DETERMINACION DEL TIPO DE COMPUESTO QUE POSEE LA ACTIVIDAD ANTIMICRODIANA DE LA Virola Koschnyi (Sangre de drago) UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA Facultad dé Ciencias y Humanidades BIBLIOTECA D E, ,A INIVERSIDAR DEL VALLE DE GUATEMALA DETERMINACION DEL TIPO DE COMPUESTO QUE POSEE LA ACTIVIDAD ANTIMICRODIANA DE LA Virola Koschnyi (Sangre de Drago) CLAUDIA LORENA PORRAS JUT Trabajo de investigación presentado para optar al grado académico de Licenciada en Química Guatemala 1991 Vo. Bo. 7 N.aria Paiz R. H=b==Uic! Tribunal: '-------------------- Juan de Dios Calle Fecha de aprobación: 28 de octubre de. 1991 A Mari_. Lillian Paiz, quien hizo - de su escuela el descubrimiento más fá.---icinante y emocionante de mi vida. AGRADECIMIENTOS Agradezco «din as aquellas personas que hicieron posible la presente investigación, especialmente a: -Ing.. María Lillian Paiz, por su y motivador asesoramiento; -Licda. Rebeca Conde, por su ayuda incondicional; -Universidad del Valle de Guatemala; -Laboratorio Ciudad Vieja, donde se realizó la investigación antimicrobiolódica de la ƒƒ rola schnvi; 7Dnrtora Elfride P311, Lird7k. Margarita Selle, Doctor Juan de Dios c.11, y Juan Pablo - Pira, por la ayuda que en su oportunidad me brindaron; -Mi familia. "Amo sumergirme dentro de ese mundo del misterio, proporcionándome un entendimiento del poder de la mente: y acostumbrarme a los funcionamientos de la misma." Honorato de Balzac RESUMEN La "Sangre de Drago" (Virola Koschnvi). es utilizada popularmente como remedio casero contra amigdalitis, úlceras y gastritis_ El presente trabajo tuvo como objetivos, el estudio de la propiedad antimicrobiana de la corteza y resina de la Virnia Kn.=Ichnyi contra si..zilphylococcus Aureus • ATCC 25523, Streptococcus Pyoqenes y Cánriida alhican, utilizando la técnica de difusión de diSco; investigación fitnquimica de la corteza y resina por métodos fitoquimicos específicos; aislamiento del principio activo de la corteza contra Staphylococcus Aureus ATnc 25923, por métodos rromatográficos; e iill,,ntifirxtrin del mismo por medio de espectroscopia IR, NMR, UV y pruebas fitoquímicas especificas.• Tanto la corteza como la resina mostraron actividad antimicrobiana contra Staphylococcus Aureus, Cándida albicans y Streptococcus Pyogy.11nes: Los metabolitos secundarios más abundantes fueron Flavonoides, Glicosidos cardíacos, saponinas, .taninos y otros compuestos oxidables. El análisis del método de extracción' las pruebas cualitativas y espectroscÓpicas sugirieron que el principio activo, contra Staphylococcus Aureus, de la corteza de la V,. Koschnyi posee un grupo fenólico con cadena alquílica y grupo carbonilo. CONTENIDO Páginas II RESUMEN. INTRODUCCION ANTECEDENTES A. Virola Korhnvi 3 1 Taxonomía 3 2. Descripción 3 3. Usos 4 O. El género Virola Interés etnofarmacológico 2. Estudios fitoquimicos 7 3. Actividad Biológica 19 Staohylococcus Aureus 20 III. OBJETIVOS TRABAJO EXPERIMENTAL 24 A. Extracción de la 1-oschnvi 24 1. Método 1' Extracción de la resina 24 2. Método 2: Extracción de la corteza 25 O. Métodos de inv,,,:stidación fitoquimica 25 1. Flavonoides y compuestos afines 25 2. Glicbsidos cardiotónicos 26 Esteroles y saponinas 26 4. Alcaloides S. Taninos y polifenolas 27 6. Qudnonas y compuestos relacionados 27 C.- Investigación Microbiolódica 1. Técnica de difusión de disco 2. Investidación del métndo de aislamiento del principio activo 3 Determinación del tipo de compuesto activo 20 4 Tratamiento estadistico de los datos de lOS' resultados antimi- 30 crobiolódicos RESULTADOS :31 A. Fitoquimicos 31 Microbiológicos 4:3 Aislamiento del principio. activo de la V. Koschnyi contra Staphylococcus aureus ATOO 25923 VI. DISCUSION 71 VII. CONCLUSIONES 76 VIII.- RECOMENDACIONES 75 IX. BIBLIOGRAFIA 79 APENDICES A. de difusión de disco S3 S. Análisis en TLC de la Virola Koschnyi S7 r:. Extracción de alcaloides en plantas con menos del 1% de contenido 1 0? D. Limites del diámetro de zona de inhibición con discos antimicrobianos pára S. aureus ATCC 25923 1 03 Páqinas E. Análisis de varianza para la actividad antimicrobiana de la V. Koshnvi 104 P LISTA DE TABLAS TRbla Página 10 Presencia de alcaloides en especie=s de Virola 14 3 Presencia de neolidnanos en el género Virola 33 34 -70= 25 36 36 10 Investidación de taninos v en la HP. la Knschnvi 11 Investigación de flavonoid x 7-u. es en los Ptrtn crudos dP17--i corteza de la Y • Krichnvi 27 38 29 14 investigación de saprminP:i.s en 1r1 s extractri.,« crudos de la corteza de la • Knsrhnyi 15 Investigación de alcaloides en los extractos rrudos de lA. -rorteza de la V. ischnvi 40 1 Presencia de los 1,3-diri1propanos en las especies Virola 4 investidación de flavonoides en los extrartos crudos de la resina de la tJ Kosrhnvi Investigación dP dlicósidos cardiotónicos en los extrartos crudos de la V. -Dschnyi Investigación de e-,-Iteroles en la resina de la Knc;rhnvi 7 investidación. de saponinas en ).os extractos crudos de la resina de la Koschnyi 2TnvestidA.cir de alcaloides en los extractos crudos de la resina de la Y. 15.qschnvi 9 Investigación de quinonas en la resina de la V. Kdc-Irhnvi 12 Investigación de glicósidos cardiotónicos de los extractos crudos de le V.... Koschnvi 12 Determinación de estero es en los extractos crudos de le cort.eze de la Y. Koschnyi 1g; Determinación de alcaloides en la fracción alcaloidal de la resina de V. Koschnvi. Análisis en TLC con sistema de elución benceno:cloroformo:etanol 7:3:1 40 17 Investigación de quinonas en la corteza de la Y. Koschnyi, 41 18 Investigación de taninos y/o polifenoles en los extractos crudos de la corteza de la V. Koschnvi 41 19 Resumen de los principales metabolitos secunda- rios presentes en la corteza y resina de la V. Koschnyi sugeridos por los resultados obtenidos en las pruebas fitoquimicas 42 (-3 Masa de los extractos crudos de le extracción de la resina por el método lb. y concentración para las pruebas microbiológicas 43 21 Equivalentes de resina utilizados en las pruebas antimicrobianas de la V. Koschnyi 44 22 Actividad antimicrobiana de los extractos crud,Ds Me la resina de la V. Koschnyi contra Staphylococcus aureus 4S Actividad antimicrobiana de los extractos crudos de la resina de la V. Koschnvi contra. Cándida albicans 45 24 Actividad antimicrobiana de los extractos crudos de la resina de la V. Koschnvi contra Streptocogcus 2yogenes hemolitiCo del grupo A 47 *7-,S Actividad antimicrobiana de los extractos crudos de la resina de la V. chnyi contra 48 25 Masa de los extractos crudos obtenidos de la corteza de la 49 27 Actividad antimicrobiana de los extractos crudos de la corteza de la V. Koschnyi. contra Sta2hylococcus aureus Al-CC -25923 28 Actividad antimicrobiana de los extractos crudos de la corteza de la V. Koschnyi contra fltornrrus pyogr,-,rhas hemolitico del grupo A 29 Actividad antimicrnbiana de los extractos crudos de la corteza de la Koschnvi contra Capdida albicans Actividad antimicrobiana de los extractos de la cnrteza de la Knschnvi rnntra 2taphvinroccus auriauc; ATcc 25922 31 Actividad antimicrobiana de las fracciones FAS en columna de silica contra '2tabhyinrocrus aureus ATCC 7.c;q122 Actividad antimirrohíana la =1 fracrione de FA2(11-12) rie la V. Knchnvi 33 Actividad antimicrobiana las' fracrirSn rlim la columna FAS(11-12) de la V. Ko,r,. chnvi rnntra Stabbylococcus aureus ATCC 2 24 Comparación de los dárlletros de inhibición por algunas fracciones y Subfracciones activas de la corteza de la Koschnyi contra Staphvinrocrus aureus ATCC 25922 35 Actividad antimicrobian o a de los solventes contenidos en losextractos y fracciones de la V. Koschnyi 54 b0 f51 • 62 64 FIGURA!1; Figura Página 1 Bidgenesis de flavonoides • Métodos de síntesis de 1,3 diarilpropanos 10 3 Spiroeliptinas de V. sp2 11 4 Estilbenos de Y. spp 11 5 FI:=Ivonoides de y. s2P 12 • AlrRloides de Y. =p'2 13 7 Esteres de cadena larda de s22 15 8 Policetidas de V. 122 1f2, • Algunos neolignano r 74 s de Vi n1 18 10 Diagrama de flujo del método de aislamiento del principio activo de la y.„. Kosc.hnyi RF; 11 rspertrn UY del rrimpue=.to activo FAs(11-12)6'2 65 Espectro IR en film y ventana de KEr del rompuesto Pketivo FAS(11-12 67 15r Espectro NMR en CriC13 Hez compuesto tkctivo FA;7;(11-12)F,'2 f=2 14 Espectro NMR en CDC13 del precursor FAS( ) 6 11-12 . F...*9 15 Espectro NMR de CDC13 70 I. INTRIMUC:CInN La "sangre d drago" (Virola K schnyi) es una planta muy utilizadapopularmente como remedio casero en las regiones de Cobá n, izabal y El Petén. Los habitantPs utilizan la savia corteza exhaustivamente para la curación amigdalitis, úlceras y gastritis. Pn la ciudad de G14at.emala, su uso se ha extendido por curanderos y naturistas •para los mismos propósitos. interesante reconocer que solamente el propio .paciente ha experimentado los ei.,......,s de Pste medicamento vegetal r por lo tanto, es digno u..., una investigación rismtifica. Fi presente trabajo tuvo como propósito principal, contribuir al estudio de una de miles de plantas que son utilizadas por sus propiedades curativas, por medio de la investigación de la propiedad antimicrobiana de la "sangre de drago", hacia algunos microorganismos como el Stanhylococcus aureus, S5,re2t1 coccus 2vogenes hPmolitico del nn A Y Cándida albicans. Así mismo, la idPntificarión d'yzu los principales metabolitos secundarios dentro dP la planta impnrtancia clinica por la posibilidad de reacciones adversas - LIPvar a cabo el aislamiento e identificación del tipo de compuesto que lP da le propiedad antimicrobiana. El trabajo consistió una parte teórica otra 2 experimental. La parte teórica involucró una investigación .... bibliográfica del genero Virola en ru'astihn de características, actividad biológica y estudios fitoguimicos preliminares. Esta parte está contenida en la sección de Antec,adetes de est,. trabain. El traHain experimental comprendió mátodos fitoguimicos y microbiológicos ya estahLarii-los, asl como la investigación del método de aislamiento del compuestn • activo y su respectiva caracterización. :H. ANTECEDENTES A- Yirr-2157. KL-125jItTY:1 1 Taxonomía. La Virol;::? t5psphnyi (Warrb). o V. merendonis (Pittil,,,r) llamada también como sangre de drago (Standley, 1998), sangre, drago o cedrillo et 11, 1921) es una planta que pertenece a la familia Mírísticaceae o familia de la Nuez Moscada del orden Laurales. Existen entre 40 y 65 especies del género Virola dis- tribuidas en el continente americano en bosques húmedos de Centro y Suramerica, siendo abundantes especialmente en la flora del Amazonas (Schultes, 1979). El nombre "sangre" es re cuente en estas regiones debido a que la planta exuda una savia roja de