviación estándar de Glifo1 …………….121 Cuadro 22 Conteo bacteriano, promedio y desviación estándar de Glifo 2…………….121 Cuadro 23 Cuantifiación del plásmido pUC19 con inserto extraído de los clones Tet1, Tet2, Glifo1 y Glifo2…………………………………….......……………126 Cuadro 24 Número de accesión según NCBI de los genes utilizados para el diseño de los cebadores degenerados……………………………………......……….144 Cuadro 25 Código de los cebadores degenerados………………………………………149 Cuadro 26 Estudio de lso cebadores diseñados por medio del programa CLC………...150   xii     LISTA DE FIGURAS Título Página Figura 1 Molécula de glifosato……………………………………………………………3 Figura 2 Ruta shikímica y lugar de inhibición del glifosato………………………………4 Figura 3 Dominios de los transportadores ABC y fusión de los dominios………………15 Figura 4 Transportador ABC y proteína de unión periplásmica…………………………18 Figura 5 Pasos a seguir para crear una biblioteca genómica……………………………..20 Figura 6 Transformación de plantas mediada por Agrobacterium tumefasciens..……….24 Figura 7 Diagrama de flujo del procedimiento de la metodología ………………………28 Figura 8 Plásmido pUC19 ……………………………………………………………….33 Figura 9 Bibliotecas genómicas realizadas........................................................................38 Figura 10 Plásmido pCR 2.1 ..………………………………………………………...…44 Figura 11 ADN genómico extraído con kit de la muestra……..…………………………53 Figura 12 Digestión parcial del ADN genómico de la muestra con las enzimas PstI y Hind III……………………………………………………………….....………....54 Figura 13 Plásmido pUC19 sin digerir y digerido con PstI y Hind III…..……………....55 Figura 14 Clon de resistencia a tetraciclina Tet1……………………..………………….57 Figura 15 Clon de resistencia a tetraciclina Tet2 ………………………………………..58 Figura 16 Comparación de las diferentes cepas creciendo bajo selección en tetraciclina….............................................................................................….59 Figura 17 Clones resistentes a glifosato Glifo1, Glifo2, Glifo3, Glifo4 y Glifo5………..60 Figura 18 Clones G1 a G25 resistentes a 25 mM glifosato................................................62 Figura 19 Gráfica del promedio de la curva de crecimiento de Glifo1 en escala logarítmica comparado con los controles…………………....………………...63   xiii     Figura 20 Gráfica de la función de sobrevivencia acumulada de Glifo1 comparado con E.coli DH5α…………………………………………..…………………64 Figura 21 Gráfica de la función de sobrevivencia acumulada de Glifo1 comparado con Mx3……………………………………………………….......…………65 Figura 22 Gráfica del promedio de las curvas de crecimiento de Glifo2 en escala logarítmica comparado con los controles………………………....…………...66 Figura 23 Gráfica de la función de sobrevivencia acumulada de Glifo2 comparado con E.coli DH5α…………………………………………………..…………67 Figura 24 Gráfica de la función de sobrevivencia acumulada de Glifo2 comparado con Mx3………...……………………………………...…………………….68 Figura 25 Plásmido pUC19 sin inserto y plásmido pUC19 con los insertos que confieren resistencia a tetraciclina y resistencia a glifosato…….……………...…....69 Figura 26 Productos de la PCR con cebadores degenerados destinados para la amplificación el gen de resistencia al glifosato......................................................73 Figura 27 Clones PCRG con inserto………………………………………………..……74 Figura 28 Clones PCRG3, PCRG13, PCRG36, PCRG52, PCRG69, PCRG80, PCRG87, PCRG91, PCRG100………………………………………………....……...…75 Figura 29 Plásmido con inserto de los clones PCRG3, PCRG13, PCRG36, PCRG52, PCRG69, PCRG80...................................................…………………………..76 Figura 30 Plásmido con inserto de los clones PCRG87, PCRG91, PCRG100..................77 Figura 31 Gen EPSPS amplificado parcialmente por los cebadores degenerados diseñados, secuenciado con el cebador M13F...............................................80 Figura 32 Gen EPSPS amplificado parcialmente por los cebadores degenerados diseñados, secuenciado con el cebador M13R..............................................81 Figura 33 Secuencia del contig de as enzimas EPSPS de Serratia sp. AS13, AS12 y AS9........................................................................................................................81 Figura 34 Lugar en el cual se unen los cebadores degenerados en relación al contig y a la secuencia de Serratia sp................................................................................82   xiv     Figura 35 Sitio de corte de las enzimas PstI y Hind III......................................................88 Figura 36 Lugaren el genoma de Serratia sp. en donde se encuentra el gen del transportador de electrones clonado, secuenciado con el cebador M13............95 Figura 37 Lugar en el genoma de Serratia sp. en donde se encuentra el gen del transportador ATPasa clonado, secuenciado con el cebador M13R..................95 Figura 38 Biblioteca genómica generada con PstI para el aislamiento del gen de resistencia a tetraciclina …..………………………………………….…………………114 Figura 39 Biblioteca genómica generada con Hind III para el aislamiento del gen de resistencia a tetraciclina ………..…………………...................……………115 Figura 40 Comparación de la biblioteca genómica generada con PstI y la generada con Hind III para el aislamiento del gen de resistencia a tetraciclina…....…...116 Figura 41 Biblioteca genómica generada con PstI para el aislamiento del gen de resistencia a glifosato ……………...……………………….............…….....117 Figura 42 Biblioteca genómica generada con Hind III para el aislamiento del gen de resistencia a glifosato ………...………………………………........……..…117 Figura 43 Comparación de la biblioteca genómica generada con PstI y la generada con Hind III para el aislamiento del gen de resistencia a glifosato..................118 Figura 44 Gráfica del promedio de las curvas de crecimiento de Glifo1 y Glifo2 en escala logarítmica comparado con los controles…………………….....…….122 Figura 45 Gráfica de la función de sobrevivencia acumulada de Glifo1 y Glifo2 comparado con E.coli DH5α y Mx3………………………....……………….....123 Figura 46 Gráfica de la función de sobrevivencia acumulada de Glifo1 comparado con E.coli DH5α y Mx3……………………………………….......……..…124 Figura 47 Gráfica de la función de sobrevivencia acumulada de Glifo2 comparado con E.coli DH5α y Mx3……………………………………….......………..125 Figura 48 Arbol filogenético de los genes EPSPS encontrados y grupos de genes pertenecientes a las Enterobacterias………………………….....…………….143 Figura 49 Alineación de los genes EPSPS utilizados para el diseño   xv     de cebadores degenerados……………………………………………......……………..144 Figura 50 Alineación de la secuencia de aminoácidos de los genes EPSPS utilizados para el diseño de cebadores degenerados………………………….......…….148 Figura 51 Visualización de los productos de la primera prueba de PCR utilizando los cebadores degenerados…………………………………….....………….153 Figura 52 Tamizaje de la transformación de E.coli DH5α con el vector pCR2.1 con inserto del producto del PCR degenerado....................................................154 Figura 53 Colonias blancas PCRG inoculadas en Xgal/kanamicina y en glifosato 25 mM...............................................................................................................154 Figura 54 Crecimiento de la muestra Serratia marcescens en tetraciclina .....................155 Figura 55 Caracterización de la muestra Serratia marcescens en diferentes antibióticos.......................................................................................................155   xvi     RESUMEN El glifosato es un herbicida de amplio espectro utiizado para tratar malezas en los diferentes cultivos agronómicos. El mismo, inhibe la enzima enolpiruvil shikimato 3- fosfato sintasa, EPSPS por sus siglas en inglés. Por ser un herbicida de baja toxicidad y de excelente funcionamiento, es el herbicida de mayor demanada a nivel mundial. Gracias a herramientas genéticas, se ha podido producir cultivos transgénicos resistentes al glifosato, permitiendo la aplicación de glifosato a campos agrícolas para remover las malezas sin dañar al cultivo de interés. El objetivo de este estudio fue el aislamiento de un gen responsable de la resistencia al glifosato por medio de la implementación de dos protocolos de clonación génica y la clonación de un gen de resistencia al antibiótico tetraciclina por uno de los métodos. Para esto se utilizó una cepa Serratia marcescens resistente a 75 mM glifosato y también resistente a 1.2 µM tetraciclina, nombrada como Mx3 (Richter 2011). Para el aislamiento del gen, se utilizaron dos protocolos de clonación génica: método de biblioteca genómica y método de cebadores degenerados. Se logró la clonación de un elemento que confiere resistencia a tetraciclina por el método de biblioteca genómica utilizando la enzima PstI para la digestión parcial de ADN. Se logró la clonación parcial del elemento que confería resistencia a glifosato, por el método de biblioteca genómica utilizando también la enzima PstI para generarla. Las secuencias parciales de los elementos que confieren resistencia no permiten concluir sobre la identidad del inserto que confiere resistencia al glifosato, por lo que se debe repetir, pero sí permitieron identificar un posible transportador que puede ser responsable de la resistencia a la tetraciclina.       1   I. INTRODUCCIÓN El glifosato es un herbicida de amplio espectro y a su vez seguro en cuanto a su manejo, toxicidad y protección del medio ambiente. Desde su introducción comercial en 1974 es el herbicida de preferencia alrededor del mundo. Se transloca de manera adecuada y su acción es lenta, lo cual es una característica que se puede aprovechar para monitorear la acción del herbicida en los cultivos. El glifosato es el único herbicida que ataca la enzima 3-fosfato Enolpiruvilshikimato Sintasa (EPSPS por sus siglas en inglés) y no existe ningún herbicida análogo a éste o que pueda competir con él. El glifosato es un herbicida benigno al medio ambiente, contrario a algunos herbicidas presentes en el mercado, ya que posee una vida media ambiental bastante corta y, se une firmemente a los suelos, evitando el movimiento hacia adentro de los mismos y hacia las aguas subterráneas. Es no volátil y por esto no contribuye a la contaminación atmosférica. Además, la molécula de glifosato en sí no posee efectos en los organismos que no están destinados a ser atacados, es decir, no daña especies secundarias, con la excepción de algunos hongos (Duke 2008). El aspecto más importante del éxito que presenta el uso del glifosato ha sido la introducción de cultivos transgénicos en 1996. De esta manera se puede aplicar el herbicida en los surcos sin dañar el cultivo de interés. Casi el 90% de los cultivos transgénicos que se encuentran alrededor del mundo son resistentes al glifosato y la adopción de estos cultivos alrededor del mundo está aumentando a un paso rápido debido a que esta tecnología provee beneficios medio ambientales y otros beneficios sobre las tecnologías que lo podrían reemplazar (Duke 2008). Dentro de los beneficios se puede mencionar la contribución de los cultivos biotecnológicos a la seguridad alimentaria. En los últimos años se ha registrado un incremento de la producción agrícola valorado en 78,000 millones de dólares (1996- 2010). Los cultivos biotecnológicos han contribuido a la lucha contra la pobreza ayudando a 14 millones de pequeños agricultores alrededor del mundo. Además, el medio ambiente se ha beneficiado ya que se han ahorrado 443 millones de kg de principios activos en plaguicidas. En el 2010 se redujeron las emisiones de dióxido de carbono 1         2   (CO2) en 19,000 millones de kg. Esto equivale a retirar 9 millones de vehículos que circulan en las carreteras. También, los cultivos biotecnológicos han favorecido a la biodiversidad ya que gracias a ellos se han conservado 91 millones de hectáreas de suelo (James 2011). Se pueden encontrar bacterias con genes de resistencia al glifosato, en sus diferentes formas, en muestras de suelos donde se aplica este herbicida (Jin et al. 2008). Estas bacterias se pueden aislar de las muestras, probar su resistencia, clonar el gen e identificarlo por medio de secuenciación (Yi et al. 2007). El gen, además, puede ser insertado en otra bacteria o en plantas, en un proceso llamado transformación, generando así organismos resistentes al herbicida que antes no poseían esa resistencia a manera de aislarlo y luego poder secuenciarlo (Chaoyang et al. 2008). En Guatemala, este tipo de tecnología no se encuentra accesible a todo público debido a que la forma comercial del gen de resistencia al glifosato se encuentra patentada por la compañía Monsanto (Monsanto 2005). El precio de acceso a la tecnología es bastante elevado debido a esta patente y puesto que en Guatemala el sector agrícola representa un alto porcentaje de los ingresos al país, es importante contar con acceso a dicha tecnología. El proyecto consta de tres fases. En la primera se ha logrado aislar las bacterias, demostrar que las bacterias encontradas son resistentes al glifosato y caracterizarlas morfológica y molecularmente. La segunda fase consiste en clonar ese gen y comparar su secuencia a las secuencias patentadas a manera de encontrar uno con una secuencia diferente. La tercera fase consiste en, con el mismo gen, la transformación de una planta no resistente para que posea resistencia. La culminación de este proyecto podría ser uno de los pasos que ayudaría a que en Guatemala puedan existir otras alternativas para la utilización de la biotecnología aplicada a la agricultura.       3   Como parte de este esfuerzo, es necesario establecer la metodología para la clonación de genes que confieren resistencia a antibióticos y otros compuestos a bacterias de suelo. En este trabajo se optimizó la técnica de clonación de genes bacteriales a través del uso de cebadores degenerados y de la generación y tamizaje de bibliotecas genómicas, utilizando una cepa aislada del campo con resistencia al herbicida glifosato y resistente al antibiótico tetraciclina. A. Antecedentes 1. Glifosato a. Generalidades e historia del herbicida. El glifosato es el ingrediente activo en el herbicida Roundup  y en muchas otras marcas de herbicida que controlan un amplio espectro de especies de plantas. Este ataca una enzima que se encuentra presente únicamente en plantas y en ciertas bacterias y hongos (Dill 2005). El glifosato es aniónico a pH fisiológico y es activo como sal con varios cationes (Duke 2008). Es por esto que posee un perfil toxicológico y ambiental excelente. Sin embargo, en su aplicación destruye las especies de plantas que se encuentran cultivadas. Es por esto que hoy en día la resistencia al glifosato se ha introducido en especies cultivadas (Dill 2005). Figura 1. Molécula del glifosato (Fuente: NCBI 2011)     4   Henry Martin fue el primer científico en sintetizar la molécula de glifosato en una compañía farmacéutica suiza llamada Cilag. El glifosato nunca fue probado o patentado para su uso como herbicida hasta en 1970 cuando la compañía Monsanto lo sintetizó y probó sus propiedades herbicidas. En 1974 el glifosato ingresó al mercado de los herbicidas como un herbicida no selectivo y su popularidad aumentó por muchas de las razones que serán detalladas a continuación (Duke 2008). Actualmente la patente del herbicida glifosato ha expirado y éste se puede obtener de forma genérica (Monsanto 2005). b. Mecanismo de acción del glifosato. El mecanismo de acción del glifosato es una de las características por las cuales es uno de los herbicidas de mayor demanda. El glifosato inhibe la enzima 3-fosfato Enolpiruvilshikimato sintasa (EPSPS por sus siglas en inglés). Esta enzima cataliza la transferencia de la parte enolpiruvato de la molécula fosfoenolpiruvato (PEP por sus siglas en inglés) al compuesto 3-fosfato shikimato (S3P) (Pollegioni et al 2011). Este es un paso clave en la síntesis de los aminoácidos aromáticos y en rutas más elaboradas de hormonas y otros metabolitos de las plantas como lo son los flavonoides y otros compuesto fenólicos (Dill 2005). A continuación se muestra la ruta shikímica y el lugar donde el glifosato actúa en ella: Figura 2. Ruta skímica y lugar de inhibición del glifosato. (Fuente: Duke 2008).     5   El sitio activo de la enzima EPSPS en plantas desarrolladas es altamente conservado. El glifosato compite con PEP por el sitio de unión en la EPSPS, pero no es competitivo con respecto a S3P y esto resulta en un complejo glifosato:EPSPS:S3P que es bastante estable (Yong-Sheng et al 2010), tiene una taza de reversión bastante baja y corta la ruta metabólica en la enzima EPSPS (Dill 2005). No se tiene claro cómo la inhibición de la ruta de shikimato hace que las plantas mueran. Se cree que la inhibición de esta ruta resulta en escasez de fuentes de carbono para otras rutas metabólicas esenciales además de la no formación de los metabolitos y aminoácidos mencionados anteriormente (Duke 2008). El glifosato es un herbicida único e ideal debido a que es el único compuesto que se ha podido encontrar como un excelente inhibidor de EPSPS, sin análogos o clases químicas alternativas comercializadas que puedan atacar a esta enzima. (Dill, 2005). Una de las principales razones por las cuales el glifosato posee una excelente eficacia es su buena recepción a los sitios de crecimiento de la planta y su modo de acción lento. El glifosato se abrbe rápidamente en la superficie de la planta y se cree que éste se transporta por medio de difusión, a través de la cutícula. Luego, gracias a sus propiedades fisicoquímicas, éste es translocado desde las hojas hacia los otros tejidos de la planta, como los meristemos, raíces en crecimiento y otros órganos y tejidos activos, por medio de la vía del floema (Duke 2008). c. Toxicología y perfil medio ambiental del glifosato. En general, el glifosato es un herbicida benigno al medio ambiente. Tiene poco movimiento a hacia adentro de los suelos y aguas subterráneas ya que se une firmemente a los constituyentes del suelo. Además posee una vida ambiental corta gracias a la degradación de microorganismos del suelo del mismo y es no volátil por lo que no contamina la atmósfera (Duke 2008). En concentraciones comerciales, la molécula de glifosato por sí sola no es tóxica a animales ni humanos ya que no poseen ruta del shikimato (Pollegioni et al 2001)     6   El glifosato se utiliza en control de malezas, tanto en áreas recreacionales como en cultivos induestriales. Es menos tóxico que químicos comunes como el cloruro de sodio o la aspirina y no es una toxina reproductiva o carcinógena ni tiene alguna toxicidad crónica aguda. Utilizando el mismo, acorde con las instrucciones, no debería de presentar riesgos a la salud humana (Duke 2008). Se intentaron varios métodos de ingeniería genética y de biotecnología para poder producir cultivos con resistencia genética al glifosato hasta que en Agrobacterium sp. se encontró el gen CP4 que codificaba una forma de la enzima EPSPS. Cuando este gen CP4 se une con un promotor y se coloca en ciertos cultivos, se puede observar que los cultivos expresan altos niveles de resistencia al glifosato (Duke 2008). Existen otros métodos para desarrollar enzimas o rutas de resistencia al glifosato. como genes que codifican otras formas de la enzima EPSP, mutagénesis dirigida, evolución selectiva o tamizajes microbianos y se proponen en algún futuro enzimas de detoxificación de glifosato. Hasta el día de hoy el CP4 es el gen responsable de la resistencia al glifosato en la mayoría de cultivos comerciales (Pollegioni et al 2001). d. Utilización de cultivos transgénicos resistentes al glifosato. En Estados Unidos, la comunidad agrícola ha aprobado seis cultivos agronómicos que son resistentes al glifosato por medio de mejoramiento genético. Solamente cuatro de estos cultivos: soya, algodón, maíz y canola, están siendo cultivados en estos días (Dill 2005). El 90% de la soya cultivada en Estados Unidos es resistente a glifosato, al igual que el 100% de la soya en Argentina y en Brasil la adopción de este cultivo ha sido ráida. El 70% del algodón cultivado en Estados Unidos es resistente a glifosato al igual que el 75% de la canola en Canadá y Estados Unidos. En total, el 80% de los cultivos transgénicos en el mundo, son cultivos resistentes a glifosato (Duke 2008). A continuación se presenta un cuadro en donde se muestra el año en el que el cultivo transgénico resistente al glifosato fue adoptado en el mercado de Estados Unidos:     7   Cuadro 1 Cultivos transgénicos resistentes al glifosato que han sido deregulados en los Estados Unidos. (Fuente: Duke 2008). En la figura se muestran los cultivos transgénicos resistentes al glifosato que han sido aprobados (deregulados) por los agricultores durante los diferentes años. La letra “a“ representa los productos que han sido removidos del mercado, pero que fueron introducidos nuevamente en 2007. La letra “b“ representa los productos que fueron regresados a su estado de regulación en el año 2007 (Duke 2008). Conforme los cultivos resistentes al glifosato han sido aceptados por los gobiernos en otras partes del mundo, los agricultores en estos países han adoptado rápidamente la tecnología debido a sus extensos beneficios, como es el caso de Argentina, Brasil y Canadá. (Duke 2008). Dentro de los beneficios, se pueden mencionar los beneficios económicos, como el incremento de la productividad. En cifras, estos beneficios tienen un valor de 78,000 millones de dólares (años 1996-2010). El 40% de estos se derivan de la reducción de los costos