la corteza. En Guatemala se encuentran tres especies: IL1.1Uf... 1gra con hojas pegueflas, entre 1.5 y 3 cms. de largo; chnyi con hojas más largas, 4.5 y 5.5 cms con nervios laterales de- 18 a 35 pares, estrelladas y pubescentes; y gplatemalensís con hojas de nervios laterales de 14 a 21 pares. (Standley al, 1981) 2. nesc. -ión. La Virola Kol:chnvi es un árbol de 35 metros de altura y con 1.25 metros de diámetro en el tronco. Posec: ramas densas y estrelladas. Las hojas son elípticas de 13 a 35 cms de largo y entre 4 y 13 cms de ancho, de forma obtusa y cüspida en la base; tienen nervios 4 • laterales de 18 a 2F1 pares. Sc caracteri.7a per inflorecencia con flores densas; frutas elipsoidales de .7' e. 3 cms y corteza en continua exfoliación. yola Koschnvi se encuentra en bosques W.Imecins a 300, metros sobre el nivel del mar en Alta VerapaZ, i7ahal, Belice, Honduras, Nicaragua, Costa Rica y Panamá. (Standley ak, 1981) 3. os. En Centro América, ei dénero Virola tiene poco uso. La madera es café pálido, de pe5n liviano y firme, 'utiliade. generalmente en trahajos de carpintería. En Belice, a la Virol.a Ko5rhniyi se le conoce con el nombre de "banak", y la madera es exportada a lo= Estados Unidos para la manufactura de plywood. Las semillas son ricas en aceite, y en Guatemala se utilizan para la fabricación de jabones y candelas. A las hojas se les atribuyen propiedades aromáticas, empleándose como saborizantes de bebidas. (Stand' ev si_ al, 1981) e_ .?as un estudio realizado por el Instituto Indigenista Nacional de Guatemala, en 1978, (instituto Indigenista Nacional, 1978), la "sangre de drago" es utilizada para ia curación de amigdalitis, úlceras, vista cansada y como antiahortivo. Para la curación de 'úlceras, en la zona Kekchí, Languín de Guatemala, agregan una cucharadita de "sannre nr-ann" (savia de la corteza) a un vaso de agua. La savia diluida se bebe durante el tiempo requerido para la curaCiÓn. (Instituto Indigenista Nacional, 1978) La Doctora Elfride Poll, de la Universidad del Valle de Guatemala, durante una expedirión a Rax ruhá en 1929, región en las cercenas de la carretera Transversal del Norte en Coban, enContró la ütíliz'acIón - de la "sangre de drago", Virola Koschnyi, para el tratamiento de úlceras, gastritis, amigdalitis y asma por los indígenas del lugar. Los indígenas le agregan una cucharada de sangre de drago (savia del árbol) a ddez ta.7.a de agua hervida-, y toman una taza de-es,te preparado en ayunas y antes de cada tiempo comida. (Poll, comunicación personal) En Centro América y México existen otras esneries llamadas popularmente "sangre de drago", debido a que también exudan una savia de color rojo. Estas son la Glicirida 55ePit.f10,. en Costa Rfca; P.s.l.dlrocar2us officinalis en Guatemala Nicaragua; y Croton 2anam.ensis en México. 1...E1 género Vir_ol,a ; InterPe EtnofarmaLuia,.4,. Fi género Virola presenta un interés etnofarmacológico especialmente en :.uramerica. El descubrimiento de las propiedades farmacológicas se estima que no es reciente debido a que su . . utilización se remite a tribus que poseen una transformación cultural o a sociedades en total desintegración. Entre los usos de mayor importancia se encuentra la fabricación de de varias especies de Virola con efectos alucinóoenos, psicoactivos y narcóticos (Schultes, 1979). ha reportado tambián el uso oral diz, l;.t Virola con propósitos embriagantes (Schult!=s, 1979) y el uso local como cicatrizante y para el tratamiento de enfermedades de la piel. (( nttlieb, 1979) El doctor Koch-Grunberg Psrribió, en 1923, acerca de un "..muff" utill.7adn pnr los nativos de la región -del Orinoco comb fuerte estimulante. Se refirió al "hakudufha", como un "snuff" mágico preparado de la corteza de cierto árbol. La corteza era triturada y colocada en un recipiente con agua hasta evaporacón. El sedimento tostado y pulverizado se aspiraba a. traves de una caZa. Por la descripción de Koch- Grunbero, Schultes (Schultes, 1979), indicó que el "snuff" debió haber sido elaborado a partir, de una corteza df-, Virnia, estableciendo que dicho fue el primero en la 6 literatura del uso narcótico del género Virola. Pn...;teriormente, realizaron identificaciones botánicas de las plantas e investigaciones de sus usos y forma de preparación. Pn Colombia y Brazil, el "snuff" de las especies caloph_ llei. y V. cIllophylloidea es usado en medicina. Entre VenF-z14í=da y Bra7i1, utilizan la resina de la V., theiodora -Kambicln como "snuff", el cual contiene otros aditivos como hojas ne just.ir 4 a 2ectora. , y cenizas de 2rirr,1212- En Colombia ingieren directamente la resina de la V,_- ekongata sin preparación alguna para efectos psicoactivos. • (.;rhultes, 1979) La Virola rarinata ha sirio utilizada para el tratamiento de descoloraciOn de la piel (Kazuko, 1985); la venezulensis o para el tratamiento de reumatismo en Venezuela (Lopes et al, 1982); otras especies como veneno para flechas de cacería. (MacRae et al, 1984) 2. Esti4díoe Fitngs.,11..mico51 . a Fl.avong. i.des. La presencia de un alto contenido en. flavonoides es característico de las especies de Virola. Los flavanos, que generalmente se encuentran en las resinas coloreadas, junto con sus dímeros oxidativos (biflavonoides) constituyen la composición principal d la sangre roja, "sangre de drago", de este género. Además se han reportado chalconas, isnflavonoides, diarilpropanos y sus derivados. Dei tronco de la Y. pea se aislaron la hidroxidihidrochalcona, ,2'dihidroxi 4,4'- dimetoxidihidrochalcona, [l], el dimetoxifiavano [2] y el 1-(2'-hidroxi-LV-metoxifenil)-3- (4"-hidroxi-3"-metoxifeni1)-propano [2]. (Martínez et, 1987) De la 2,12.1.flata se reportó la flavonona [4].y en la V..„ caduc..1f se encontraron los isoflavonoídes tipicos del 7 género Virola, formononetin ESall y biochanin -A [5b], así como sus respectivos derivados 2'-hidrosi L5c, Sdi y 2'- metoxi ESe2. Con x,scgl-icif4tn de biochanin -A, todas estas isoflavonas tamblen aislaron madera j la Y . (Gottlieb, 1979) La m1.41.t1, elondta contienen 1-(2-hidroxi- metnxifenii)-3-(3, •-•-metilendiosifenii) propano (virolano) n' el derivado osidativo 1-(1dihidroxi-4-metosiciclohes- 3 en -ona)--(3,2-metUendiosífenii)-pronano (v1rolaflo1'ina),E72 tres 2-hidroxi-1,3-diaril-propanos, substituidos en los anillos aromáticos por 2-01-1-4-0MeS3,4-n CH (virolanol) E8a] 2,11.-di0H/3-0Me-4-0H (virolanol [Rh,11, 2-0H-4-0Me/3-DMe-4-OH (virolanol C) E8c3 además del (2R,38)7,3 ,4'-trihidrosiflavan-3-01) (feset.inidn1) rg]. (Kijjoa t. -1., 1981). Fn el trnnro de la se coniuntamente con el virolano y virolanol, el aceite 1-4(4'- hidroxi-2'-metosifenii)-3-(3"-hidrosi-4"-metosifPnii- prnpano, El0], (Bra- 14.51 11, 1976) La figura 1 contiene la biodenesis de flavonoides y la fidura 2 los métodos de síntesis d los 1,3-diarilpropanos, importancia para la determinaciÓn de la ,.,structura de flavonoides. Además se han localizado en varias especies de Virola los derivados osidativos 10s flavanosl espiroeliptinas (figura 3) y estilbenos de importancia bios.int4tica. 1 CH=CHCO—SCoÁ 3—malonil—CoA GH SCoA CH. .•-• CO z GO llk fonilalanina fenilpirlvieo ae. preféric® ae. shikími€o lid 11j O .1:14 RO Ar RO RO OH Ar RO OH Ar RO Ro lle RO RO OH RO lla O 9 llg lic E.I.qura Eliognesis de flalvonoides. (Gottliehet J. 1979) M*0 Pi ne0 OH Me0 á 12a C B 12b 10 12c A= Pa/C, AeOH D.H Pd/C, AcOH 12d B=B2C1 C- B_7' C=H 202 /a0H Pi=Piperenil (3,4)—metilenedioxifenil Figura 2. Métodos de sintesis de 1,2 diarilpropanos et_ z..1.1, 1979) TABLA I Presencia de los 1,3-diarilpropanos (tipos estructurales 11c y 119) en las especies Virola FUENTE NOMBRE TRIVIAL SU5iTITUYENTES AL O- DFL COMPUESTO 2 4' 5' 2" 4" S" V. multinervia virolano OH 2, OMe OCH0 V . radurifolia V. diveroens V. flexuosa V. ougoenheimlí V-. V. pvonisll_ V. surinamensis V. ykulosa Y. L2IL11151,1 V. multinervia nmp. OH OMe OMe OH En todas las spp virolanol OH OH OCH O (12a, 12d) 30 11 :10 OR OR .1=[Fe(DMF)3C12] o [PeC14] Figura 3. ,,.....iroeliptinas spp. (Gottlieb et 1979) En la venosa t=zr-N aisló el 3 -hidroxi -5 -metoxi-E estilbeno El3a3; en la corteza de le. V. cusoidafa el trimtoxi -E -estilbeno [12h] y en la V. el 3,5,1'- trimrtoxi-trans-estilbeno Ell.a] y su isómero cis [14b] (MacRae 21 al, 1985) OCH3 13a R=H R'=H 13b Me OMe 14b Me0 OMe OMe 14.a Figura 4. Estilbenos de snb. (MarRae et a1, 1985) MeO OMe Me0 2 CR 1 MeO OH OMe 10 e OR2 Me HO ao 110 la oa1 MeO 3 a=me a2=H al.H 7ura Flavnnoidl.s de snn. a al a2 5a H H H 5b OH H H 5c H OH H 5d OH OH H OMe 1 8a Me gb TJ É Me 2 a3 CH MQ H Me 9 4 0 a1 R2 15a H H 15b H Me 15a OMe H 15d OMe Mo 13 b. Alcaloides. Las especies del género virola han sido estudiadas extensamente respecto de sus constituyentes alcaloidales debido a su amplio uso como agentes halucínbgenos. De la - u -1 nni-17:1 4.a V • multinervia se aislaron como alcaloides•mayoritarios: metiltriptamina [15a], N,N-dimetil [l5b], F.,-metoxi-N,N- imetjltriptamin.=k 1115d1, y 6-metoxi-b-carbolinas £163. (Macrae et 1984). La tabla 2 resume los presencia de alcaloides en algunas especies:de Virola. a2 Me R3 2 N R2 R3 4 1 16a H H MG lob OMe H Me 16a OMe Me Me lód OMe Me H 1,2 16e ale Me H 1,2,3,4 Figura S. spp. (Gottlieh @t- J. 1979) TABLA '") Presencia de alcaloides en especies de Virola (Gottlieb et al, 1979) Especies parte I5a 15b 15c 15d 16a 16b 16c I-1F:d V. theiodora corteza + + raíz + + hojas -+ V. calonhyl1 corteza raiz hojas ' + y corteza raiz hojas + + mHitinervia corteza raiz hojas corteza raíz corteza V. cu,,,.i..Didata hojas 4. c. F...;teres de cadena 1..arga.. El género Virola con tiene esterp,,, de n-ácidos grasos y ácidos w- hidroxi-grasos de 9-sitosternl, D-glucosa y ácido fer!!,Ilico (cis y trans), 6-sitosterilEI-D-diucósido, series de esteres acidos C22-C29. Estos compuestos también se presentan como sus diesteres 1-monogliceridos correspondientes y los acidos w-bidroxi como los ésteres glucosil correspondientes (Kazuko l4. et al., 191:17) Me0 HO GH=OH-000(GH2)12-COOR aislaron los st0i.f.pria de la V~ los frutos En se acetato r=. policetidas [17a,10a,19a], así como sus formas El9b,20,17b,213.(MacRA.e et Pa,1979) d• 1\191i'jDansps, La actividad fungistática o importancia son la (+)-guaiacina . E24a3, un neolignanos de virolina E26a] y surinamensina veranguensina 1-.7.=h1 con actividad biológica. (Gottlieb, 1979). La tabla 3 muestra la presencia de neolignanos género virola. Los neolignanos corresponden a los tipos benzodioxano, otobaina, eudenol, tetralina, y arilnaftaleno. el en 15 17a R=H n= 27-21 17b H 00H2-CH(OH)GH2OH n= 21, 23-28 Figura 7. Esteres de cadena larga de V. spp. (Kazuko E -. al, 1987) fungicida de las semillas de la Dialyantera otoba fue atribuida a la presencia de (-)-otobálna E->r4a3. Varios lirm.knns de Estructura similar E24,233 fueron aislados como constituyentes minoritarios de varias especies Virola. Otros principio activo de •la 61.4,aiacum officinale; galbacina [2sa3, 16 1 . 