de producción, debido a menor rotación, menos aplicación de plaguicidas y Cultivo Año de adopción Soya 1996 Canola 1996 Algodón 1997 Maíz 1998 Remolachaa 1999 Alfalfab 2005     8   disminución de la mano de obra. El 60% restante son incrementos en productividad. (James 2011). Los beneficios ambientales de la agrobiotecnología son numerosos. Economiza el suelo, ya que ésta incrementa la productividad y con esto se puede prevenir la deforestación y proteger la biodiversidad de los bosques y otros refugios naturales. En el caso de los países en desarrollo, se pierden 13 millones de hectáreas anuales de bosques tropicales ricos en biodiversidad, estas pérdidas pueden ser contrarrestadas utilizando cultivos biotecnologicos. Entre 1996 y 2010 se produjeron 276 millones de toneladas adicionales de alimentos, forrajes y fibra gracias a la agrobiotecnología, lo cual ayudó a contrarrestar las 91 millones de hectáreas de cultivos convencionales que hubieran echo falta para producir el mismo tonelaje. Si en estas tierras no hubieran existido cultivos biotecnológicos, es probable que hubieran sido tierras frágiles marginales, no adecuadas para la producción agrícola o bosques tropicales ricos en biodiversidad que hubieran tenido que ser talados para dar paso a la agricultura tradicional de los países en desarrollo, que destruye la biodiversidad (James 2011). La agricultura convencional causa grandes impactos en el ambiente y la huella ecológica puede reducirse si se utiliza la biotecnología. Desde la adopción de cultivos biotecnológicos, se ha notado una gran reducción en la aplicación de plaguicidas, un notable ahorro de combustibles fósiles, descensos en las emisiones de CO2 y una mejor conservación de suelo y humedad optimizando las prácticas agrícolas para que no haya necesidad de llevar a cabo labranza. Todo esto gracias a cultivos resistentes a herbicidas. En cuanto a los plaguicidas, la reducción acumulada de 1996 a 2010 se cifra en un 9.1%, lo que significan 443 millones de kilogramos en principios activos, es decir kilogramos de principios activos que no fueron apicados. Esto equivale a una reducción de un 17.9%, el impacto ambiental que ha sido provocado por la aplicación de plaguicidas. Según las cifras de 2010 la reducción fue de 43.2 millones de kg en principios activos y una reducción del 26.2% del impacto ambiental (James 2011).     9   2. Aislamiento y caracterización de bacterias de muestras de suelo. La biotecnología ofrece un abordaje sostenible a muchas aplicaciones industriales y medio ambientales de beneficio económicos. La biodiversidad microbiana que se encuentra en los lugares donde se llevan los procesos industriales puede ofrecer una gran oportunidad para extraer genes y proteínas de interés para aplicaciones medio ambientales e industriales (Yi-Cheng et al. 2005). a. Aislamiento de bacterias resistentes al glifosato en muestras de suelos. Se pueden extraer e aislar cepas bacterianas que presentan resistencia a glifosato en los lugares donde se aplica comúnmente este herbicida. La metodología es bastante simple. Se toman muestras de suelo del lugar donde se aplica comúnmente el herbicida (Bakken 1995). Luego las muestras son resuspendidas en ciertas soluciones que harán que los sólidos se precipiten y las bacterias queden suspendidas o se puede realizar una centrifugación para crear fracciones (Steubing 1993). Las muestras son inoculadas en placas con una concentración de glifosato 25 mM. Este es el punto de corte para determinar que una bacteria presenta resistencia al herbicida. Toda bacteria que crezca bajo esta concentración debe ser aislada a una nueva placa, separando colonias que demuestren diferencias físicas, clasificándolas por su morfología. El siguiente paso consiste en realizar curvas de crecimiento bacteriano a diferentes concentraciones de glifosato a manera de realizar un tamizaje para obtener las bacterias que puedan crecer a la mayor concentración de glifosato. Estas bacterias serán las candidatas para el aislamiento del gen (Yi-Cheng et al. 2005). 3. Mecanismos de resistencia bacteriana. a. Generalidades de los mecanismos de resistencia. La resistencia bacteriana a a ciertos compuestos, se puede definir como la capacidad de una bacteria de no ser suceptible a dicho compuesto (Luria 1943). La resistencia a antibióticos y otros compuestos en bacterias se divide en mecanismos que son intrínsecos al microorganismo o adquiridos. Los mecanismos intrínsecos de resistencia son carcaterísticas inatas de las microorganismos y se transmiten en la progenie verticalmente. Los mecanismos     10   adquiridos son aquellos que resultan en la adquisición del ADN ya sea por transformación, recombinación o adquisición de ADN extra-cromosomal. Este tipo de resistencia se transmite de manera horizontal y puede ser por la adquisición de plásmidos o transposones (Mahon et al 2007). La resistencia de bacterias a ciertos compuestos depende en la naturaleza hidrofóbica e hidrofílica de los compuestos y de la impermeabilidad del compuesto a través de a pared celular. La resistencia intrínseca depende de la composición de la pared celular, la formación de biofilms y flujos de salida (Mahon et al 2007). Para que los compuestos afecten el proceso interno celular, primero deben penetrar la pared celular de las bacterias. Existen dos estructuras fundamentales de la pared celular que llevan a resistencia relevente debido a la impermeabilidad: la composición de lipopolisacáridos y la expresión de proteínas de membrana (Mahon et al 2007). Las proteínas de membrana se llaman porinas y son proteínas encargadas de restringir el flujo de compuestos que ingresan a la célula. Éstas permiten el ingreso de nutrientes a la célula así como el egreso de productos de desecho hacia fuera de la misma (Alberts et al 2004). Pueden existir alteraciones en las porinas, las cuales llevan a una disminuación en su producción. También existen alteraciones que reducen la afinidad de los compuestos a la porina (Mahon et al 2007). Los biofilms son comunidades bacterianas que se unen de manera irreversible a un sustrato y se encuentran embebidas en una matriz poilmérica extracelular llamada glucocalix (Pommerville 2007) . La resistencia a compuestos por medio de biofilms se debe a diferentes factores, como el bajo crecimiento, el estado fisiológico de los microorganismos asociados con la expresión de genes que corresponden a estrés y la penetración e interacción del compuesto retardada a través del glucocalix extracelular (Mahon et al 2007). Las bombas de flujo de salida se encuentran tanto en bacterias gram positivas como en gram negativas. Éstas funcionan como transportadores de proteínas y además ayudan en     11   la remoción de compuestos y sustancias tóxicas desde el interior de la célula hacia el exterior de la misma. La especificidad en estas bombas puede variar ya que puede ser única a un sustrato o puede transportar múltiples sustratos (Alberts et al 2004). Existen cinco familias de proteínas de bombas de flujo de salida que están involucradas en la resistencia a compuestos: la subfamilia de facilitadores mayores, la subfamilia de nodulación de resistencia a la división celular, la subfamilia de reguladores multidrogas pequeños, la familia de transportadores ABC y la familia de multidrogas y efectos tóxicos (Mahon et al 2007). La mayoría de estas familias de proteínas funcionan por medio del movimiento de protones que crean una fuerza motriz. La única excepción es la familia de los transportadores ABC, los cuales utilizan la hidrólisis de ATP por medio de ATPasas para proveer la energía para el transporte activo de compuestos tóxicos (Becker et al 2007). Los mecanismos de flujo de salida intrínsecos se localizan en el cromosoma y se activan por medio de señales o de mutaciones en genes regulatorios (Mahon et al 2007). La resistencia a compuestos también se puede adquirir por la inactivación enzimática. Existen enzimas en las bacterias que degradan los compuestos que son tóxicos para las bacterias. Un ejemplo de esto son las enzimas beta lactamasas, las cuales hidrolizan los antibióticos beta-lactámicos como las penicilinas, cefalosporinas y carbapenems. Al hidrolizar el compuesto que es tóxico para la bacteria, éste se inactiva y no tiene efecto bactericida para la bacteria (Mahon et al 2007). Los mecanismos adquiridos, son aquellos que no se encontraban en un principio en al bacteria y se adquieren por procesos de selección natural. Ciertos organismos blanco pueden adquirir los mecanismos, evolucionar y diseminar las resistencias. Por ejemplo, en las bacterias, las bombas de flujo pueden ser intrínsecas o adquiridas. También se puede modificar el sitio blanco en el cual actúa el compuesto. Esto reduce la afinidad del blanco a el compuesto. Esto se obtiene principalmente por mutaciones en el cromosona o por alteraciones enzimáticas. Mutaciones en las enzimas blanco de los compuestos puede causar resistencias debido a que la enzima ya no reconoce el compuesto como su sustrato. De igual manera pueden existir alteraciones en enzimas que hidrolicen el compuesto que     12   es tóxico a manera que los suptroductos de esta hidrólisis ya no sean tóxicos para la bacteria (Mahon et al 2007). Los elementos de transmisión o diseminación de resistencias, que evolucionan a mejorar el intercambio y diseminación de material genético son los plásmidos, transposones, secuencias de inserción y las integrinas. Los plásmidos con ADN extracromosomal, usualmente circular que están presentes en las bacterias y estos contienen genes que codifican proteínas y ARN. Tienen la capacidad de auto-replicarse y repartirse en las células hijas durante la divisón celular (Pommerville 2007). Los transposones son elementos que codifican transposición y funciones de exicisón y pueden transponerse de un lugar del cromosoma al otro o de un plásmido a otro. La transposasa es la enzima que facilita la recombinación y ayuda el evento de transposición. Los transposones, como los plásmidos, también son capacez de llevar genes de resistencia. Las integrinas son elementos geneticos capaces de integrar genes de resistencia por medio de recombinasas codificadas en la integrina que son específicas de un sitio en particular. Las secuencias de inserción son transposones que se encuentran en bacterias y que llevan genes únicamente de las enzimas que necesitan para su propia transposición (Alberts et al 2004). b. Resistencia a antibióticos. Como se mencionó anteriormente, la resistencia a compuestos tóxicos para la bacteria puede ser de varios tipos. Ya sea enzimática, por medio de bombas de flujo, por formación de biofilms, etc. En el caso de los antibióticos, para cada familia o cada antibiótico en específico existe un mecanismo de resistencia diferente (Mahon et al 2007). En el caso de la tetraciclina, esta inhibe el crecimiento bacteriano inhibiendo la producción de ciertas proteínas. Existen tres mecanismos de resistencia a tetraciclina identificados: flujo de salida por medio de transportadores (proteínas de exportación), protección de los ribosomas y modificación de la molécula de tetraciclina (Collard, 1999). Debido a la emergencia de resistencias, el uso de este antibiótico se encuentra limitado y los primeros dos mecanismos son los encontrados con mayor frecuencia en la naturaleza. La mayoría de genes de esta resistencia se obtienen por medio de la transferencia de plásmidos o transposones (Todar, 2008).     13   Los aminoglicosidos, como la estreptomicina y kanamicina, son compuestos que se caracterizan por la presencia de un anillo aminociclitol unido a amino-azúcares en su estructura. Su actividad bactericida se atribuye a la unión irreversible a los ribosomas aunque también ha sido considerada su interacción con otras estructuras celulares y procesos metabólicos. Tienen un espectro antimicrobiano amplio y se conocen tres mecanismos de resistencia a estos antibióticos por las bacterias: alteración de los ribosomas, descenso en la permeabilidad e inactivación de los aminoglucosidos. Este último mecanismo es el de mayor importancia clínica ya que los genes que codifican las enzimas modificadores de aminoglucósidos se pueden diseminar por plásmidos o transposones. En el caso de la alteración de los ribosomas, la resistencia se da por mutaciones puntales en los genes que codifican proteínas ribosomales. La ausencia o alteración de los sistemas de transporte de los amminoglucósidos es lo que genera el descenso de permeabilidad para los mismos, lo cual genera también un potencial de membrana inadecuado. Por último, la modificación o inactivación de los aminoglucósidos se da por las cenzimas aceiltransferasas, nucleotidiltranferasas o adeniltransferasas y fosfotranferasas (Collard 1999). La resistencia a cloroanfenicol proviene del gen llamado Cat. Este gen codifica a una enzima llamada cloroanfenicol acetiltransferasa, la cual es encargada de acetilar el cloroanfenicol. Esto previene que el mismo se una al ribosoma y de esta manera ya no tiene acción sobre la bacteria, se genera la resistencia. Este tipo de resistencia se encuentra en un plásmido (Nogrady et al 2005). c. Transportadores ABC. Los transportadores ABC comprenden una de las familias más grandes dentro de las proteinas. Se encuentran en todas las especies, desde los microbios hasta los humanos y tienen varios roles importantes, especialmente en el ámbito medicinal. En los microorganismos, estos transportadores son centrales a la resistencia de antibióticos y fungicidas (Rees et al 2010).     14   El número de transportadores ABC difere entre las especies. Ciertos organismos como Ecoli, que viven en diversos ambientes y necesitan adaptarse a condiciones externas pueden tener muchos transportadores (Rees et al 2010). En general, cada transportador ABC es relativamente específico a su sutrato pero existen transportadores que son multiespecíficos como los transportadores de oligopéptidos que pueden transportar esencialmente todos los di y tripéptidos. Algunos transportadores tienen especificidad amplia hacia compuestos hidrofóbicos o se han caracterizado transportadores con especificidad a moléculas pequeñas, moléculas grandes, con muchas cargas, iones orgánicos, azúcares, aminoácidos, proteínas y polisacáridos complejos (Becker et al 2007). La diversidad en la especificidad del sutrato viene de la diversidad de roles fisiológicos que este tipo de transportadores tienen. Aunque la primera caracterización de los mismos fue en sistemas de toma de nutrientes, muchos transportadores también funcionan como exportadores. Muchos funcionan en la eliminación de productos de desecho o toxinas de la célula y en la exportación de polipéptidos (Higgins 2001). La unidad básica de un transportador ABC consiste en cuatro dominios nucleares, como se observa en la Figura 3. Frecuentemente, cada uno de los cuatro dominios está codificado como un polipeptido separado aunque en algunos transportadores los dominios pueden estar fusionados para formar un peptido con multidominos. En casos en donde el cuarto dominio aparece ausente, otro de los dominios funciona como homodimero para mantener la complementación. Los dos dominios transmembranales (TDM por sus siglas en inglés) se extienen a la membrana varias veces formando alfa-hélices putativas y éstos forman la ruta por la cual el soluto pasa por la membrana (cuadrados en la Figura 3). También determinan la especificidad del transportador utilizando sitios de unión. Los otros dos dominios, los dominios ATP (óvalos en la Figura 3) o de unión de nucleótidos (dominios ABC), son hidrofílicos y están asociados al citoplasma. Estos dominios son los que definen y delimitan la familia de los transportadores ABC (Higgins 2001). A continuación se muestra una figura ilustrando los dominios de los transportadores ABC:     15   Figura 3. Dominios de los transportadores ABC y fusión de los dominios (Fuente: Higgins 2001) En la figura, los cuadrados representan los dominios transmembranales y los óvalos representan los dominios ATP o dominios ABC. Los dominios pueden estar fusionados de varias maneras. En a) se muestra como cuatro polipeptidos separados, en b) los dominios ABC se encuentran fusionados, en c) los dominios transmembranales se encuentran fusionados, en d) un dominio transmembranal se encuentra fusionado con un dominio ABC, funcionando como homodímeros, en e) uno de los dominios transmembranales se encuentra fusionado con uno de los dominios ABC, mientras que el otro se encuentra separado y en f) los cuatro dominios se encuentran fusionados, esta es una característica de los transportadores ABC en eucariotas. Algunos transportadores ABC pueden utilizar proteínas de unión periplásmica. Éstas funcionan como dominios auxiliares y se unen al sustrato que se encuentra fuera de la célula para depositar el mismo en el complejo asociado a la membrana. Se cree que las proteínas de unión preiplásmica tienen dos funciones: la primera es dar afinidad y especificidad y la segunda conferir direccionalidad. En cuanto a la afinidad y especificidad, la mayoría de transportadores ABC que no poseen este tipo de proteínas tienen amplia especificidad, contrario a los que sí las poseen y es por esto que se cree que son las responsables de la afinidad del complejo. En cuanto a la direccionalidad, la interacción de las proteínas de unión periplásmica con el transportador afuera de la célula puede iniciar la hidrólisis de ATP en el citoplasma, esto crea cierta direccionalidad en cuanto a la entrada o salida de compuestos del complejo. Otros trasnportadores ABC     16   requieren de las proteínas de membrana externa para facilitar el ingreso de solutos al periplasma (Higgins 2001). A continuación se muestra la figura de los dominios de los transportadores ABC y las proteínas de unión periplásmica: Figura 4. Transportador ABC y proteína de unión periplásmica (Fuente: Rees et al 2010) El ciclo de transporte llevado a cabo por los transportadores ABC se inicia con la interacción del sustrato con los dominios de transmembrana de la cara intracelular de la membrana. En el caso que se estén importando compuestos, el sustrato forma un complejo con las proteínas de unión periplásmica las cuales interactúan en parte extracelular de la membrana. El sustrato se libera de las proteínas para interactuar con los dominios de transmembrana. La unión del sustrato induce un cambio conformacional en los dominios de transmembrana, el cual se transmite a los dominios ATP para iniciar la hidrólisis del ATP. Ambos dominios se requieren y ambos dominios deben hidrolizar ATP. No se sabe con exactitus cuántas moléculas de ATP se hidrolizan por molécula de sustrato, pero se cree que son dos. La hidrólisis del ATP induce cambios conformacionales en los dominios ATP, los cuales se traducen a los dominios     17   transmembranales. En el caso de las moléculas que están siendo exportadas, un sitio de unión del sutrato de alta afinidad en el interior de la membrana se reorienta para ser expuesto al exterior de la membrana, simultáneamente se afecta la afinidad del sustrato al sitio de unión, se reduce la afinidad y esto resulta en la liberación del sustraro. Finalmente el transportador debe ser reajustado y el sitio de unión se reorienta de nuevo al interior de la membrana, al igual que se afinidad es restaurada. La reorientación de un sitio de unión no significa un gran movimiento a través de la bicapa. El sitio se queda en la cara intracelular de la membrana y los cmabios conformacionales sirven para alterar la exposición del mismo a la parte extracelular del transportador. (Higgins 2001). 4. Clonación genética. a. Generalidades y bases de la clonación. En biología molecular, la clonación de ADN puede referirse a la amplificación de una secuencia de ADN particular, es decir, producir muchas copias idénticas de una molécula de ADN. También puede referirse a el aislamiento de un fragmento particular de ADN (generalmente un gen específico) del resto de ADN en la célula (Alberts et al. 2002). Sin importar el método, la clonación de moléculas de ADN da paso a moléculas de ADN recombinantes, que se mantienen en generalmente en células bacteriales (Nicholl 2008). La clonación de ADN se puede llevar a cabo de varias maneras. La más simple consiste en insertar un fragmento de ADN particular que ha sido purificado, en un elemento genético autoreplicador, como puede ser un virus o un plásmido. De esta manera se crean moléculas de ADN recombinante las cuales pueden ser introducidas en células bacterianas o virus. El fragmento se puede amplificar por medio de la replicación de los virus o bacterias el factor de veces que estos se repliquen (Alberts et al. 2002). De esta manera un virus o un plásmido se puede utilizar como un vector de clonación y el ADN propagado por la inserción se dice que ha sufrido una clonación (Nicholl 2008). Para aislar un gen específico, generalmente se inicia construyendo una biblioteca de ADN. Una biblioteca de ADN es una colección de fragmentos de ADN de una célula, tejido u organismo. Esta librería incluye por lo menos un fragmento que contiene el gen     18   de interés (Alberts et al 2002). Una biblioteca genómica debe representar el genoma completo de un organismo en una colección de fragmentos clonados que se sobreponen entre sí (Nicholl 200). Las bibliotecas pueden ser construidas por medio de un vector viral o bacteriano y generalmente son mantenidas en una población de células bacterianas. Actualmente, la mayoría de clonaciones son llevadas a