18a R=R = H lEb R=H R=Oble 19 oa O R 20a R=H 22 20b it=Áz OH 21 Figura 8. Policetidas d V. spp. (MarRae et al., 1987) 17 TABLA 3 Presencia de Neoliqnanos en el género Virola Especie Compuesto Referencia V. rarinata (±)-quaiacina 24a (-)-isootobafenol 24b (-)-qalcatina 24c (Gnttlieh et, al_,_ 1979) (-)-rarcinatona carinatina (Kazuko et al_,_ 1982) (-)-cUbebina 35a (-)-hinokinina 35b (+)-asarinina 34 eusiderina 27 (Calyacante et a1, 1925) dehidrodieugenol carinatona 335 carinatonol 33a carinatol 33d (Kazuko FIL Al, 191.92) y. sebifera hidroxioxootobaina 23c hutirniartnna 28 oxootobaina 29af b y c (LopeS e:t al, 1923) tetraionas (Lopes In 2,_,_ 1922) (-)-hinokinina 35b (Lopes 1L 13, 1923) t:UswI.iparnsis galbacina 25a (+)-veraguensina 255 virolina 26a surinamensina. 26b (Gottlieb et al„ 1979) V. calophvlloidea Ac.dihidroquala- retico 30a metoxihidroxi- ntnbaina 23a y 235 metoxiotobaeno 32 (Martínez et ,,,_ 192F,) y,.....ualolDhyrla -,. arilnaftalenos 21c Ac.dihidroquaia- retico 30a Dibencilbutanos 30b y30c Tetralinas 31a 21b (Martinez 2.1. .,112_ 1990) V. elonqata tetralona (Martinez et al. 1988) his-tetra-hidrnfu- ranoepisesartemina sesartemina epiyanqambina yanqambina dihidrosesartemina B~dihidrovanriambims (Marrae et a.:1, 1924) virolanol fisetinidol - (Martines et al, 1985) y._ gl,AggenheiTij. eusiderina 27a V. nIvpnis eusiderina 27b V. ck2pida:ta Hidroxioxootobaina 23c (Gottlieb ejs., al _,.,„, 1979) Flgura 9. Algunos OMe, Alr Ve. "Ty) Ay- Ay' Ay Ay, 3O co.) Czu 3013 (.7(1 30e, Yt ?«... 1.8 II' =214 ii2K 11.°:tat Rae DI O Rzoll O ft: oR Ay PI fil 244 "c 244 u 24e Ve - eor.." Av- Av, rel, alt Vi. Ve: zrb p ve ve. Z30. Z3 b 23e Orne. o 11.1 Ztta 12%-kg = e/1Z R2>2 t4e4: 28 12°- g. c142 :,- téle.(cis) Z 910 RI tkz tofte c 11.2- 4 T9 01-P VhA 246 2 1 e Pi. lica z'4 31b iset S 1 e. a t', 2' 34 14,2,0 obte e f1.1 334 cozoti O OH 331. Me O oli 33e '4t - O 33d roe_ oH e« 11* bt4t, r¿ R2 3so, II R12: 0I4 3g-1> XI -122 a o sí,"thotos t C`xv _--z t ve. veyq-bri Tp -o rne.-E1 :rola I i 19 3. Biológica. El interés por la química de las especies del género Virola se debe, principalmente, al descubrimiento de sus propiedades medicinales. Los derivados de triptaminas, neolignanos y lignanos han sido aislados como compuestos biológicamente activos. Las triptaminas N,N ..... dimetiltriptamina y S -metoxi -N,N - dimetiltriptamina han sido identificadas como los constituyentes primarios alucinógenos de la resina. (MacRae y Towers, 1984) Los lignanos tienen un amplio campo de actividad biológica. Varios lignanos presentan actividad antimitótica, antiviral, anti-tumor y de inhibición de algunas enzimas. También producen efectos cardiovasculares, alérgicos, actividad antimicrobíana, fungistática y actividad hacia insectos como la inhibición del crecimiento de algunas larvas de .nosouitos. La sesamina, asarina e hinokinina, lignanos presentes en varias especies de Virola se han utilizado para aumentar la toxicidad de algunos insecticidas, produciéndose casos de sinergísmo. nor-isoguaiacína y el ácido dihidroguaiarético han sido reportados como inhibidores del crecimiento de especies de ',:::-f,.tr.:1,..to. qpccus. p;taphyl,ococcus aupeus, Bacillup subt.ilis y en el caso de la nor-isoguaiacina de la EsewOlimPn21 152LM9i112111. La actividad antifungi contra Rhlzoctoni,a oxisporum, py.thium sPp y !Pillz9PM15 Digr.afls ha sido 20 atribuida al ácido nor-dihidroqueiarético y algunos de sus derivadns. (MacRee y Towers, 1984). En una investigación del uso de la resina de la I ) elonqata como veneno en i_,eLha.., se examinó la alteración en el comportamiento de ratas por extractos alcaloidales y no alcaloidales. La actividad locomotora se Vio modificada por el extracto no alcaloidal La mayoria de su z.ltivided se atribuyó a la presencia de lignanos bis-tetrahidrofuranos, episesartemine, sesartemina, epiyanqambina Y yanqambine. (rlecRee y Towers, 1984) D. Staphylococus Aur@ms. Los estafilococos son cocos gram positivos y ocurren en forma de racimos de uva de tres a cuatro células. Carecen de movimiento, no forman esporas, son catelasa-positivos, y aeróbicos. (Lennette et 1980) Las especies de 5'..i:Itenhylpc..2pg.us son de interés clínico y pueden ser identificados con base en su morfología, producción de coagulase, hemólisis, resistencia a la novobiocina, actividad fosfetesa, producción aeróbica de ciertos ácidos a partir de ciertos carbohidratos y crecimiento anaeróbico en un medio semisólido de tioglicolato. El Sta2lukg,..r.cul.cAds ureus aislado de especímenes clínicos crece sobre agar,sangre y es usualmente hemolítico. Produce un pigmento dorado-amarillo' da los tests de coagulase • • " fosfatasa, y producción aeróbica de ácido positivos, crece 21 en forma anaeróbica en tiodlicolato Y el promedio del diámetro de la colonia es de 7.8 mm. (Lennette et ªl, T990) Las infecciones más comunes producidas por Staplulococcus son las infecciones de la piel producidas por las especies de 5:1,11P12Y1qc.TIPM= Estas incluyen foliculitis, • furúnculos, carbúnculos, relulitis, impétigo, síndrome de piel escaldada e infecciones de heridas post ..... operativas. Algunos procesos como el envenenamiento de alimentos es producido por enterotoxinas elaboradas por el 2.J.:..apbylogq111.11.4s Entre 1950 y 1960, el i.,j5.1„.T. 1,4s produjo una mortalidad considerable como patógeno nosocomial de pacientes hospitalizados. El uso de penicilinas semisintéticas ha sido una terapia exitosa de infecciones serias de Sin embargo los S..„ ,apireqs meticilina-resistente (MRSA) es uno de los mayores problemas clínicos y epidemiológicos en hospitales. La mayoría de los cuales es resistente a varios de los agentes antimicrobianos comunes, como macrólidos, aminoglicósidos, y antibióticos B-lactama. Las infecciones agudas causadas por MRSA se han tratatn tt.i,xitosamente con vancomicina. (Dalows e.t ªl, 1991) Los agentes antimicrobianos comunes para el a9reus ATCC 29212, son las penicilinas: penicilina (S, oxacilina, nafcilina, meticilina; cefalosporinas: cefalotín; cefazolín; compuestos 13 imipenem, aztreonam; aminoglicósidos: gentamicina y algunos antibióticos misceláneos como la 22 clindamicina, eritromicina, vancomicina, cifloproxacina, trimetoprimisulfametoxasol, enoxacin, ofloxacin, sulfisoxasol y trimetoprim. (Ballows, 1991) En el apéndice D, se encuentra una tabla que contiene los limites de los diámetros de las zonas de inhibición de algunos discos antimicrobianns contra Pl. mlnew5 ATCC 25923. Aún no se ha comprendido del todo el mecanismo de acción de gran parte de los medicamentos antimicrobianos. Sin embargo, se presentan los mecanismos antimicrobianos bajo cuatro postulados diferentes: 1. Inhibición de la sintesis de la pared celular. 2. Alteración de la permeabilidad de la membrana celular o en el transporte activo a través de dicha membrana. S. Inhibición de la síntesis protein-ica (inhibición de la traducción y transcripción del material genético). 4. Inhibición de la sintesis del ácido nucleico (Katzuno, 1987) III. OBJETIVOS objetivos de la investigación de la "sangre de drago", Virola Koschny.i fueron los siguientes: A. Determinar la actividad antimicrobiana de la corteza resina de la sangre de drago contra SIllsphylocop_cus Aurews, Streptocoqcus Pr.72.9111 hemolitilD del 971,fflg aMp.ine,n5;.¡ 11 .1 1 Realizar una extracción consecutiva nnr medio de soxhiet con hexano, benceno, éter sulfúrico, cloroformo etanol de la resina y corteza y determinar el extracto activo para cada microorganismo. 2. Fraccionar el extracto activo de la corteza por métodos químicos y cromatograficos, a fin de aislar el principio activo. 3. Por medio del método de extracción, pruebas fitoquímicas cualitativas y espectroscopia de IR, UV y NMR: determinar el tipo dé compuesto activo B. Determinar los principales metabolitos secundarios presentes en la resina y corteza por métodos fitoquimicos específicos. IV. TRABAJO EXPERIMFNTAL La resina (750 mi) y la corte= (3 Kg) fueron colectadas en la finca Mercedes en Telemán, Alta Verapaz; e identificadas por la Dra. en botánica Eifride Fbil, de la Universidad del Valle de Guatemala. de la V. bPs£17111Y.1. 1 . M1t2112 1 ¿7.; r.-T tracción 0? £.121J-Y11. 172a investicT51.16n La ivestigación fitoquimica de la resina se realizó con SO mi de resina. Durante la investigación se guardó en refrigeración a -7 C. A SO ml de resina se agregaron SO ml de etanol y con una ampolla de decantación se extrajo con 200 mi de hexano reducidos ¿ 20 mi con rotavapor; 300 mi de benceno reducidos a SO mi; 700 mi de éter etilico reducidos a 50 mi; 200 mi de cloroformo reducidos a mi (se produjo una mezcla de cloroformo-etanol con el etanol adicionado iniclaimente); 400 mi de cloroformo, reducidos a 20 mi y el residuo final se diluyó con 50 mi de etanol: Al extracto de hexano se le denominó Hla, al de benceno éter etilico Ela, cloroformo-etanol CEIa, cloroformo Cla y etanol Etla. tos extractos se mantuvieron a temperatura ambiente. 25 2. Mét2gg Ext...raccjón de 11 reskna para pruel2as TÁsrob.j.,91 9.1.111s A 50 mi de resina se les llevó Zik sequedad sobre un baZo de agua. El residuo (22 se extrajo en soxhlet durante 48 horas con cada uno de los siguientes solventes: hexano, benceno, éter etilico,' cloroformo y etanol. Cada uno de los extractos fue filtrado, evaporado y secado con nitrógeno . Los residuos se diluyeron con 1 mi de su solvente respectivo. Los extactos crudos se denominaron Hib, Blb, Elb, Clb y Etlb. 3. MPt2.0'1.1 dg 2: El'...IY.IarPióFi de la qort..P7217,a.1 ºªrª 1131111. Utoguimico riliqr.0..1.d3Aqi£57.)- La corteza del tronco del árbol se secó en un horno a 60 C durante 72 horas le, corteza seca (tres kilos) se pulverizó y se extrajo consecutivamente en soxhlet con hexano, benceno, éter sulfúrico, cloroformo y metanol durante 48 horas. Los extractos se concentraron en rotavapor y se secaron con nitrógeno. Se les denominó HC, 8C, EC, CC y MeC, respectivamente. B- MM2d22 02 IrlYg2:11gMi!DP f.J.todWITi5.1 Para la determinación de los metabolitos secundarios principales de la resina y corteza de la K2sphnyi, se utilizaron los métodos de investigación fitoquimica recomendados por Dominguez, 1973. 