cabo por medio de vectores de plásmidos (Alberts et al. 2002). Hoy en día, que muchas secuencias y genomas están disponibles, los genes pueden ser clonados directamente sin la necesidad de construir bibliotecas de ADN. La clonación es posible debido a la técnica de la reacción de cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés). PCR permite que el ADN de una región selecta en un genoma sea amplificada, “purificando“ el fragmento de ADN del genoma restante (Alberts et al. 2002). b. Clonación de genes utilizando el método de biblioteca genómica. La clonación de ADN, sin importar el método a utilizar, produce una población de moléculas de ADN recombinante, generalmente introducidas en un plásmido y mantenida en células bacterianas (Alberts et al 2002). La colección de los clones independientes se conoce como biblioteca genómica. Estas son grupos de clones que representan el genoma entero de un organismo y la producción de estas bibliotecas es usualmente el primer paso en aislar una secuencia de ADN específica del genoma de un organismo (Nicholl 2008). Los fragmentos a clonar deben, idealmente, ser generados por un procedimiento que sea independiente a la secuencia, de esta manera se puede asegurar que los fragmentos son generados al azar y que no hay una tendencia hacia alguna secuencia en particular. Finalmente, los fragmentos clonados se deben mantener en una forma estable (Nicholl 2008). La primera consideración para construir una biblioteca genómica es el número de clones requeridos. Esto depende de muchos factores, principalmente el tamaño del genoma. Un genoma pequeño, como el de E.coli requiere menos clones que un genoma grande, como el genoma humano. El tipo de vector es importante ya que éste determinará     19   el tamaño de los fragmentos que pueden ser clonados. El tamaño de la biblioteca puede ser calculado con las bases de la probabilidad de una secuencia particular siendo representada en la biblioteca. La fórmula: N = ln(1-P)/ln(1-a/b) (Nicholl 2008) predice el número de clones necesarios. “N” es el número de clones requeridos, “P” representa la probabilidad deseada de una secuencia particular a representar (siendo casi siempre 0.95 o 0.99), “a” es el tamaño promedio de los fragmentos de ADN que se desean clonar y “b” representa el tamaño del genoma. Utilizando esta fórmula, es posible determinar la magnitud del experimento y planear la estrategia de clonación de acuerdo a esto (Nicholl 2008). Uno de los aspectos más importantes de la producción de bibliotecas es la generación de los fragmentos de ADN a clonar. Es importante que los fragmentos no sean muy pequeños ya que esto da posibilidad a que se generen demasiados insertos y cuando se realice la ligación estos se peguen en secuencias continuas al vector . Es por esto que el método de fragmentación es importante. La fragmentación generalmente se lleva a cabo por digestión parcial enzimática o por métodos mecánicos. Luego los fragmentos se deben ligar al vector de elección (Nicholl 2008). Luego de la digestión la muestra puede ser purificada. Se pueden utilizar métodos de centrifugación o los fragmentos se pueden extraer de un gel de electroforesis. Se buscan los fragmentos con el tamaño deseado y se seleccionan para la ligación. El ADN a ligar en el vector puede ser tratado con una fosfatasa para reducir la ligación de el mismo o la concatenación. El vector debe ser digerido con enzimas para generar extremos cohesivos para clonar (Alberts et al 2002). El ADN recombinante, luego de la ligación, está listo para ser introducido en las células en las cuales se va a mantener y las características genéticas pueden ser seleccionadas     20   utilizando técnicas de selección y tamizaje acordes al vector utilizado y al gen que se desea clonar (Nicholl 2008). A continuación se muestra una figura con los pasos del método de clonación génica por medio de la producción de una biblioteca genómica: Figura 5. Pasos a seguir para crear una biblioteca genómica. (Fuente: Alberts et al. 2004). c. Clonación de genes utilizando el método de cebadores degenerados. Los cebadores degenerados son aquellos que poseen un número de opciones de bases nitrogenadas en varias posiciones en la secuencia de los mismos para así permitir alineamiento y amplificación de una gran variedad de secuencias relacionadas. En realidad, son un grupo de cebadores que tienen distintas opciones de bases nitrogenadas en cierto lugar específico del cebador. Un ejemplo de una secuencia de un cebador degenerado podría ser:     21   5’ – TCG ATT TCI CCY AAY TGR CCN T- 3’ (Cortazar 2004) En donde la “A” representa adenina, “C” las citosinas, “G” las guaninas y “T” las timinas. “Y” representa la opción de pirimidinas (en ese espacio puede haber una C o una T), la “R” representa la opción de purinas (puede ser A o G), “I” las inosinas (C,G,A,T) y “N” nucleótidos (C,G,A,T) (Cortazar 2004). Los cebadores degenerados se pueden utilizar en la amplificación de las secuencias conservadas de uno o varios de genes del genoma de un organismo o para conseguir la secuencia de nucleótidos luego de haber llevado a cabo una secuenciación de aminoácidos de una proteína de interés. Se pueden utilizar para amplificar secuencias de regiones conservadas entre especies, las secuencias amplificadas pueden ser secuenciadas y luego se pueden realizar comparaciones (Linhart et al 2002). También se pueden utilizar como sondas para amplificar genes de interés de una biblioteca genómica o biblioteca de ADN (Cortazar 2004). El diseño de los cebadores degenerados el relativamente sencillo. Primero se deben recuperar secuencias de aminoácidos de proteínas similares y homólogas que correspondan al gen de interés. Las secuencias se alinean y se buscan las regiones conservadas. La alineación también puede ser a nivel de nucleótido y estas alineaciones ayudan a determinar el tamaño previsto del producto de la reacción de PCR (Cortazar 2004). Los cebadores se diseñan a partir de las regiones conservadas y estos deben tener por lo menos 20-30 nucleótidos de longitud. La degeneración de los cebadores depende de muchos factores, la más importante la secuencia. Si ciertas bases no son conservadas en el lugar en donde se quiere diseñado el cebador, estas se dejan abiertas para tener la opción de una o más bases en ese sitio específico (es aquí en dónde se utilizan las letras “Y”, “X”, “N”, etc.), esto produce la degeneración (Linhart et al 2002). Conforme la degeneración aumente, la concentración de un cebador específico disminuirá, es por esto que se debe ser cuidadoso en no degenerar mucho los cebadores. En general esta técnica     22   es una técnica bastante confiable si el diseño se realizó de la manera adecuada (Cortazar 2004). Luego que se ha llevado a cabo la amplificación de la secuencia deseada, los pasos ha seguir el la clonación son relativamente los mismos a cuando se realiza la biblioteca genómica. Los fragmentos se separan en gel de agarosa, se extrae el fragmento de interés, éste se liga al vector de preferencia y luego el ADN recombinante se inserta en las células que lo acarrearan y se pueden hacer selecciones y tamizajes, según el vector y el inserto (Nicholl 2008). d. Clonación del gen de glifosato. Genes de resistencia al glifosato han sido clonados de varias fuentes. En un estudio llevado a cabo el la universidad estatal de Louisiana se clonó el gen de resistencia al glifosato presente en una cepa de Pseudomonas sp. En este estudio se extrajo el ADN cromosomal y los plásmidos de la cepa. Se creó una biblioteca de ADN en vectores lambda. La biblioteca entera fue secuenciada y por medio de ella y bioinformática se determinó en donde se encontraba el gen de interés. Gracias a esta identificación, el gen se mantuvo el plásmidos bacteriales y se clonó en células bacterianas (Fitzgibbon et al. 1990). Según Yi-Cheng (2005) de la Universidad de Pekín, otra manera de clonar el gen del glifosato es aislando el ADN cromosomal de la bacteria. El ADN es digerido con enzimas de restricción y luego los fragmentos pueden ser ligados a un plásmido con puntas cohesivas (cósmidos). La librería de los cósmidos se mantiene en colonias de E.coli y se realiza una secuenciación de los fragmentos para determinar en dónde se encuentra el gen de interés. Se extrae el ADN con el gen de interés y se amplifica por medio de PCR. Con el ADN amplificado se crean plásmidos recombinantes para poder realizar la transformación. Las células transformadas se deben inocular en placas con glifosato hasta determinar si la bacteria ha alcanzado el nivel de resistencia a glifosato que se esperaba. Otro estudio, llevado a cabo en la Academia de Ciencias Agriculturales en, Shanghái, China, utiliza técnicas de clonación básicas para el aislamiento del gen de resistencia al     23   glifosato. Para aislar el gen de una bacteria resistente al glifosato de la especie Ochrobactrum anthropi construyeron una biblioteca genómica con fragmentos de 2 a 4 kb del genoma de la bacteria, obtenidos por medio de enzimas de restricción. Los fragmentos se insertaron en el vector pUC18 el cual fue digerido con la enzima de restricción BamHI. La mezcla de la ligación fue transformada en células E.coli ElectroMax DH10B T1 por medio de electroporación. Los clones se inocularon en placas con agar LB y luego fueron seleccionados por su habilidad de crecer en medio con concentración 60 mM de glifosato. Los clones seleccionados fueron secuenciados y analizados (Yong-Sheng et al. 2010). 5. Transformación bacteriana y de plantas con el gen de interés a. Transformación bacteriana. La transformación bacteriana es el proceso en el que las bacterias incorporan moléculas de ADN libres. Si el ADN desconocido posee un origen de replicación reconocido por las polimerasas de ADN de la célula, la bacteria replicara el ADN desconocido en conjunto con su propio ADN. Cuando la transformación es acoplada con técnicas de selección por antibióticos, las bacterias pueden ser inducidas a incorporar ciertas moléculas de ADN y luego esas bacterias pueden ser seleccionadas de las que no incorporaron el ADN externo (Roe 2001). Existen cuatro métodos básicos utilizados para la transformación bacteriana: transformación natural, transformación utilizando células competentes preparadas químicamente, electroporación y conjugación (Schweizer 2008). En el estudio realizado en la Universidad de Pekín, se aisló el gen de resistencia de glifosato de Pseudomona putida aislada de muestras de suelo de un ambiente contaminado. El gen aislado es clonado e insertado en bacterias E.coli XL1 Blue. En este estudio se utiliza el método de la transformación por medio de células competentes para transferir el gen de resistencia al glifosato unido a un plásmido a las bacterias E.coli XL1 Blue, lo que demuestra que por métodos convencionales de laboratorio las transformaciones pueden ser llevadas a cabo de manera sencilla si ya se tiene el gen de interés clonado (Yi-Cheng et al. 2005).     