1. Investigación de flavonoides y compuestos afines: a. Prueba Shinoda A: extracto y 3 gotas de HCl. BIBLIOTECA l./ UMVERSIOAD NI VALLE DE GUATEMALA 26 b. Prueba Shinoda B: extracto y 3 gotas de HCL y un trocito de magnesio. c. Prueba Marini-Betolo A: extracto y tres gotas de Acido sulfúrico concentrado. d. Prueba Marini-Betolo 81 extracto y cloruro férrico. e. Prueba Dimroth A: extracto y tres gotas de ácido bórico en anhidrido acético. Prueba DimrOth 8: extracto y acido bórico, acido citrico y acetona. g. Prueba Dimroth C; extracto HCl y ebullición. h. Prueba con Nitrato de Plata i. Test de Cianidina 2. Glicósidos Cardiotónicos a. Prueba de lactonas insaturadas: Sobre un trozo de Par-0,--,1 filtro r'77' colocaron tres gotas de extracto de concentrado. El papel se secó en un horno y después se roció con el reactiYo de Kedde. b. Prueba de Paljet c. Prueba de Raymond Esteroles y Saponinas: a. Prueba de Liebermann-Burchad b. Prueba de Rosenheim c.• Prueba de Salkowski 27 H. Test de espuma e. Prueba de Hemólisis en Agar Sangre 4, Alcaloides a. Reactivo de Ma.ver b. Reactivo de Dragendorff c Reactivo de Wagner Investigación de Taninos y Polifenoles a. Reactivo de cloruro férrico b. Reactivo de gelatina r. Reactivo de sal-gelatina Investigación de Cluinonás a. Prueba de Rnrntraner b. Prueba de Borntrager Modificado C. Inyesttgación Microbiológica 1. TO£Dica dp Difusión de disco. Para la determinación antimicrobiana e investigación del principio activo se utilizó la técnica de difusión de disco. El test de difusión de disco es el recomendado por la U.S. Food and Drug Administration y por el National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS) que es una modificación al descrito originalmente por Bauer at al .(Balows et al, 1951) Se empleó agar Muller-Hinton para el examen contra Stapbyloc.gccus awrpus ATCc 25993, Cándida albiAlans Y col Base de Agar Sangre y sangre de carnero para el examen contra StLppIgr,2psys pyggenes B hemolitico del grupo A. Con los extractos crudos, fracciones y subfracciones se 26 sensibilizaron discos de papel filtro blancos de 1/4". A los discos se les dejó evaporar el solvente ‘:/ se guardaron en cajas petri estériles hasta su utilización. En la preparación del inóculo, se utilizó en método standard Las colonias se inocularon en 5 ml de caldo de soya-caseiv%a. El caldo inoculado se incubó a 35 C hasta la aparición de una turbidpz. La turbidez se comparó visualmente con la preparación standard de McFarland (0.5 mi de 0.042 M de cloruro de bario a 99.5 ml de 0.36 N de ácido sulfúrico); en caso necesario se ajustó con solución salina (0.85%). Los discos sensibilizados se colocaron sobre el medio de agar inoculado y después de 24 horas de incubación a 37 C se examinaron los platos y se midieron los diámetros de completa inhibición. Como control se utilizó .sulfametnxasol y trimetoprim (STX) (500 ug) de BBL. -Mueller-Hinton Agar Diagnóstica Merck ' Microbiología/ Diagnostico in vitro -Base de aqar Sangre Diagnóstica Merck Microbiología/Diagnostico in vitro -Discos Blank de papel filtro 1/4" BBL -Sulfametnxasol-Trimetoprim 500 mg BBL método dé aisiamtent,2 qq1 eqtly.2. El método de aislamiento del principio activo fue determinado por medio del fraccionamiento del extracto crudo que presentó mayor actividad y era el más factible para trabajar respecto de la cantidad 5-7 muestra adecuada para un fraccionamiento posterior. Cada una de las fracciones del extracto crudo fue sometida al examen microbiológico. El procedim iento de fraccionamiento y examen de la porción activa se llevó a cabo sucesivamenté hasta el aislamiento del compuesto activo. El fraccionamiento involucró cromatddrafia en columna abierta de silica gel y sephadex; cromatografia en capa fina preparativa y cromatografia en capa delgada de silica gel. Especificaciones de los soportes crdmatodráfird.;: -Para cromatografia en columna Kieselgel 60 Korngro e 0.063-0.200 mm (70 230 mesh (Merck) -Para cromatografía en capa fina preparativa Kieseldel 60 PF(254+366) (Merck) -Cromatofolios Al de silica gel 60F254 DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 espesor de capa 0.2 mm (Merck) 29 -LH ->0-100 Sephadex Lipophilic Bead Size 25-100 u. Para filtración en gel. Sigma Chemical Company El análisis cromatográfico se realizó con lámparas de luz ultravioleta de 366 y 254 nm. -Model UVL -F12 UV -368 nm -Model UVL-52 UV -254 (Mineral~..., UVP Inc.) 3.Determinación del tipo de compuesto activp. El . tipo de compuesto activo se determinó por medio de espectroscopia de NMR, UV e IR, pruebas cualitativas específicas y análisis del método de extracción. -Lambda 5 UV/V1.9, Spectrophotometer. Perkin Elmer -Infrared Spectrophotometer 735B. Perkin Elmer -EM-2601_ NMR Spectrometer System Varían, Instrument Division 4. Tratamiento estadístico de los datos de los resultados aD1-,imicrobiológicos. El análisis estadistico de la actividad antimicrobiana involucró la determinación de diferencia de medias de los diametros de las zonas de inhibición por análisis de varianza (ANDEVA) de una vía. Los bioensayos se realizaron en triplicado de discos dentro de una caja inoculada y en triplicado de cajas inoculadas. 30 5 y. RESULTADOS A. PC.5.1d:~1 !:11 lª iPYC5tiglación fitog9imica En las tablas siguientes se encuentran los resultados de los métodos de investigación fitoguimica. Es de interés la formación de soluciones coloreadas que son caracteristicas de algunos metabolitns. En la prueba de Marini-Bettolo A, la coloración naranja de los extractos Hla, Bia, HC y CC indicó la presencia de flavononas; la coloración amarilla de 8C, CC y MeC de flavonas y flavonoles y la coloración guinda de MeC y Ela de chalconas. En la prueba de Marini-Bettolo 8, la solución verde- amarillo de 81a, Et1a • y MeC fue propia de derivados del catecol. La reacción con nitrato de plata indicó presencia de flavonoides con dos hidroxilos. La presencia de Leucoantocianinas se evidenció con la coloración violeta que cambió a rojo fuerte en el test de cianidina para la resina. Los glicósidos cardiotónicos y lactonas insaturadas se encontraron en los extractos Ela' Etia, MeC y EC. Las pruebas de alcaloides no fueron positivas; sin embargo la reserpina, alcaloide indólico tampoco dio resultado positivo con los reativos de Dragendorff, Mayer, Wagner. Se preparó un extracto de la resina para su análisis 3 2 en TLC, con un método para plantas que contienen alcaloides en menos de 1%. (Apendire C) Los 5 mi de extracto se analizaron en TLC de silica gel (.2 mm) con un sistema de solventes benceno:cloroformo:etanol (7:3:1) y se revelaron con el reactivo de Yodoplatinato (apéndice C). Se obtuvieron manchas blancas con valores Rf de 0.78, 0.44 y 0.25. La formación de espuma fue una de las características' típicas de la resina y corteza de la V. r.pschyui.. El test de hemólisis fue positivo para los extractos Etla, Etlb y MeC. Estas observaciones podrian dar como resultado la presencia de saponinas en la especie. Otra característica fue la presencia de polifenoies y taninos del tipo catecol y pirogaloi debido a la formación de un precipitado negro-azul en los extractos Etla y MeC y en la resina, con los reactivos correspondientes. En los dos extractos anteriores y en la resina se observó la formación de un precipitado oxidable de color rosado/ el cual fue soluble en metanol y dio las pruebas de taninos y polifenoles positivas. Los resultados se presentan en las tablas siguientes, se indica la cantidad de extracto, las pruebas fitoquimicas y los resultados. Un signo menos, (-), indicó yesultado negativo y un signo más, (4),resultado positivo. TABLA 4 • Investigación de flavonoides en los extractos crudos de la resina de la V. Koschnvi. (0.1 ml de extracto) - . Resultados de Pruebas Extractos ShA ShB MDA MBEI DA De De NP C H1 a Ble Ele + Cle CEla u Etia 1.11-.A~~,ndak A MEN~~11-11 Osup-t.ld A 00,...1mrc:..t,M A 0,C...Dimrc C E~.~11-m5drm El moe-m^1-iy,a-elle. e DE-1.=1D1mre: e NP..« Nit,l-mt,d dm F"lakt,im C C.laar-bldirnak 33 TABLA S Investigación de Glicósidos cardíotónios de los extractos crudos de la resina de la Koschnvi (2 ml de extracto) .. ==— ..... ..... ==================== Resultados 3 i+ Extracto 1_1 . .. Ba Ray H1 a E3 1 a Ela C 1 a CEla E t- 1 a . .. . .. Irlsolinaue~la W3m~imlát, nai~~yre. TABLA 6 Investigación de Esteroles en la resina de la V. Ko5j.,phnyi (0.5 gramos de resina seca) . , , Prueba Resultados Liebermann-Surchad Rosenheim Salkowsky . . , TABLP 7 Investigación de Saponinas en los extractos crudos de la resina de la y... KgIchnvi (0.3 mi para el test de hemblisis y S mi de extracto crudo) Extracto , Hla !Dia Ela Cla CEla Etla Test de Espuma Prueba de Hemblisis . y- 35 TABLA 8 Investigación de alcaloides en los extractos crudos de la resina de la Koschbyi.. (1 g de residuo evapnrado) =========================================-================== Extracto o Pruebas Control ,, .... .... D-ragiendorf f Mayer Wagner Yr, d r, n a t inatr. . • .• -....•.• ... • .. Hl e. u Bla 7 Ela Cla EtiA. Reserpina Papaverina + ... TABLA 9 Investigación de (luinonas en la resina de la V. (0.5 gramos de resina seca) Prueba Resultados Borntrager Borntrager Modificado .. 36 TABLA 10 Investigación de Taninos y polifenoles en la resina de la y, Koschnvi (0.5 gramos de resina ser,,,) Prueba Resultados Reactivo de gelatina + Reactivo.de sal gelatina Cloruro férrico + TABLA 11 Investigación de flavonoides en los extractos crudos de la corteza de la K.osphnTL. (0.1 mi de extracto 0.2q/m1) Resultados de Pruebas Extractos ShA She MBA MBB DA DB DC NP He BC EC CC - + . MOA...Makv,ivli—Elé A 0~:thlre 00..c)~c~1 c sme,..etniync~ mBo—m=,1"1 ist 19J.t,v.mt.c> F.laat-aa 37 TABLA 12 Investigación de Glicósidos cardiotónicos de los extractos crudos de la cortl.,za de la Koschnri (2 mi de extracto de 0.2g/m1) Extracto Resultados '' ... --• •• • LI Ba Ray HC BC EC CC MeC •---•-.•-,•-• .. ̂. Y. .. .•- • ^ -,} .. ̂.• IvNgaiat,LA1-4Ncimm Rm..F.haym1:51-5•73 TABLA 13 Determinacjión de esteroles en los extractos crudos de la corteza de la V. Kp151.1-inyj. (0.1g/5 ml de extracto) Resultados Extracto LB Ros Salk HC + - + BC + EC - + CC + + Hee ... 0-19.«Lit>~~, Fl..-~,~m~r1~3.m 11;m11.:~1,14se~mki TABLA 14 Investigación de Saponinas en los extractos crudos de la. • corteza de la Kos0-1pyl (0.3 ml para el test de hemólisis y 5 ml de extracto crudo/ 0.2g/m1) =========================================================== Extracto Test de Espuma Prueba de Hemólisis ..... -------- HC Be EC 39 CC TABLA 15 Investigación da alcaloides en los extractos crudos de la corteza de la V. Koschyi (I o de residuo evaporado) ..... ... .. Extracto o Pruebas Control Dragendorff Mayer Wagner Yodoplatinato HC BC 'Fe CC MeC Reserpina Papaverina .... .. ... y... TABLA 16 Determinación de alcaloides en la fracción alcaloidal de la resina de - AnliísíS en TLC con sistema de elución benceno:cloroformo:etanol 712:1. ..... — — — — — — ..... Extracto Agentes reveladores D DM W WM M MM IP Extracto alcaloidal CD~Oyerv f-r ~c2i.f5.w 0~1~~ WM~asavlwkr. ~c3Ificns~ ~M=y~ TABLA 17 Investigación de Quinonas en la corteza de la y. Kg5qhpri (0.5 gramos de extracto) Extracto Borntrager Borntrager Modificado ..... ---------- HC BC FC CC MeC TABLA 18 Investigaci6n de taninos y/o polifenoles en los extractos crudos de la corteza de V. Koschnyi. (5 mL de 0.2g/m1) Extracto Resultados eje:latina Sal-gel FeCl3 HC BC EC CC MeC 41 .. • 42 TABLA 19 Resumen de los principales metabolitos secundarios presentes en la corteza y resina de la y, .Kgletnyi.. . Sugeridos por los resultados obtenidos en las pruebas fitoquímicas. %.:==.":.----- --=== ====================== ::::: =============== Metabolito Resina Corteza ..... ..... Flavonoídes + Glicosidos cardiotónicos Esteroles Saponinas + Alcaloides + Quinonas Taninos B. Pesultados 3-1t =1:z. Ipt.j.minnPbj.lna r:le II nelliw.9, Kc.115:hmr,l , La tabla 20 muestra los datos de los extractos crudos obtenidos de 22 oramos de resina seca con el método de extracción lb, la concentración para las pruebas microbiológicas y el porcentaje de rendimiento. Con excepción de Etlb, el contenido total de cada extracto se diluyó con un mililitro de solvente, a fin de relacionar la actividad con respecto a los equivalentes de resina. TABLA 20 Masa de los extractos crudos de la extracción de la resina por el método lb. y concentración para las pruebas microbiológicas. Extracto masa (41— 0.0001 g) C (g/m1) _ Hlb 0.0197 0.0197 0.09 Bib 0.0099 0.0099 0.05 Elb 0.0498 0.0498 0.22 Ealb 0.1022 0.1022 0.40 Clb 0.0108 0.0105 0.04 Etib 17.5282 0.0331; 47.85 Las pruebas microbiológicas C- 474 llevaron a cabo en triplicado de cajas inoculadas. C=.11a caja contenía tres discos sensibilizados con 20, 40 y 80 microlitros de cada uno 411 de los extractos. Los resultados presentados en ras tablas 22, 23 y 24 indicaron actividad antimicrobiana contra estafilococo, estreptococo y cándida. Los extractos activos fueron Elb contra los tres microorganismos anteriores; Etlb contra estafilococo y cándida; Ealb contra estafilococo y en menor escala, Hlb contra cándida. La tabla 21 contiene los equivalentes de resina de discos sensibilizados para las pruebas microbiológicas. TABLA 21 Equivalentes de resina utilizados en las pruebas antimicrobianas de la V,. Koschnri. Extracto Volumen Equivalentes (41 1 ul) - , Hlb SO 1.1 80 1.76 Elb 50 1.1 00 1.7R Elb 50 1.1 190 1.76 Ealb 50 1.1 80 1.76 Clb 50 O •1.76 .Etlb 50 0.002 80 0.0056 TARLA 22 Actividad anti7nicrobíana de los extractos crudos-de la resina de la V. Koschnyi contra 2t12by12L2cf.;y11 lurcus (SO y 80 ul de extracto crudo ) Extracto o Conte-lido de Diámetro de zona de inhibición (mm) Control disco uq (caja inoculada) 2 Hib 985 1576 Blb 495 792 N' ... 1 Elb 2490 7.0 7.0 3984 12.5 12.0 Ealb 5110 14.0 14.5 14.0 2176 15.0 15.0 117;.0 ^^ Clb 630 840 - , ... - Etlb 1680 13.0 13.0 13.0 2688 14.0 14.0 14.0 Y,. SXT 500 25.0 25.0 25.0 45 TABLA 23 Actividad antimicrobiana de los extractos crudos de la resina de la y„.., Eqlltanyi (50 y 20 ul de extracto contra Cándida Albicans ) Extracto o Contenido de Di. / ..metro de zona de inhibición (mi) Control disco ug (caja inoculada) 1 Hlb 985 7.0 7.0 7.0 y - 1676 • 7.0 7.0 7.0 Bib 496 7Q2 El h ' .. .. , 2490 . ..... ....., 11.0 ... ... . .- .... 11,0 11.0 3984 16.0 16.0 16.0 Clb 630 840 Et1b 8.0 8.0 8.0 2688 10.0 10.0 10.0 SXT 600 30.0 30.0 30.0 4-6 TABLA 24 Actividad antimicrobíana de los extractos crudos de la resina de la Y. 1(osghlui contra '....:.:.treultgc.gc!:,...us pyogATes hemolítico del grupo A. (50 ul de extracto) ==================----========-= ..... ======================== Extracto o Contenido de Diámetro de zona de inhibición (mm) Control disco ug (caja inoculada) Hlb 985 .. 0,1h 49.5 • Elb 2490 21.0 2l 0 21.0 Falb 6110 Clb Etlb 1680 TAB! A 25 Actividad antimicrobiana de los extractos crudos de la resina de la y, Koscpnyi contra E., 11911 (50 y 80 ul de extracto) Extracto o Contenido de Diámetro de zona de inhibición (mm) Control disco ug (caja inoculada) • 1 2 . Hlb 985 1576 ... B1b 495 79'7' Elb 2490 3984 ... Clb 630 840 Etlb 1680 2698 2. Inyest,.igacin de: la 5.0.r.122;:a de. 3.15 Y., Kosghnyl Pt tabla 25 contiene los datos de los extractos crudos obtenidos de kg de corteza y concentración a la que fueron preparados para las pruebas antimicrobianas. TAPLA 7(.7. Masa de los extractos crudos obtenidos de la corteza de la V„.. 1.(olc.hnyi (2 kg) y le concentración para la actividad antimicrnhiana. ===========================================================- Fxtracto masa (g) Concentración <-1-/.- 0.0001 c!'..1 (Q/m1) . 1-IC 8.26 0.05 BC 4.06 0.05 FC 15.83 0.05 CC 3.14 0.05 me o 107.00 0.05 -- Los resultados de las tablas 27, 28 y 29 determinaron la cantidad (microoramos) de extracto que produjo el mayor diámetro de inhibición. Los bioensayos Se hicieron en triplicado de cajas inoculadas. Fn cada caja inoculada se colocaron tres discos sensibilizados -con cada extracto. Cada uno de los discos contenía 1000, 2000 y 4000 microgramos;- respectivamente.. Fi análisis de varianza simple (apéndice E) estableció que existió diferencia significativa entre las medias de inhibición de 1000,. 2000 y 4000 microgramos para cada extracto activo. Estableciéndose la cantidad de 4000 microgramos de extracto activo para pruebas antimicrobianas posteriores. TABI A 27 Actividad antimicrobiana de los extractos crudos de la corteza de la V. Kolchnyi contra '.F.ijtappylgcocs,ms Aureml ATCC 25923 Extracto o Control ^ HC Contenido de disco ug 1000 2000 4000 Diámetro de zona de inhibición (mm) (caja inoculada) 1 2 3 ..... Be 1000 7.0 7.0 7.3 2000 2.0 8.0 8.0 4000 10.0 10.0 10.5 E C 1000 9.0 9.0 9.0 2000 12.0 13.0 12.5 4000 15.0 15.0 _ 15.3 CC 1000 2000 4000 -- , _ , Met.; 1000 11.5 11.5 11.5 2000 13.0 13.0 13.0 4000 15.0 U5.0 15.0 . SXT 500 24.0 24.0 24.0 . • . 50 51 TABLA 28 Actividad corteza de antimic robiana de los extractos crudos de le le 2. Koschny:i contra Stre2tococ cus 2rpdenes hemolítico del grupo Á Extracto o Contenido de Digmetro de zona de inhibic ión ( mm ) Control disco ua (Caj a inoculada) 1 2 3 HC 1000 2000 4000 E:C 1000 7 . O 7 . O 7.0 2000 8 . O 8 . O 8.0 4000 10.0 10.0 10 . O EC: 1000 9.0 9.0 9 . O 2000 12.0 12 . O 12.0 4000 1S . b 15.0 15.0 CC 1000 2000 4000 • e C 1000 11.5 11.:',1 11.5 2000 12.0 1:7: . 0 1S.5 4000 15.0 15.0 15.5 SXT 500 25.0 25.0 25.5 TABLA.29 Actividad corteza Extracto o Control antimicrobiana di=, los extractos crudos de la de la V. Koschnvi contra Cándida aibic Contenido de Diametro de zona de inhibición (mm) disco uq (Caja inoculada) 2 3 Hc 1000 2000 4000 BO 1000• 2000 4000 EC 1000 2000 4000 2.0 8.0 8.0 CC 1000 2000 4000 MeC 1000 9000 4000 7.5 7.5 7.5 SXT 500 26.0 29.5 30.0 52 Los resultados de las pruebas microbilódicas (tablas 27,28 y 29) fueron de actividad contra Staphviococcus aurElpts ATCC •25923, por los extractos MeC y Ee; actividad contra Stre2tococcus pvogeriels hemolitico del clruno A por MeC Er y BC y contra Cánd¡ga albicans por En y Mgr-C. El rendimiento alto (F;.3F,%) que obtuvo con el extracto MeC, en comparación con los otros extractos y la actividad antimicrobiana cont r.; el estafilococo (15 mm), ueron los factores que interesaron el aislamiento del compuesto activo de este extrcto. I n tabla 30 contiene los resultados obtenidos ríl: la actividad antimicrobiana de 4000 microdramos de MeC en triplicado de discos y cte cajas inoculadas. El análisis e,,,.. tadisltico apenrire E )indicó que no existió diferencia significativa entre las medias de cada caja inoculada. Las pruebas subsiduientes se realizaron en triplicado de cajas inoculadas. 53 TABLA 3() Actividad antimicrobiana del los extractos di., de la 11f:pschnvi contra ',Btarihvlocpcul Aureus la corteza ATCC 25923 (contenido riel disco= 71000 n) Extracto o Disco Diámetro de zona de inhibición (mm) Control (caja inoculada) 1 2 HO c. - - . BC ,z,.. 10.0 10.0 10.0 b 11.0 11.0 11.0 c 10.0 10.0 10.0 rri...-., .:.F..t 15.:3 .15.:3 15.5 b 15.5 15.5 15.5 z.: 15.0 15.0 .15.0 .. CC a. ty . .. MeC 15.0 15.0 15.0 15.5 15.5 15.0 15.0 15.0 15.0 24.0 24.0 24.0 94.5 94.5 24.5 9A .0 94.0 24.0 54 55 3. Aislamiento del Principio ac..tivo de la V.,... schnyi contrp Staphyloccul aureus ATI-C El extracto Mee (100 g) se evaporó en rotavapor y se disolvió en 1000 miiiitros de agua destilada. Un sólido oxidable de color rosado fue insoluble y se filtró al vario. Este sólido le llamó T, no presentó actividad antimicrobiana y las pruebas cualitativas para tanino compuestos fenólicos dieron nositiva.z1. f .j.itrado (artivin) redujo a 500 mi y se le agregaron 500 mi de etanol. esta soluc ión se le precipitaron los flavonoides y compuestos afines con un exceso de acetato de plomo (10%). El precipitado de sales de plomo. se filtró al vacio y se descompuso con ácido sulfhidrico, n1=Y-mzzarPti-tri con ácido clrirhidriro 7 sulfuro cie hierro. A este extracto, rico en flavrmoides, se le denrimin Los resultados de los bioensayos fueron de actividad exrlusiva de F. El extracto F se fraccionó en tiras de papel filtro de 2X 20 cms (Whatman No. 42), utilizando agua como fase móvil. observaron tres bandas a lo largo de le tira, de las cuales la banda del extremo superior (FS) presentó actividad. FS se dividió por cormatografia en columna de Sephadex 100u) con metanol como eluvente. Se colectaron ocho fracciones (fl, f2,.. f8). Las fracciones fl f8 se analizaron por cromatografia en capa fina de sílice. gel (.2 mm de espesor). El sistema de 56 solvente fue la capa orgánica superior de la mezcla n-. butano?, ácido acético y agua ( 2:2:2) (SAT), y el reari.