24   b. Transformación de plantas y Agrobacterium. Además de la transformación bacteriana, existe también la transformación de plantas mediada por bacterias. La transformación genética mediada por la bacteria Agrobacterium es la tecnología dominante utilizada para la producción de plantas modificadas genéticamente. Agrobacterium transforma genéticamente a su hospedero transfiriendo un segmento definido de ADN desde su plásmido llamado Ti (inductor de tumores) hasta el genoma de la célula huésped. La generación y el transporte del ADN bacterial hacia la célula hospedera ha logrado que se existan muchas cepas de Agrobacterium recombinantes ya que el gen de interés puede ser insertado en el plásmido Ti de Agrobacterium, creando un plásmido recombinante, y luego transferir ese ADN a la planta (Tzfira et al. 2006). A continuación se muestra la figura del método de transformación de plantas utilizando Agrobacterium sp: Figura 6. Transformación de plantas mediada por Agrobacterium tumefaciens. (Fuente: Zamundio 2005). La bacteria Agrobacterium tumefasciens posee un plásmido llamado Ti en el cuál se puede insertar el gen de interés (región roja en la figura) en la transformación. Agrobacterium posee la capacidad de poder transferir su ADN a la célula hospedera,     25   transfiriendo así el gen de interés a la planta. Este gen de interés podría ser el gen de resistencia a un herbicida (Zamundio 2005). En la Universidad de Zhejigang, se llevó a cabo un estudio en donde se generaron plantas de arroz transgénicas utilizando un gen de glifosato nuevo extraído de Pseudomona putida como gen de interés. La transformación fue llevada a cabo por medio de Agrobacterium. La transformación fue llevada a cabo de manera satisfactoria ya que las plantas presentaron la resistencia al glifosato que se esperaba. (Chaoyang et al. 2008) 6. Proyectos actuales en Guatemala con relación al aislamiento de genes en bacterias resistentes al glifosato. Actualmente, en Guatemala se lleva a cabo un proyecto de clonación del gen de glifosato que será extraído de bacterias de muestras de suelo de la finca de piña de Agropecuaria Popoyán ubicada en el kilómetro 101 carretera a Mazatenango. El proyecto consiste en extraer bacterias de suelos en donde se aplica el glifosato como herbicida de preferencia. Aislar las bacterias que presenten crecimiento a altas concentraciones de glifosato, identificarlas molecularmente por medio de su secuencia ADNr 16s, clonar el gen de resistencia al glifosato y compararlo con secuencias de genes que se encuentren patentados. Luego se busca transformar una bacteria que no posea resistencia a manera de probar los mecanismos de la transformación y finalmente transformar una planta no resistente para que posea resistencia y el herbicida pueda ser aplicado a su alrededor sin dañar la planta. El proyecto se encuentra financiado por el FODECYT y se encuentra en la fase de caracterización molecular de las bacterias resistentes (Richter 2011). 7. Importancia del estudio y del desarrollo de la tecnología en Guatemala. Como se mencionó anteriormente, en Guatemala ya se llevan a cabo estudios con el gen de resistencia al glifosato a manera de clonar el gen y brindar la tecnología para crear plantas transgénicas resistentes al glifosato (Stein datos no publicados). Las normas regulatorias actuales dictan que dadas a las patentes de Monsanto sobre el gen de resistencia al glifosato la tecnología para utilizar productos transgénicos con esta resistencia llega a costos de $50 a $100 millones de dólares. (Dill 2005) Es por esto que la     26   generación de un gen de resistencia al glifosato diferente a la forma patentada sería un gran ingreso para las compañías de Guatemala que patenten o vendan la nueva forma del gen. (Stein Mayo 2012) A. Justificación El sector agrícola en Guatemala es responsable de 35.1% (aprox.) del Producto Interno Bruto (PIB) del país (Cardona 2006). Por ende, las buenas prácticas agrícolas y las tecnologías que incrementan la productividad juegan un rol importante para la economía nacional. Los cultivos resistentes al glifosato mejoran la productividad contribuyendo así a la seguridad alimentaria. Además, son de baja toxicidad y benignos al medio ambiente, reduciendo el impacto ambiental que provocan las prácticas agrícolas convencionales(James 2011). Así mismo poseen otros beneficios sobre las tecnologías que la podrían reemplazar. Por tal razón se busca aislar un nuevo gen resistente al glifosato, de una forma diferente a la que se encuentra patentada y de esta manera hacer accesible la tecnología para el sector productor agrícola del país. El aislamiento del gen permitirá a futuro incentivar al sector agrícola a utilizar el glifosato como herbicida de baja toxicidad para que éste reemplace a los herbicidas de alta toxicidad. Además el desarrollo de esta tecnología probaría que en Guatemala existen genes diferentes los cuales poseen las características necesarias para ser utilizados comercialmente y que en Guatemala es posible desarollar este tipo de tecnologías, las cuales traen beneficios económicos y medioambientales a países desarrollados. La primera fase de este proyecto ya ha sido llevada a cabo y se han aislado e identificado bacterias que poseen un alto espectro de resistencia al glifosato (concentración milimolar de glifosato en placa). Se identificó una Serratia marcescens resistente a 75 mM glifosato y a tetraciclina 1.2 µM (Richter 2011). La resistencia a tetraciclina es un rasgo común y caracterizado para una variedad de bacterias, por lo que puede ser utilizado como control interno de clonación. La clonación de los genes de resistencia a glifosato y tetraciclina, así como la transformación de plantas, pueden llevarse a cabo con métodos convencionales de laboratorio de biología molecular y utilizando ingeniería genética, por lo que la investigación es factible. El llevar a cabo este     27   proyecto en Guatemala, beneficiará al sector agrícola ya que provee la alternativa de utilizar esta nueva tecnología que se ha adoptado en muchas partes del mundo en cultivos variados y que provee beneficios ambientales. Adicionalmente, fortalecerá la capacidad instalada y expertaje en técnicas de ingeniería genética, contribuyendo al desarrollo de nuevas tecnologías en el país. B. Objetivos 1. Objetivo general Aislar un gen responsable de la resistencia al glifosato por medio de la implementación de dos protocolos de clonación génica. 2. Objetivos específicos a. Validar un protocolo de clonación por biblioteca genómica utilizando una Serratia marcescens resistente a 75 mM glifosato como muestra y resistente a el antibiótico tetraciclina como control. b. Validar un protocolo de clonación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) utilizando una cepa resistente al glifosato como muestra. c. Secuenciar los fragmentos clonados para determinar por medio de BLAST, si este fragmento corresponde a un gen completo o parcial y determinar su identidad.     28   II. MATERIALES Y MÉTODOS A. Métodos El procedimiento de la validación de dos protocolos de clonación génica para aislar el gen responsable de la resistencia al glifosato proveniente de bacterias aisladas de muestras de suelos guatemaltecos se muestra sumarizado en el diagrama de flujo de la siguiente figura: Figura 7. Diagrama de flujo del procedimiento de la metodología. 28       29   1. Aislamiento del gen de resistencia al glifosato y a la tetraciclina por el método de biblioteca genómica. a. Caracterización de la muestra Serratia marcescens. Como muestra, se utilizó una bacteria Serratia marcescens resistente a 75 mM glifosato (Richter 2011). Esta bacteria además se caracterizó en diferentes antibióticos para determinar si existía resistencia a los mismos. La bacteria fue inoculada en placas de LB con tetraciclina 1.2 µM, kanamicina 0.103 µM, estreptomicina 0.085 µM y cloroanfenicol 0.092 µM (Sambrook et al. 2001). Se utilizó la resistencia a tetraciclina como un control interno del método. Esto es porque la resistencia a tetraciclina es la resistencia más común dentro de los microorganismos y la más caracterizada (Mahon et al 2007). Esto quiere decir que se sabe la concentración a la cual un organismo se considera resistente a la misma y además se sabe que este rasgo es típicamente conferido por transportadores. De esta manera se intentó clonar dos rasgos del mismo genoma, de manera que si la clonación es exitosa se podría validar el método de clonación. (Apéndice I). b. Extracción y cuantificación de ADN genómico. Para la extracción de ADN genómico de la muestra (Serratia marcescens resistente al glifosato y a tetraciclina) se utilizó el kit Purelink™ Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, K 1820-00, EEUU) según las instrucciones del fabricante. Este kit utiliza soluciones tampón que permiten la lisis simple con la ayuda de la enzima Proteinasa K, sin la necesidad de realizar lisis celular mecánica. El ADN luego se une a una membrana de silica y éste es purificado utilizando columnas y procedimientos de centrifugación (Eppendorf, Minispin). Se inició recolectando 2x109 de células bacterianas (aprox. 1 mL de cultivo ON de células E.coli) por centrifugación. Luego se resuspendió el precipitado en 180µL de solución tampón de digestión PureLinktm y se agregaron 20µL de proteinasa K PureLinktm, se vortexearon para mezclar bien. Las muestras se incubaron a 55º C por una hora, vortexeando ocasionalmente. Luego de esto, se agregaron 20µL de ARNasa al lisado, se mezcló por medio de vortex y se incubaron las muestras a temperatura ambiente por dos minutos. Se agregaron 200 µL de solución tampón de unión PureLinktm y se mecló bien utilizando el     30   vortex para obtener una solución homogénea. Se agregaron 200µL de etanol al 100% al lisado, se mezcló con vortex por cinco segundos para obtener una solución homogénea. Agregar el lisado (aprox. 