-ivn ríe sal F: Fast Blue (F.92) se utilizó como revelador. (cromatogramas en apéndice B). CO11 el análisis de cromatografía se unieron las fracciones 1 originándose la frarrión FA, activa (18 mm de inhibición); 3 y 4, FE y las fracciones restantes C. La fracción FA, se aisló en capa preparativa de sílica del, fase móvil SAT y agente cromógenico FRs. ver apéndice .3). Fue - interesante notar que la solución F( poseía una fluorescencia azul (UV 366 nm) qu,..! cambió casi inmediatamente a verde. La posibilidad de la presencia de compuestos oxidables, limitó la libertad del manejo de muestras.v se tomó especial cuidado en mantenerlas alejadas de la luz y del aire, cubriéndolas con papel de aluminio y no llevándolas a sequedad. Pi fraccionamiento de FA (0.8206 g) se .11evó a cabo en columna silica (0.063-(_i.2 mm) eluyendo con cloroformo- etanol 50:.50 y colectando fracciones, según las bandas r.tertadas ron UV 366 nm. Las fraccinnes se identificaron comn FA2-1, FAS-2,..FAS-13. Para la microbiolhqira, las fracciones se F` a 4 mi. los discos se sensibilizaron con 80 ul de estas fracciones. La tabla 30 contiene. los resultados de estas pruebas, atribuyéndose la actividad a las fracciones 57 FAS-11 y FAS-12 con 20 y 30 mm de diámetro de inhibición respectivamente. El análisis en TIC de silica, con cloroformo como fase móvil y UY 566 nm sugirió la unión de las fracciones, dando origen a la subfrac'ción FAS-(11-12) activa. FAS(11-12) e hizo la cromatografia en columna de sílice con cloroformo- etanol (1000-50). De este proceso y con base en la observación con UY 356 nm, se obtuvieron las .fracciones FAS- (11-12)1,. .FAS-(11-12)9. I:- vnli4men de nuevas subfracciones se redujo a 4 mi y la prueba antimicrobiana se llevó a cabo con 80 ul. De estas subfracciones FAS-(11,12)3 y FAS-(11-12)8 fueron activas (15 y 20 mm de inhibición respectivamente). El análisis en TLC mostró diferencia en el contenido de las fracciones además de que los intermediarios no presentaron artivirlad. Se procedió alaislamiento del principio activo en FAS-(11,12)6. Este aislamiento se realizó en cromatografla preparativa de silira gel con cloroformo-etanol (1000:%). El resultado fue la división de FAS-(11-12)6 en FAS-(11- 12)6'1, ...FAS-(11-12)6'4. La actividad se atribuyó a FAS- (11-12)6'2 (15 mm de inhibición) compuesto, que se terminó de aislar en cromatografia de capa preparativa de silica gel. El compuesto activo, Rf=0.52 se observó como una ~cha café con UV 361; y 254 nm en cloroformo-etanol (100:50), e-1 reactivo de sal Fast Blue reveló una mancha roja; la intensidad del compuesto activo con UY 366 nm aumentó considerablemente al ser asperjado con tricioruro de aluminio a) 1 % en etanol; y al ser expuesto con vapores He amonfáro t~ 14n,a tnnalidad obscNra. El espectro UV (fiour;:k 11) He 200 A. 250 nm de FAS- (11,12)6'2 mostró dos máximos de 284.7 231.7 nm a una concentración de 13 uq/ml. El espectro IR (figura 12) en film mostr absorbancias a Q"'- = 3350, 2853, 2800, 1730, 1440 y 1030 cms-' . En espectroscopia de NMR, se obtuvo el espectro en cloroformo deuterado del compuesto activo FAS-(11,12)P75'2 y rie su precursor FAS-(11,12W=. El compuesto artivo (0.9 mg) presentó absorción a 3=0.8, 1.'T'S y 1j.", tir l precursor FAS- (11,12)6 presentó absorción a 0.8, 1.25 y 1.6. La tabla 33 contiene los resultados de la comparación de las actividades de fracciones y subfracciones a una concentración de disco fija. La sensibilización no pudo llevarse a cabo con 4000 microdramos de extracto debido rendimiento relativamente bajo de extractos y compuestos activos. 58 TABLA 31 Actividad antimicrobiana de las fracciones de FAS en columna de silica contra Sta21-1v.loqorcus Aureus ATCC 25923 Fracción Diámetro de la zona de inhibición (mm) o (caja inoculada) control 2 :3 FAS-1 FAS-2 FAS-2 E7 A FAS-5 • FAS-E, FAS-7 FAS-8 FAS-9 FAS-10 FAS ..... 11 30.0 30.0 30.0 FAS-12 o25 ":5.1; n FAS-13 ----------------------------- sXT 2!;.0 25 0 25.5 59 TABLA 32 Actividad.antimicrobiana de las fracciones de FAS-(11,12) de la Koschnvi contra StIlprtvlococcus Ayregs ATOC 25923 ===:.=====_==================_=============================== Extracto o control de Zona dr-, Inhibición (caja inoculada) 1 2 (mm) 3 FAS-(1),12)1 FAS-(11,12)2 FAS-(11,12)3 1F1.0 15.0 15.0 FAS-(11,12)4 FAS-(11,12)5 FAS-(11,12 )6 20.0 200 FAS-(11,12)7 SXT 25.0 25.0 25.0 60 TABLA 33 Actividad antimicroblana de las fracciones de la columna FAS-(II,12)6 de la Koschnyi contra Stapi-lylococcus Aureus ATCC 25923 Extracto Oig.metro de Zona de Inhibición (mm) o (caja inoculada) control l 2 61 FAS-(11,12)17.'1 FAS-(11,12)6'2 FAS-(11,12)6'3 FAS-(11,12)6'4 SXT 20.0 '30.0 20.5 25.0 255 25.0 . TABLA 211 Comparación de los diámetros de inhibición por algunas fracciones y subfracciones activas de la corteza de la Koschnyi contra St.arkhyloroccus auyeus ATTC 25923 = === Fracción Contenido Diámetro de zona de inhibición (mm) de disco (caja inoculada) ug 1 2 -y FAS 3000 15.5 *15.5 .i .r., .c...; FAS(l1-12) 2000 18.:::: 1 8 . 3 18.4 F AS ( 11 - .1 2 ) 6 ' 2 3000 1 2 . 0 l2 . S l2 . 0 !i:.:.; X "T 800 25.0 25.0 25.0 6 2 TABLA 34 Actividad antimicrobiana de los solventes contenidos en los Extractos y - fracciones de la 1.(oschnyi EXTRACTO ul MICROORGANISMO PY2cjefle5.1 diametrn de inhibir:ion (mm) (REPLICAS) I 2 :77:,̀ 1 '7' 8 1 -7, HEXANO 20 40 80 BENCENO 20 40 >1"-)0 ETER 20 ETILICCI 40 80 . CLORÓ- - - FORMC 40 80 Y, ... ^ ETAOL 40 80 METANOL 20 40 80 __________________________________ _ _. SXT 252.:525 3 1-...,-..> RI":̀ 6 •• - , ....._ . .. ._ ... . • -- ^GAI- G;q..1911^~ 1A.14151D.L.5]¿.1...7e51.T.151.a." illW12.1~M ATCC :258.9=i1 "'" 0.2.51tWe.~.11E ,..iek• C. ahlt.lci[hylm PA110-11,11-511mi 1111/12.1.salull Er.cc.:.1T CO;ITEZA B1 rr, T- CC --1 MeC „r I 1 3 FA F8 FC VIII 1-111 -T TH I FAS1 FAS2 FAS3 FAbil FASS FAS(' FAS7 FASE FL9 FAS O FAS11 g FAS 2 FAS13 T T r___—T i FAS(11-12)1 FAS(11-12)2 FAS(11-12)31 FAS(11-12)4 FASZ11-12)5 FAS(i 1 -12)6 1 6 r----- 1 FAS(11-12)6'l FASt11-12)61 2 FAS(11-12)6'3 FAS(11-12)6'4 PRICIPIO ACTIVO DExtracción en swIlet 2)Precipitacion con acetato de plomo 3)Columna de sephadex ilIColumna de silica gel Koluuna oe silica gel 6)Crouatografla proeparativa 7lCromatografta preparativa Figura 10. Diagrama de flujo del método de aislamiento del principio activo de la V. Koschn.i 63 ..•••••• U 2 t h l 17 7 N I )4 1.: E • , • **I i'l• , •y it 4, III t. C., ¡ 11 1! ; : 1; :1; : ti • " :1,14 . • i . i . ,...1T, , ... : , . i ... 2 . ' . . : . ' .. ..• 1 . l' '- 74 '• . 1 — . .1 . - L - t .. - _ L • 4 , .4 , ..4 1- _ . . , r .. • .. ' 1 •: -1•1 .. -1i. . - .. t .... l L. 4--.::1 41T. : !± L ,1 :` 1 --1;. - - 4 1- j,. . - 1 , •¡:• :-. • --1, :-1 •- -1 • -1 , : , - '• :41-4-4.4,-, -1" • : : -: . .. iii,• ....; :: ••, :1•.- • . . • . : : - .. - . :. - • :, . : : : t , --4_1_,,,•.".: : "•:: :, : ., . : : "::. 5.7:_:..; I; 7:1 i_:1•11.1. [.."'. i_.17.:1::.: '..: . • ... : : : ::: t"" ,.; t t ,.:. . t ; tt t. . , I : 7: : HItt.f.i. 7- . ; : ' ' .... : . ''''': t:-. : • : : • , :1: • ______•_._ ..,._ •• : . . .11-1.1. Y . .. • . : .. .. : .. : : . : • .. - . , : _.', . : • . : t :: !".' : : . . • : : :1 : .. . ..• ; : .. ; :1 U; .-; : . , , . ; • • , , ' • • • : : , • - • • -1 ' • 7 , •___ 1-'41' ' - , . , . 1, -, ' ''' 3, . :) i.d-i--, ' • ' t. .. -, ' -- • : : 7•-:.--; 1-. • • : : • ' ' ' ' • ' ; : ; : t . , : : : I': r.J:t. • • :.. i : :.'. , tt , • • -., •- . • , , 1 • . , . . . . . . . ; ti-' • • : , 71. 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I ; ,s, • ... . . " .. .... , . . , o , • 9 o SAMPLE SPECTRUM NO 4 • ,11 • 4 1- 1, • e 8, l .: 1 ... 7 '.:';'. ..:1-1.:,-... ...4.',. . , i.--.1.71, -.11 , . • ' - . 1- i ! 41, • i+' - . • r tt • • 1._¡ ,-, 4-1-, -,-• , - 4,-.--t•—: •-i4 , , V. -- • , • rr• , ' -1-H1 111,4 , 1 a • f t' • 4 441 ...'., BUZ T ! • • , 1 , , I I , I. • • sun uy mi orad , -1---t- --L-• . -44 i • , t • -1- ft: " f14,- -1144: --1-":1-, • ; T f I -44. __,,..„ ••, C 5111111111•11121111111111~151 ■ Ei 1. .1 ', [; ' +4. ' . 4+-1 w ancorszaimgaio~pgalr.•_, k lt .. -1--rr ..mando , ,...,..t._„., .1 1,..1.1„. ' . : " 1 I El mol Hill < c 1 iti'lltl. -1 111--thi- %-. e iti 4.4. H ,±•• r-1. -*.t 1 -r:,•-t O';-, ami . . poli li 1 , a ;1.4_441 . • III ' 111 11111 4.. KIM ,,4 ' womminz A I- • 1 I II - • I , II —L1 rt_t ..... -Fi 4:r-i1-11-1-1-1 -4- p• .-r •• i ri---1- ri-, •T liang. .t..rr ...... IIIII .4... • .,_ . •• I • ,...1- 4 , , < -`-'-'• ••• • '-f i 111:1-1- • • .11 .1 .. ,_. -4...,¡ 114. i-1.4-1 -i- I f..._. ~iir:g.' , I .1 -.1•1[7"-''-..T.T., .1 : .,..-1 ' ,-.- • • 1 t... < .T _..r, • • - ^ 1--' - ', i111' 11!"- r 1 1 ;ir -1, t- I.: ,-'-'' ¡I- , 4 / 1 i .,. I '-.1- .1 • 4-- .inte T . i „ ,± --• - t+ + .. ig 11 4-1 7 T-r! LI ' II < 1 < -‘ • ---, • •••{ t ..,-T. •-•-- • ... - ,.., l'44-' i -14 -.-1- 17 , ii--, tt• ' ,-, 1 -tr - • 4-.H 7' r ' T .4.4 _ 4-1 . Fi < 4- --1. • 1 T-T-r : : - :-. 't ' • .... . - • - . -.- _. - -- .- H':-i '1 --1;- . .-. h-• ami' • t. I t••:1-1 " . i t . •-rr I"- 1/ 1 4 , i 1 A " • ,-I '-',- o ; 11-1- ,:.1 . - I.., , - • -.- i 1-, •,..., - - ; -- . tr 't •-'' -i l'' ' - -.J_. Z__ .4, di: ♦ ,. 7 -4 A 1-1 -1 441 , i -Ir r _u. 1 -1-r 1-1•;-1. • i.: ,_-!__. • 1:1-1 ' T-‘: 1.iI I t-1. 11' • """ • . ... • -1 1 I-' 1 il I ! : .-- ' • • • • I 1 • ' '' ; 11 -.11, -1 • • '-i-H 1117 1 '. • .. • t4 • "1 s 4- ' 111y ..i-1- -r-' i.'-t- f -!-4 1 -11-4 - i , •.'" • , • : i • •11- 1" • 14 '14- i r ..."*. , ' ' '•, ! . • '11 : '-' • ,•• • ' • . 1-1--11- I -1-t1 ' • t•I -t. :ii 1-1-4-.•Ct.•• lItt- ''' O 'ti . •,•1 : • '•,•T 7---1 1,-14 -•,..k • 1- •,-"M •••!-:-! ! rr 04 ' -pre'4"..-t •-.• 1--1-• -ti T-1 rt-.•: . ;11" , -71-, ' ir •,- r• 'i'l .1 4_,_. .1.i -,-4- i- 1 Y 4 t.. ..r'.- i ;01- ' i ' : • ,- 2 , . . ..... ,.....V--- 'P' .. , .. , ... •'..: '.:1 . ' '.7:i , • '. , ....1. 1 1. i ,_, • -4-.• 4 _ • . • • • ----• , 1 • '-'-i ' 11 1 ^ ' ' ' ••• ,, - I- , „ '1- -1- ..• lt-4-i. ' _, ... 1 "1-/ .1 -+ -114 -11 • : • ! • I „ . . 1411 ! • • ' 11 • • • ! • !TI! " I ' 1 •-1 • I " 1'1 - - - - • : • '• i • i l •-1 I . . i • .., , I 1 , , ! I 4 . • • -I-•-! ' , 4-4 .- - . •-,-- 4..- 1 .p_ _ _.:+H._ _.., _. 1 •T -iii'-'• 1 ' j+H-' . 1-• L. -+ 4-1 - 1- - 7--r -- - • 1 , , ! ' 1 • , I " ' ' • - lier.-1- -- " • • 1 ,-!-- ' . 1 , r - 1-• , • I • ,4.1- -,- . _ 7-4 .... _1.:.. +_ , - r" ' ' , 1 { _,. _I. ...... • ll •rl. ' lif-; -1.:- --,.. 1 .. Ir S - -'4•-• • 4 ._..,_ .... _i__. 4.4.1. / , I. y... ..- -..1 •••• • — •• 1 ., r •••-/ 1 i, -• • 1 1 . • 1 - • 1 .. 1,..: --1.....,,,,....i,i....r*r.". •••• ..H-• • -. H.'...: i -I /. .1 . : '1" t "'-',- .-t - ...- •• 1 ..,• ,.• i : • -. • •¡••• i ... . 1 .7.1 7- — .. NOISSIWSNV211 1N3D2i3ci o o o o o o "ct o o co o o N o o F I G UR A 1 2 . o o o 41 C•1 o CO z S PE CT R U M N O . o 4 w E L Ñ O . 0 0 7 -1 4 9 3 TH IC K N E SS C O N C E N TR A T IO N 4 o CO S C A N M O D E o N. 3 I In O 13 d S dlAIN zH1N 09 09C-V\13 "" • o o t . 1 O o • (4 1 . \.0 r•-.1 • r-T-1 o rl o 4) E o r4 Ti o o o reN r-1 e ;-1 ej • • \ r4 o uo!swp lueumnsu! uepeA Nthd SO. D.• 11:0: "ysn Fn OUNIlid • 50•GOZOS6 :ata FF C 11.110 E' 01 I C oled \.) uot.spmp luaLunilsil! uepun 1:13191N0111.7/g.dS dIAIN 71-4VNI 09 09C -1/V9 491 4.4t3 - - o . o FI GU RA 1 4 . 1.:1, ¿ a a x ›c• O C, 1, O ,.! ;., .... -.., O C. _ Y yy Cr( 1-1 kr5 cj 1 4_ O t. 1 a , -- ti, (., .... o 5 .r.1" I o 1 CI> E -, c... O C,1 c c.. O "- 5, -L• . t.', 7. c .. C.i FA S ( 1 1 -1 2 )6 ' H313111013.1.03dS WJN 71-11151 09 09£-LN9 i • 1-1 • 2.. LL: • o O O ; . r•4 _ • ̂ I . - . 1. • :: . . . . . g .. _ 1. .. - '. 1 . i _ ' - 1 • .... . . . . . • • lio!-;!impluoLunllsu! LX:11.1A '8 eT. vz . DISCUSIONI A. fnvesti.qación Fi.togs4mica Los resultados de la investigación fitoquímica de la chnvi. sugirieron la presencia de flavonoides, glicósidos cardiotónicos, compi~tos saponinas y taninosi tanto n la corteza como en la resina. Flavononas, chalconas, derivados del catecol sy' flavonoides con dos hidroxilos fueron evidentes en ambas r,a--1. 1-..= di. l.. • • Flavonas y flavonoles en la corteza y 1.-,,ucn..tntoci;kninas en la resina. En los extractos etéreos y alcohólicos se estima la presencia de glicósidos cardiotónicos y compuestos esteroidales. La formación de espuma de la resina cruda y su extracto alcohólico, y del extractO alcohólico de la corteza fue significativa, en adición al test positivo de hemólisis que la presencia de saponinas. Durante l almacenamiento de la resina cruda y de los extractos alcohólicos Etla, Etlb y McC, ocurrió la formación de un precipitado rosado que dio las pruebas de taninos y polifenoles positivas, indicando la posibilidad de :inos Los alcaloides solamente pudieron revelarse en TLO con el reactivo de Yodoplatinato y con el método de aislamiento para plantas con menos del 1 % de su contenido, lo cual sugiere la posible presencia de una baja csntidad de compuestos nitronenados en la resina . La corteza resina de le. os,ctrvi presentaron un contenido de metabolitos oxidables considerablemente alto, desde el ¿ambio visual de obscurecimiento de la resina pura, y los >¿tractos alcohólicos hasta cambios en las subfracciones activas. Considerando que en el género Virola se han reportado biflavonoides, ésteres de carene. larga, diarilpropanos y sus derivados - 'id t. existe una alta probabilidad de que también estén presentes en la 121„_. Koschnvi. B. Acti ida,d t^ntimisrobj-ana La actividad antimicrobiana de la resina fue verificada .en los extractos hexánico Hlb, contra Cándtda alb.icans; etéreo Elb contra „...tabhylornccus Streptomccus yogenes; un comnuestos aceitoso Ealb contra Staphylococcus auréus y etanólico contra St,a2h 122222w1 auresus. La presencia de activid7-kd en extr.,...ctos diferentes y contra microorganismos diferentes aseguran la presencia de más 1-1e un compuesto activo en la resina de la Kosch-lnyi. El resultado anterior también se presentó en la corteza. Contra 2taphylococcus aureus ATCC 2.5923 los extractos activos fueron el metanblico y el etéreo, Contra nogenes hemolitico del grupo A el extracto metanólico, etereo y bencénico y contra Cándida al.picans los extractos 70 71 etéreo y metanólico. En cuestión de equivalentes,' la mayor actividad la presentó el extracto metanólico en la corteza y el etanólico en la resina. Fue evidente que la resina produjo una inhibición mayor contra Cándidl albicans, que la corteza; lo cual estableció la presencia de una mayor concentración del compuesto acti'vo responsable de dicha actividad en la resina. Dentro de la actividad antimicrobiana del extracto metanólico de la corteza contra el 5.tapbylo£pocys aureys, los resultados de la tabla 31, muestran la presencia de más de un compuesto activo. En la tabla aparece la fracción FAS-(11- 12)3 ,con 1.5 mm de diámetro de inhibición y 1..a fracción FAS- (11-12)7 con 20 mm. El análisis en TLC, indicó diferencia ...ntre los componentes de las fracciones' además de que las fracciones intermedias no mostraron actividad. La tabla 33 contiene los resultados antimicrobianos de las fracciones activas y del principio activo a un contenido de disco fijo (:1000 No). La menor actividad del principio activo FAS(11-12)6'2, en comparación con la actividad de la fracción FA;=;(11-12) concluye la posibilidad de sinergismo entre las. diferentes -fracciones activas. C. Clracteriza“ón del cAlppuresto activo Los resultados del análisis del método de aislamiento,. TLC, pruebas cualitativas y espectroscopia proponen un compuesto activo contra StRphvioqoccu,5 Pkure!.As ATCC 25923, 72 del tipo fenblico con cadena alquIlica y grupo carbonilo, presente en la cote7a de la L. primera fracción activa se obtuvo de la precipitación flavonoides y co(jtnuestos afines con acetato de plomo, un mátodo especifico de aislamiento de flavonoides y compuestos afines (Dominguz, 1979). El compuesto activo reveló en TLC de silica Gel (0.2mul), clorofnrmn-etannl (100:50) como una mancha roja con Rf=0.52 con ¿I reactivo de sal Fast Blue (EDS). Reactivo revelador de flavonoides por la formación de compuestos azo. (Wannls-r, 1 984 El compuesto activo se obscureció en presencia de va-'ores amoniaco y ss, intensificó con tricioruro de aluminio al ser expuesto a luz UV de 366 nm. Los hidroxilos fenólicos libres se ionizan a un pH=11-12 y los flavonoides forman quelatos con tricloruro de aluminio entre el Grupo carbonilo y el hidroxilo (en C3, C5 o su equivalente). (Goodwin, 1976) El espl..ctrn de IR del romnuesto activo en film presentó absorbancias en .0 11.5r (cm=:') 33S0 Cestiramientn de OH?, 2852 (metileno alifatico), 2800 (metilo), 1720 (estiramiento de carbonilo) y 1440 (1:.stira.minto C-C de anillo). El espectro UV ( 13 ugimi ) de 190 a 250 nm en etanol presentó MáXiMOS a 284.7 y 231.7 nm. El espectro HP' H'NMR se llevó a cabo en cloroformo deuterado. aE3ca cantidad de muestra ( 0.9 mq ) dio como resultado una concentración deficiente para la obtencion del espectro de NMR. Sólamente se hizo visible la absorción en la región de sustituyentes alifáticos a t=0.8, 1.25 y 1.8; y en condición de amplitud relativamente alta nue no permitió un análisis adecuado de los picos. Al comparar los espectros de NMR del compuesto activo y su predecesor FAS(11-12)F,, se observó la absorbancia en la misma región. Con este resultado se limitó la conclusión a la presencia ,_ uk,. una cadena alquilica larga enr compuesto.t 73 VII. CONCLUSIONES El análisis del método de extracción, las pruebas cualitativas y espectroscopia- d= IR, UV y NMR sugirieron que el principio activo de la corteza de la Virola Kgschnyi_ contra el Ilaphyjcgcqu5.1 Avre91. ATCC 25923 posee un grupo fenÓlico con cadena alquílica y grupo carbonilo. La actividad antimicrobiana contra Cániida albí,..,:mu. 1:'jtregl:1,gcoccus Pvogenes del grupo A 1:9 hemolítico y Stapbylococcus Aureus ATCC 25923 en extractos y fracciones diferentes en la corteza y resina aseguran la presencia de más de un principio activo en ambas partes de la planta. La actividad antimicrobiana contra el S. aureus ATCC 25922 se atribuyó a los extractos Elb, Ealb, Etlb, EIC, EC y MeC. Contra C_ albicans; Hib, Fib, Ftlb, EC y MeC; contra Staphylococcus pyogenes El hemolítico del grupo A: Elb, inc, EC y MeC. La actividad contra Carl0j.da Ilbilpip pareció ser mayor en la resina que en la corteza lo que podría indicar una mayor concentración de dicho principio activo dentro de la resina. La investigación fitoquimica de la corteza y resina mostró el contenido .de flavonoides, saponinas, taninos, glicosidos cardiotónicos y compuestos esteroidales. La formación de espuma y hemólisis de sangre son dos características de los extractos alcohólicos. Además de la nresencia de metabolitos oxidables entre ellos taninos de alto peso molecular. 75 VIII. RECOMENDACIONES El estudio hasta aquí realizado de la actividad antimicrobiana de la Virr3- '-ischnvi recomienda la investigación futura en los siguientes aspectos: Determinación de la estructura del principio activo, así como de sus propiedades físicas v químicas. -Determinación de la presencia de otros principios activos y propiedad de sinergismo dentro de la planta. Cuantificación de la actividad antimicrobiana y. estudios de de actividad contra otros microorganismos. -Determinación de los metabolitos presentes y su relación con posibles reacciones adversas, dado el uso exhaustivo de la planta como remedio popular. -Oxidación y otros cambios químicos que sufre la planta durante su almacenamiento y manejo. -Estudio de otro tipo de actividad considerando su uso medicinal en la curación de úlceras y gastritis. IX. BIBLIOGRAFIA Balows, A.; W. Hausler, K. Herrmann, H. Isenberq y J. 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Es técnicamente simple pero requiere especial cuidado en la reproducción de resultados. El examen se ha utilizado para organismos de crecimiento rápido como miembros de la familia -Enterobacteriaceae, especies de St,1-.1:pbyk25.2,15..1.11, y enterococci, pero se ha adaptado el examen a otras bacterias como estreptococci y Pseudomonas, Aci ,.,un y „,,..?:115.t.,A=. Las deficiencias del test difusión son su interpretación no cuantitativa, su inaplicabilidad para muchos organismos de 82 crecimiento lento y anaeróbicos. Sobretodo el método de difusión de disco es efectivo para un análisis rutina, pero debería ser complementado con un test de dilución cuando aplicable o cuando se requieran resultados cuantitativns. Medio de Agar: El método de difusión .de disco ha sido estandarizado con agar Mueller-Hinton. Algunos microorganismos requieren de la adición de sangre desfibrinada al 5% de caballo, carnero u otro. Los discos de papel filtro que contienen los agentes antimicrobianos estan certificados para el examen de susceptibilidad en frascos específicos y con desecante. Los discos se guardan bajo refrigeración (2, 3°C) o conoerados a -14°C. Inoculación de platos: El método estandar para la preparación del inóculo, implica tomar de tres a cuatro colonias bien aisladas con una aguja o aro y colocarlas en un caldo de digestón soya caseina (4 a 5 ml). El caldo de cultivo se deja incubar a 35 O hasta la aparición de una turbidez visible. La turbidez puede ajustarse con solución salina o caldo para obtener la turbidez del preparado stándar por adición de 0.Smi de 0.048M de cloruro de bario, a 99.5 ml de ácido sulfúrico 0.36 N (1% v/v). Esta turbidez es la mitad de la densidad del estándar número uno de McFarland y se refiere generalmente como estándar 0.5 de McFarland que corresponde a 1.5 E 3 bacterias por ml de suspención. Procedimiento para el test: Antes de inocular los PIatos, 15 minutos antes aproximadamente, los discos impregnados se aplican a la superficie de los platos inoculados con un dispensador o pinza estéril Todos los discos se presionan sobre el ager. El espacio entre cada disco debe ser mayor o igual a 15 mm, después de le, 18 o 24 horas de incubación, los platos son examinados y los diámetros de inhibición. Los diámetros de las zonas de inhibición de los agentes antimicrobianos individuales pueden reportarse como equivalentes MIC, pero son transferidos a susceptible, intermedio, .o resistente por medio de una tabla de criterio interpretativo. Fuentes comunes de error: Aunque el método de difusión de disco es un método sencillo, errores técnicos pueden interferir en la reproducibilidad de los resultados. Los siguientes son los errores comúnes encontrados en laboratorios microbiológicos: 1. Preparación inapropiada del agar Mueiler-Hinton 2. Almacenamient,-, inapropiado de discos. 