640) a una de las columnas del kit con un tubo colector, se centrifugó la columna a 10,000 x g por un minuto a temperatura ambiente. Se descartó el tubo colector, se colocó uno nuevo y se agregaron 500µL de solución tampón de lavado 1 a la columna. La columna se centrifugó a 10,000 x g por un minuto a temperatura ambiente. Se descartó el tubo colector y se colocó uno nuevo en la columna, luego se agregaron 500µL de solución tampón de lavado 2. Se centrifugó la columna a velocidad máxima (13,500 x g) por tres minutos a temperatura ambiente. Se descartó el tubo colector y se colocó la columna en un tubo estéril de 1.5 mL. Se agregaron 100µL de solución tampón de elución PureLinktm, se incubaron la smuestras a temperatura ambiente por un minuto, se centrifugó la columna a máxima por un minuto a temperatura ambiente, el ADN recuperado se cuantificó. La cuantificación del ADN extraído se realizó por medio de espectofotometría, realizando una dilución 1:10 de ADN extraído en agua, se realizaron lecturas a 260, 280 y 320 nm, en un espectofotómetro (Agilent, 8453), utilizando una celda de cuarzo de 5 µL y 10 mm (Agilent, 5063-6565), calculando así la concentración del ADN extraído (Invitrogen, K 1820-00, EEUU). Algunas muestras fueron visualizadas por medio de electroforesis, la cual se realizó en gel de agarosa al 0.8% en solución tampón TBE (Tris base 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM pH 8) en concentración 1X, separado también en TBE 1X a 90 Volts/cm por 50 minutos. Para visualizar la electroforesis se utilizó tinción con Gel Red (Biotium, 41003), preparado según las instrucciones del fabricante en 100 mL, por 40 minutos y se visualizó en una cámara de luz UV (UVP, 950415-01). Se tomó la fotografía del gel utilizando una campana oscura (UVP Phto Doc-it imaging system 60, 97-0274-01) y una cámara fotográfica marca Canon modelo Powershot A480 (Sambrook et al. 2001). La extracción de ADN se inició con 1 mL de cultivo ON (cultivo “overnight”, cultivo dejado toda la noche a 37º C con agitación 25 rpm (MaxQ 4000, Barnstead Line), en 3 mL de caldo nutritivo) utilizando el kit. Se intentaron varias modificaciones al kit: realizar lavados de los precipitados bacterianos con caldo nutritivo, iniciar con 500 µL,     31   750µl, realizar diluciones 1:10 y medir en espectofotómetro la densidad bacteriana a 600 nm, a manera de optimizar la extracción. Para el protocolo de extracción de ADN con Trizol, se inició con 1 mL, 500 µL, 400 µL de cultivo bacteriano ON tanto del control como de la muestra en caldo nutritivo, a manera de intentar variaciones en el protocolo para su optimización. Luego las células bacterianas se precipitaron centrifugando 90 segundos a 8,600 g (Accuspin micro 17R, Fischer). Se agregaron 0,75mL de Trizol (Invitrogen, 15596-026) y las células se lisaron utilizando un homogenizador (Pyrex). Las muestras se incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente, luego se agregaron 0,2 mL de cloroformo y se agitaron las muestras por 15 segundos. Las muestras se incubaron por 3 minutos a temperatura ambiente, se centrifugaron a 12, 000 g (Accuspin micro 17R, Fischer) por 15 minutos a 4º C y se removió la fase acuosa de la solución (fase superior), se agregaron 300 µL de etanol al 100% y los tubos se mezclaron por inversión. Las muestras se incubaron por 3 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifugaron a 12, 000 g (Accuspin micro 17R, Fischer). por 5 minutos a 4º C para precipitar el ADN. Se removió el sobrenadante y se realizó el lavado del precipitado. Para este lavado se agregó 1 mL de solución de citrato de sodio/etanol (0.1 M citrato de sodio en 10% etanol, pH 8.5) el precipitado anterior, se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron las muestras a 12, 000 g (Accuspin micro 17R, Fischer) por 5 minutos a 4º C. Se removió y descarto el sobrenadante. Este lavado se repitió una vez más. Luego se agregaron 1.5 mL de etanol al 75% y las muestras se incubaron 10-20 minutos a temperatura ambiente, se mezcló y se centrifugó a 12,000 g (Accuspin micro 17R, Fischer) por 5 minutos a 4º C. Se removió el sobrenadante, se secó el precipitado por 10 minutos al aire y el ADN se resuspendió en solución tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH8, EDTA 1 mM). La cuantificación del ADN se realizó por medio de espectofotometría, como se mencionó anteriormente (Invitrogen, Trizol Reagent, 15596-026) El protocolo de extracción de ADN utilizando cloroformo y alcohol isoamílico se inició centrifugando 1.5 mL de cultivo ON, tanto de la muestra como del control, 90 segundos a 8, 000 g . Luego el precipitado fue resuspendido en 500 µL de solución     32   tampón TE y se centrifugó a velocidad máxima por 1 minuto. Se descartó el sobrenadante y se agregaron 250 µL de solución de lisis (SDS 0.5%, proteinasa K 20 µg/mL), se agitó y luego incubó por 15 minutos a 56º C. Las muestras fueron agitadas y se agregaron 250 µL de cloroformo:alcohol isoamílico (1:1), se centrifugaron a 8, 500 rpm por 15 minutos y la fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo. A esta fase acuosa se agregaron 350 µL de etanol 100%, se mezcló y luego se centrifugó 10 minutos a 10, 000 rpm. Para precipitar el ADN se agregaron 1/10 volúmenes de acetato de sodio y 2.5 volúmenes de etanol 100%. Las muestras se mezclaron por inversión y luego se centrifugaron a máxima velocidad por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante y el precipitado se resusendió en 300 µL de agua destilada estéril. Estos pasos de la precipitación, se repitieron una segunda vez y luego el precipitado se lavó con 500 µL de etanol al 70%. Por último se realizó una centrifugación rápida, se descartó el etanol, se secó el precipitado al aire por 5 minutos y se resuspendió el mismo en solución tampón TE. A manera de optimizar el protocolo, se intentaron modificaciones del mismo: se inició con 100, 250, 500, 750 µL de cultivo, al igual que se cambió la proporción de cloroformo: alcohol isoamílico 1:1 a 1:24 (Stein M, curso de Biología Molecular). La cuantificación del ADN obtenido por este método se realizó por medio de espectofometría, como mencionó anteriormente. Con ninguna de estas modificaciones se obtuvo los resultados esperados (Apendice, Cuadro 5), es por esto que se intentó la optimización del kit una vez más. En este caso, se inició con 500 µL de cultivo ON, la modificación fue que el cultivo ON se dejó ocho horas de incubación en lugar de diez horas. La cuantificación de ADN por este método se realizó en espectofotometría y el ADN se visualizó por electroforesis (con las condiciones mencionadas anteriormente), se obtuvieron resultados positivos (Apéndice, Cuadro 6) y es por esto que se tomó como optimizado el protocolo y se siguió a la digestión del ADN genómico. c. Extracción del plásmido pUC19. Se extrajo plásmido pUC19 de cepas bacterianas E.coli DH5α (Invitrogen, 18258-012). Para esto se utilizó el kit PureLink™ HiPure Plasmid DNA Purification Kits (Invitrogen, k2100-2, EEUU) según las instrucciones del fabricante. Si inició con 20 mL de cultivo ON de células E.coli DH5α y     33   ee utilizó la modalidad “Midiprep” del kit. El kit utiliza una resina de intercambio de aniones para purificar el ADN plasmidial. Las células primero se recolectan y se resuspenden en una solución tampón con ARNasa, luego la lisis celular se realiza utilizando detergentes. La precipitación se lleva a cabo utilizando solución tampón con acetato de potasio y el lisado se clarifica por medio de centrifugación. El lisado pasa por una columna de intercambio de aniones en donde, los fosfatos cargados negativamente en la estructura del ADN interactúan con las cargas positivas de la superficie de la resina. El plásmido se mantiene unido a la resina y las proteínas, ARN, carbohidratos y demás impurezas se lavan utilizando una solución tampón. El plásmido se eluye de la columna por medio de una solución tampón alta en sales. Luego se eliminan las sales y se concentra por precipitación con etanol (Invitrogen, k2100-2, EEUU). A continuación se muestra la figura del plásmido pUC 19: Figura 8. Plásmido pUC19. (Fuente: Feinbaum 2001). d. Digestión del ADN genómico y del plasmido con enzimas de restricción. El ADN genómico extraído de la muestra con anterioridad fue digerido por medio de enzimas de restricción. Se seleccionaron enzimas de restricción que cortan aproximadamente cada 4000 kilobases (kb) en el genoma bacteriano a manera de obtener     34   fragmentos de 4 kb. Esto fue calculado a partir de una estimación de el tamaño de genoma de la bacteria Serratia marcescens (No. de accesión PRJNA59561) (NCBI, 2012) y la estimación del tamaño del gen de resistencia al glifosato en una bacteria el cual es de 2 kb (NCBI, 2010), a manera que el gen quede dentro de esos fragmentos. La restricción se realizó siguiendo las especificaciones del fabricante de cada una de las enzimas, en un volúmen total de reacción de 80 µL. Las enzimas a uttilizadas fueron: Hind III (New England Biolab, R0104S y PstI (New England Biolab, R0140S). La digestión realizada con las enzimas PstI y Hnd III fue una digestión parcial del ADN. Para esto se realizó la digestión siguiendo las especificaciones del fabricante pero incubando a 30, 60, 90 y 120 minutos a 37º C en una incubadora marca Lab-line, modelo Imperial III (New England Biolab, R0140S y R0140S). Luego se visualizaron los productos de la digestión por medio de electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% en TBE, corrido en solución tampón TBE por 4 horas a 100 V/cm. El gel fue teñido con tinción Gel Red por 40 minutos y visualizado con cámara de luz UV, como se mencionó con anterioridad (Biotium, 41003),. El plásmido fue digerido con cada una de las enzimas (la misma enzima utilizada para digerir parcialmente el ADN genómico a manera de producir extremos cohesivos para la ligación) en el “Multi Cloning Site” (MCS) a manera que los fragmentos de ADN genómico cortados de las bacterias resistentes se pudieran ligar a ese sitio para formar una biblioteca genómica de cada una de las bacterias. La restricción se llevó a cabo siguiendo el protocolo de cada una de las enzimas de restricción mencionadas anteriormente (PstI y Hind III), en un volúmen total de reacción de 80 µL, incubando a 37º C. Se siguió el protocolo indicado por el fabricante (New England Biolab, R0140S y R0140S) (en colaboración con Claudia Paiz). El producto de la reacción se visualizó por medio de electroforesis, en gel de agarosa al 0.8% en solución tampón TBE, corrido también en TBE a 90 voltios por 50 minutos. El gel fue teñido por tinción Gel Red durante 40 minutos y luego visualizado en cámara UV, como se mencionó con anterioridad (Biotium, 41003),     35   También el plásmido fue tratado con la enzima fosfatasa antartica (New England Biolab, M02988) para eliminar los fosfatos de los extremos del plásmido e impedir que éste se pudiera volver a ligar consigo mismo. Para esto se realizó la digestión siguiendo las indicaciones del fabricante de la enzima en un volúmen de reacción de 80 µL (New England Biolab, M02988) (en colaboración con Claudia Paiz). e. Purificación de la digestión parcial de ADN genómico y de la digestión de pUC19. Para la purificación de ADN genómico digerido y de pUC19 se agregaron 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3M pH 5.2 a ada uno de los tubos de reacción. Luego se agregaron 2.5 volúmenes de etanol al 100%, las muestras se agitaron y el ADN se dejó precipitando a -20º C por 24 horas. Luego, las muestras se centrifugaron 20 minutos a 12, 000 g (Accuspin micro 17R, Fischer) a 4º C, se agregó 1 mL de etanol al 70% frío y se centrifugaron 10 minutos a 12, 000 g (Accuspin micro 17R, Fischer) a 4º C. Se descartó el sobrenadante y se secó el precipitado a temperatura ambiente por 10 minutos. El precipitado se resuspendió en 25 µL de solución tampón TE (Sambrook et al. 2001). La cuantificación de esta precipitación se realizó por medio de espectofotometría, se realizó una dilución 1:10 de ADN con agua destilada y ultrapura, se realizaron lecturas a 260, 280 y 320 nm, calculando así la concentración del ADN, como se mencionó anteriormente (Apéndice, cuadro 17). f. Ligación de los fragmentos al plásmido PUC19. Los fragmentos de ADN genómico se ligaron al plásmido PUC19 por medio de la enzima T4 ligasa de ADN (New England Biolabs, M0202S, EEUU). Se siguieron las instrucciones del fabricante, en un volúmen total de reacción de 10µL, se modificó el protocolo incubando a temperatura ambiente durante 24 horas y luego se realizó la inactivación de la enzima según el fabricante. Se intentó ligar en varias proporciones vactor:inserto a manera de determinar cuál era la mejor proporción para la transformación. Las proporciones vector:inserto utilizadas fueron 1:5, 1:2, 1:1 y 1:0.5 (New England Biolabs sin año).     36   g. Transformación de células E.coli DH5α, selección y tamizaje de las células transformadas. El producto de la ligación fue introducido en bacterias E.coli DH5α por medio de una transformación. La transformación se realizó utilizando el kit MAX Efficiency® DH5 α™ Competent Cells (Invitrogen, 18258-012, EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células del kit han sido preparadas para ser competentes por medio del procedimiento de Hanahan. (Invitrogen, 18258-012, EEUU). El protocolo del kit se basa en el método de transformación por choque térmico. Se agregaron 40 µL de agua a la reacción de ligación para diluir 5 veces. Se realizaron los cálculos para determinar que el ADN se encontrara en una concentración en el rango de 1-10 ng/µL. Luego se tomaron 50 µL de células compententes y se agregó 1 µL de la dilución de la reacción de ligación, se incubó en hielo por 30 minutos, luego se realizó el choque térmico 45 segundos a 42º C (Precision, 180 Series Water Bath) y luego se incubó de nuevo 2 minutos en hielo. Se agregaron 250 µL de medio SOC (provisto por el kit) y se incubó 1 hora a 37º C con agitación a 2500 rpm (Sambrook et al. 2001). Para cultivar las bacterias transformadas en placa también se siguieron las indicaciones del kit MAX Efficiency® DH5 α™ Competent Cells (Invitrogen, 18258-012, EEUU). Todos los crecimientos bacterianos se realizaron a 37º C. El tamizaje se realizó inoculando 25 µL del cultivo en 12 placas con Xgal (50 µg/mL) y ampicilina (50 µg/mL) a manera de poder distinguir las colonias que poseen inserto, las cuales aparecerán con una coloración blanca ya que el gen de la betalactamasa (lacZ), que se encuentra en el plásmido pUC19, se encuentra interrumpido. Las colonias con coloración azul, son colonias que no poseen inserto ya que el gen de la betalactamasa (lacZ) se encuentra intacto. Las placas poseían ampicilina para asegurar que crecieran únicamente las bacterias que poseían el plásmido pUC19, por lo tanto resistencia a ampicilina (Grooms 2009). La selección se realizó, inoculando 100 µL del cultivo en placas con tetraciclina 1.2 µM a manera de seleccionar únicamente las bacterias que tuvieran como inserto en pUC19 el gen de la resistencia a tetracilina clonado. En el caso de la biblioteca genómica     37   para aislar el gen de resistencia a glifosato, se inocularon 100 µL de cultivo en placas con 50 mM de glifosato (Roundup, 35.6 SL) y luego se ajustó la concentración de glifosato y se inocularon placas 25 mM de glifosato. Esto a manera de seleccionar únicamente las bacterias que tuvieran el gen de resistencia al glifosato clonado (Stein M, curso de Ingeniería Genética). Se sembró toda la reacción de transformación en las placas, a manera de no dejar ningún clon sin ser inoculado. A continuación se muestra un cuadro resumiendo los cultivos bacterianos realizados: Cuadro 2 Cultivos bacterianos realizados y resultados esperados. Bacteria Plásmido Cultivo en placa Resultado esperado E.coli DH5α pUC19 Placas con ampicilina y Xgal Colonias azules E.coli DH5α pUC19 + inserto Placas con ampicilina y Xgal Colonias blancas E.coli DH5α pUC19 + inserto tet o inserto glifosato Placas con tetraciclina o placas con glifosato Colonias En el caso del tamizaje, para determinar la cobertura del genoma ligado a pUC19 y transformado en células DH5α se utilizó la siguiente fórmula: Número de individuos a tamizar= ln(1-P)/ln (1-a/b) Donde: a = el tamaño promedio de los fragmentos de ADN que se desean clonar b = es tamaño del genoma P=probabilidad de encontrar el gen (cobertura del genoma) (Nicoll 2008)     38   A continuación se muestra el diagrama resumiendo las bibliotecas genómicas realizadas: Figura 9. Bibliotecas genómicas realizadas.     39   h. Confirmación de la resistencia al glifosato y tetraciclina de las bacterias transformadas. Se caracterizaron las bacterias transformadas que presentaron resistencia al glifosato, las cuales fueron nombradas glifo1 y glifo2 y se compararon las curvas de crecimiento de glifosato a manera de determinar si se ha clonado uno de los elementos que proveen resistencia (ya sea un fragmento del gen, uno de los genes que confiere resistencia, etc) o el elemento completo (gen completo). Como controles se utilizaron E.coli DH5α y la muestra de campo inicial (Serratia marcescens). En caso de las bacterias resistentes a tetracilina, las cuales fueron nombradas tet1 y tet2, se confirmó la resistencia realizando una re-siembra de los clones en placas con 50 µg/mL tetracilina e incubando 24 horas a 37º C. En el caso de las bacterias resistentes a glifosato, se confirmó la resistencia realizando una re-siembra de los clones en placas con 25, 50 y 75 mM de glifosato (Richter 2011). Para realizar las curvas de crecimiento de glifosato en placa se tomó una colonia de cada una de las muestras y cada una se inoculó en 3 mL de caldo nutritivo toda la noche a 37º C con agitación a 25 rpm. Luego de la incubación, se tomaron 5µL de las muestras incubadas y se inocularon en 3 mL de caldo nutritivo a 37º C con agitación, hasta que la densidad óptica del cultivo a 600 nm fuera de 0.01 A. Se realizó una dilución 1/100 de este cultivo y se inocularon 5 µL de cada bacteria en cada placa. Las concentraciones de glifosato utilizadas para preparar la curva en placa fueron de [0], [0.5], [1], [5], [10], [25], [50] [75], [80], [90] y [100] mM. Estas placas fueron incubadas 48 horas a 37º C para E.coli DH5α y los clones. Las placas con muestra inicial, Serratia marcescens, se incubaron a 30º C (Blue M, Electric Company). Luego se realizaron los conteos de colonias en cada una de las placas para generar las curvas de crecimiento. Todas las curvas se realizaron en triplicado (Richter 2011) i. Extracción del plásmido que contiene el elemento (gen) que confiere la resistencia. Para extraer el plásmido que contiene el gen de resistencia a tetraciclina y resistencia a glifosato se utilizó el kit PureLink™ Quick Plasmid Miniprep Kit     40   (Invitrogen, K2100-10, EEUU), en su modalidad de extracción por medio de centrifugación. El kit utiliza lisis alcalina y con SDS. El lisado luego se coloca en una columna con membrana de silica que une selectivamente el ADN plasmidial. Los contaminantes se remueven con soluciones tampón de lavado y el ADN plasmidial se eluye en solución tampón TE. Se siguieron las instrucciones del fabricante, se inició con 1.5 mL de cultivo ON de los clones resistentes a tetraciclina y resistentes a glifosato. El ADN plasmidial fue visualizado por medio de electroforesis, en un gel de agarosa al 0.8% en TBE corrido también en TBE a 90 V/cm por 40 minutos. El gel se tiñó con tinción Gel Red durante 40 minutos y luego se visualizó en una cámara con luz UV, como se mencionó anteriormente. j. Secuenciación del fragmento de interés por medio de cebadores M13. Los plásmidos con inserto del gen de resistencia a tetraciclina y el gen de resistencia a glifosato fueron secuenciados utilizando cebadores M13. Estos cebadores se utilizan en la secuenciación de insertos en el MCS ya que se unen a la región lacz del pUC19. Se extrajo ADN plasmidial del control y la muestra. Los insertos clonados en el vector pUC19 fueron secuenciados por la empresa Magrogen, en Corea. Esta secuenciación se lleva a cabo por medio del sistema BigDye Terminator y los datos se analizan por el secuenciador automático 3730xl de Applied Biosystems. Como se mencionó anteriormente, para secuenciar se utilizaron los cebadores M13 inciador y reverso a manera de amplificar todo lo insertado en el sitio de multiple clonamiento del vector pUC19. A partir de estos resultados, se comparó la secuencia de los insertos con las secuencias reportadas en la base de datos GENBANK por medio del programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). El programa BLAST es una herramienta de alineación en la cual se pueden introducir secuencias de genes y alinearlas, esta herramienta determina la homología entre genes y comparación de nuevas secuencias con las que ya han sido previamente caracterizadas. De esta manera se puede asignar una identidad a los insertos.     41   2. Aislamiento del gen de resistencia al glifosato por el método de cebadores degenerados. a. Diseño de cebadores degenerados para la amplificación del gen de resistencia al glifosato. Utilizando la herramienta “GenBank” (National Center for Biotechnology Information, 2011) se tomaron secuencias de genes de la enzima EPSPS de bacterias de diferentes tipos y grupos, tanto Gram negativas como Gram positivas, bacterias aisladas de muestras de suelos, bacterias aisladas de muestras clínicas, etc (Apéndice G). Utilizando la herramienta “Clustal W2” (European Bioinformatics Institute, 2011) se alineó la secuencia de todos los genes EPSPS. No se logró una alineación ya que la secuencia de los genes difería mucho entre sí, por lo que se realizó un árbol filogenético de estos mismos genes utilizando la misma herramienta “Clustal W2”. Con el árbol filogenético (Apéndice, Figura 48), se agruparon los genes y se tomó el grupo de genes que pertenecía al grupo de bacterias Enterobacterias. Esto debido a que la muestra en la cual se quería amplificar el gen EPSPS pertenece a este grupo (la muestra es una Serratia marcescens). Las secuencias del grupo de genes que pertenecía a las Enterobacterias se introdujeron una v