3 Estandarización inadecuada de la densidad del caldo de cultivo 4. Inadecuado mantenimiento de la turbidez del estándar 5. Incubación excesiva de los platos €;3 6. Lectura de los resultados después de 24 h 7 Mezcla de cultivos 8. Error de transcripción al colectar los datos Mas información acerca de la técnica de difusión de disco puede encontrarse en el Manual de Microbiolodia Clínica de Salows et al. (Balows et al' 1991) 84 APENDICE ANALISIS EN TLC: DE LA VIROLA KOSCHNYI A continuación se presentan los cromatogramas del análisis en TLC de las fracciones artivas de la V . Koschnyi. Se utilizaron Cromatofolios al de silica gel de 0.2 mm de espesor (Merck). Clave de colores: R= rojo V= verde E:= blanco Az= az¿d Am= amarillo C= celeste Ca= cate An= n.g.rwrija CROMATOGRAMA No. 1 Fracciones de la columna de Sephadex del extracto activo FS: -Sistema de solvente: SAT IA. Vis 18. Reactivo de FES E 6 A r. A á é P r ‘(- /Ai 4 .1 8 22 i 87 CROMATOGRÁMA No. Fracciones de la columna de sil gel de la cromatografía de FA: FAS1..FASUD. -Sist~a de solvente: cloroforfflo 2A. UV '54 *-173. UY 2C. Reactivo FES 5 JIAz í 0 y •-- ("'"' A . . ..... i e ....----; • ...., AZ ..,,, / . 11 4 : A 2 A 1 1 31 Si, 4. ? '•?•,...4/1.1,1 13 r 7 set 1.";> -4- 9-Q gro v2 2c CROMATOGRAMA No. 3 Fracción FAS(11-12) -Sistema de solvente: cloroformo-etanol (1000-SO) 3A. UV S66 2B. UV 2S4 3C. Reactivo FBS 88 ‘,W FASO -t z; 314 Ff15,( 1 ` - ir) 3 II ev4.11 - - 2C CROMATOGRAMÁ No. 4 Fraccionamiento de FAS(11-12) en ccdumna de sílica gel: FAS(11-12)1..FAS(11-12)9 -Sistema de solvente: cloroformo-etanol (1000:SO) 4A. VIS 4E. (JV 355 40. UV 9F;4. e9 ) • 1 2. 3 A S t 9- A G 7 e 3 . S" l'e 7 ?: 4c 54:1' ••• c'RnM(TOGRAMA No. .5 Fraccionamiento de FAS(11-12)6 0n columna de silica: FASI:11-12)6'1..FAS11-12)6'4 -Sistema de solvente: cloroformn-etanol i:.1000:s0) 5A. VIS SR. UV 3f=5 5C. UY 2S4 c • -T / . Z 3 r 4 2. 3 4 C- A A 90 APENDICF C Extracción de alcaloides en plantas con menos del 1% de contenido Dos gramos de la Planta se pulverizan sobre un mortero con 2 ml de solución de amoniáco, luego se mezcla con siete ) gramos de oxido de aluminio básico. La mezcla completa se empaca en una columna de vidrio (1.5 cms de diámetro por 20 / rms de lardo). Las bases alcaloidales se eluyen con 10 rol il'11 de cloroformo Los primeros 10 ml eluídos se colectan y se evaporan a 1 mi, el cual se utiliza para cromatografia. (Wagner 2.1. al, 1984) Reactivo de Ynrionlatinato (IP) 0.:3 . a de ácido hexacloroplatinico (IV) hidratado es disuelto en 100 mi de agua y mezclado con 100 ml de yoduro de potasio al 6%. Las placas se asperjan con 10 mi y se evalúan en visible. Detecta compuestos que contienen nitrógeno. APP-NDICP D Limites del diámetro de zona de inhibici con discos antimicrobianos seleccionados para el ATCC 25923 Agente antimicrobiano diametro de la inhib (contenido de disco) (mm) 11' xilina/acido clauvico 28-36 (20110 ug) Ampicilina (10 ug) 27-35 Ampicilina sublactama 29-37 (10/10 ug) Cefaclor (30 ug) 27-31 Cefuroxima (30 ug) 27-35 Ciprofloxacin ug) 22-30 Netilmicin (30 ug) 2231 Trimetoprim (5 ug) 19-26 Trimetropimisulfametoxasol 2.4-32 (1.25/23.75 ug) SulfametoxasOl 24-34 (250 o 300 ug) 5n r.A.J12:111 ición APENOTOF A1-11i‹,,,.is de varianza para la actividad antimicrobiana de la y. Kos.Ihriv.i, A continuación se presentan las tablas con el análisis de varianza para cada uno de los extractos activos con sus respectivos microorganismos. Se aplicó análisis de varianza de una va y la prueba B tukey para determinar la diferencia entre medias de los diámetros de inhibición, dentro de los extractos Y dentro las cajas inoculadas. Asi mismo se determinó las diferencias entre los diametros de inhibición de extractos. El anaIisis de varianza (ANOVA) se llevó a cabo con el programa SPSS. SP8S/ PC + Tm versión 3.1 Copyright SPsS Inc. 1984., 1985, 1986, 1987, 1988, 1989 Portions Copyright (c) Microsoft Corp. 1981, 1983, 1994 1985, 1986, 1987, 1988 44N. Michigan Avenue, Chicago Illinois. Clave: 1:XT= Extracto DIA= Diametro VOL= Volumen (u1) CONT= Contenido (ug) GRnUP= Grupo pra jg la rEsir,:t uni.ra azeL,E. 2r EXT 80 353 4 Ea :.b •er.1 Et.ID SO 1 • • /06 MORE ONEWA.Y Variable DIA By Variable EXT Analysis of Variance • Source D.F. Sun of .Squares Mean Squares • F F Ratio •Prob. Between Groups 9 126.6333- 140.0704 8484.2222 .00158 • Within Groups 20 .333 .8167 Total 29 1262;9669' ONEWAY - Variable '5IA By Variable EXT Multiple Range Test • Tukey-B Procedure Rangel for the .05% ievel - '3.98 4.29 4.48 4.62 4.73 ERROR b123 Can't write to listing fila 4.82 4.89 4.95 5.81 ' .The ruges aboye are tabla ranges. The vague actually copared with Mean(JI-Mean(I) is.. .0913 : Rafige t Sutil/Mi -1 1/WW)) U Denotes pairs 1f groups significantly different at the .858 level • 104- •.• ONEWAY Variable DIA invitinuedl • Mean • Gr.p GGGG 35 GGGG rrrrrrrrrr PIPPPPPPPIPP - 1 1 2 7 8 3 4 9 0, 5 6 .0020 Grp 1 .0000 Grp 2 .0000 Grp 7 .0i730 Grp 8 - 7,0022 8rp 3 12.1667. Grp 4 13.0%00 Grp 9 14.em Grp10 14.1667 Grp 5 11:111 : ONEWAY 'Variable DIA (CutInued) GGGGGGGGG G rrrrrrrrrr • PPPPPPPPPP— . 1 Mean ' Group . 1 2 711 3 4 9 0 5 6 15.0001 drp 6 :t$ ::::$ 1. MORE MORE Epoogeneous Subsets (Subsets of.groups, whose.highest and lowest means do not differ by llore than the shartest signif¡cant range for a subset of that Size) • _ , SUBSET .1. Group . Grp 1 • Grp 2 Grp 7 Grp. 8 Mean .00210 .02,05 .0000 alzo SUSSET 2 Gro4. .Grp 3 . - Mean 7.0005 SUBSET 3, • Grpep Gip 4 Mean 12.1667 MORE SUBSET . 4 Gt7nup Grp 9 Mean 13.21,00 inSET 5 Group Grp10 Grp.5 Mean 14.00Z2 14.1667 SUBSET . 6 Group Grp 6 Mea. 15=02 • TABLA E.2 ANOVA para la actividad antilicrobiana de la resina contra Cándida albicans. (tabla 23) GROUP EXT - VOL I Hlb SO 2 Hlb 80 ,., 81b 50 3 Á Blb. 80 5 Elb SO. 6 Elb 80 7 Clb SO 3 Clb SO .') Ftib SO i 10 Etlb 80 oq 3.11FT.V QNEWAY ' Variable .DIA . ERRCR 602, Can't write tú listing filo By Variable EXT Analysis of Variance Su& .of • Mean F F Source D.F.. Sliares .Squares Ratio Prob. Between Sroups . • 9 . 872.7220 -96.969 , . . . • , . Within Gro45 1 _ ',11 .2222 .2202 Total- 29 . 072.7201 TABLA E.3 ANOVA para la acti .idld antiniordbiana de la corteza contra Staohylococcus aureus. (tabla 27) GROUP EXT CDNI 1. HC 1000 2 / He 2000 3 HC 4000 4 BC 1000 5 BC 2000 6 BC 4000 7 EC 1000 8 EC 2000 9 EC 4000 10 CC 1000 11 CC 2000 12 CC 4000 13 he 1000 14 Hee 2000 15 MeC 4000 II/ - "T.1777r • O N E14AY Variable DIA By Variable EXJ • kalysis of Varia7.ce - Su Mean F F . lource D.F. Squares lquares• Ratio me& , Between 223 14 1511.6298 111.5450 7381.6534 ...0000 • ' Within, Oroups 33 .4533 . .12' Total 44 1562.0831 MORE O ti E 14 A Y - Wiable DIA Dy Variable EXT . Multiple Range Test TeleY-Fi Procedure Ranges for the .050 level - 435 4.35 4.53 4.66 4.76 ' 4.84 4.91 4.97 5.02 5:07 • 5.11 5.15 5.18 5.21 The'raoges- above are table ranges. 3\ate actually co9are0 with Mean(J):-Mean(I) is.. . .U1169 t lenge Sgrt(1/14(I) IIN(J)) (I) Denotes pairs of 3Gp slbnificantly diffErent at be a2 18Ñ MOIE 1101E 8866E66813666. 6 6 rrrrrrrrrrrrrrr PPPPPPPIIPPPPPPP 1 1 1 1 11 Mean Group I, 2.3 0 1 2 4 5 7 6 3 8 4 5 9 . • • .0119 Grp 1 . .000.1 Grp 2 • ./Z21 Grp 3 .11ZZ Grp10 'Irpll -.0020 .Grp12 7.1221 .Grp 4 11$ :1; • 8.02110 Grp 5 1 4 ;', 4441 9;0200 Grp 7 1 4 t -t 1-1 1 10.1667 • Grp 6 t1litt$1$' • 11..52,10 6rp13 11141;1:11.1' • 12.1667 Grp 8 1'1141'1111;$ 13.0020 Grp14 . 11$1$.11411.11 ,15.0000 Grp15 • 15.12U Grp y 4t$Iilt$tttt • MORE homogeneous Suhsets 1Subsots pf voups, whose highest and towest . means do not differ.by more thah the shortest significant range.for a suhset.of that sise) • • BUDGET 1 - Gr-Dup • Grp 1 Grp 2 Grp .3 . Grp12 . Grp11 000 007) 0han .0 J • ..002„ .0000 .0020 Group, '•Grp12 SUSSEI 2 Crup, • Grp 4 Mean. 7,1200 • )13 e . SUBSFT 3 Group Grp 5 'lean 8,001J SUBSET Group UrW - Men • 9.1111 SUESET 5 Group Grp Mea. 101667 Group Grp13 Mean 11.5000 SUBSET 7 • GrDup Grp 5 Meafi 12.1667 SME; a Group Grp14 M'en 13.0002 • .Group .2/> 'Grp 9 Mean 15.5120 . 15:10G0 M2RE MORE TAELP: E.4 ANOVA para la actividad antiliErebiana de la cmteza entra SUKHECECUS vodps. (tabla hi GROUP rn- CriNT 1000 -20GC 4 SC .100 BC 21300 5 EC 4 lllllll EC EC 9 EC 4000 11 2000 12 CC 4000 13 MeC 1000 14 MeC 2Cl00 15 MeC ,11-1-10 MORE O N E W. A Y . Variable DIA - By Variable EXT Analysis of. Variaoce. . Source, . D.F. Sul of Squares ; MEC:, Squares F F Ratio.'Prob. .Betwaen Groups 14 1562.5458 111.4676 9288.9632 '.2222 Within Groups 30 . .3622- :3122 Total 44 1560.9258 MORE EitiEtiAY Variable. DiA By Variable EXT MultiPle Ranga Test Tukey-B Procedure .Rangel for- the .050 level - 4.25 4.35'".4.53 4.66 4.76 4.84 4.91 4.97 5.02 5.27 5.11 5..15 5.18 5.21 The rang25 aboye .are tabla rabges., • . The value actually compared with Maan(J)-Mean(I) is.. .2775 $ Ranga $ Sqrt(11N(I) 11N(J)) 1i) Der!cites pairs of grGups signifiuntly different atthe .252 level 16 . Un Group • MORE GGGSGGSGGGEGGGG rrrrrrrrrrrrrrr PPPPPPPPPPPPPPP 1 1 1 1 • 1' 1 • 1 2 3 6 2 4 5 7 6 3 2 4 9 5 .122D Grp .0202 Grp 2 .0209 Grp .0920 Erp13 .6000 Grp12 7.046 S'u•4 III*: t B.ZUD Grp5 Itittít 9.0063 Grp 7 $III* $t1 10.Z2OZ Erp 6 tXtítItt$ 11.4333 Grp13 $;$1$1tItt 1231106 Grp 2 illittlytt$ 13.1567 Grp14 11$11$1$1$ti 15.6000 Grp . 7 tlt$ttlttt.ttt 15.1667 Grp15 ittlItIlltIlt MORE Hdiogeneaus Subsets (Subsets df groups, whdse highest•and lowest seani do not diifer by mor¿ thán.the shortest significant range for a subset of that size) . SURGE .1 Group Grp 1' Srp 2 Grp 3 Grp10 Grpll Mean .0802 .012 AZOO • 3000 . .0002 Group, Grp12 . Mean .2Z00 1!BSET 2 3rsup Grp 4 Mean 7.0Z00 • " :C. 7 • 7.,... SUBSET 3 ' Group Orp 5 Mean :9.11112 SUSSET 4 Group Erp 7 ;lean •SUBSET 5 - Group Grp Mean 12.1000 SUISET 6 Group Grp13 Mean 11.4333 • SUBSET 7 SrGup Grp 8 Mean 12.1000 SUBSET 8 Group - Grp14 Mean 13.1467 • 7. v., • SUBSET 9 MORE MORE' Group Grp 9 • Irp15 Mean 15.0050 15.1667 TABLA E.5 ANOVA para la actividad antizobiana de la corteza contra Stadhvlococcus aureus a un contenido de 4000 ug (tabla 30) GROUP EXT CAJA 1 He 1 -) HC 2 3 He 3 4 EC 1 5 EC 2 . 6 EC 3 7 EC 1 8 EC 2 9 EC 2 10 CC 1 11 CC 2 12 CC 3 13 MeC 1 14 MeC ,.› k 15 he 3 16 SXT 1 17 SXT 2 18 SXT 3 MORE ON E W.A Y Variable PRO BY Variable Ent Analysis- of Variance. . Sourc'e D.F. Sguares .i -;; cf • Squares F . F Ratio Prnb. Between Sroups • h .0002 . ::0009 / . Within Oroaps O .0000 .2010. ' Total- 2 .0000 - MORE 9 N E W*A Y Variable PRO. By Variable CAT Analysis of Variaace Sia of I Mean F. F Jource . D.F: Squarés. • -Squares. Ratió Prob. .: . .. . Between Groups 2 '...004 -. .0015 Within Groups . e azio • Jim • -. . Td:"al 2 .01130. izó .0185 ONEWAY.. VAriAhlP PRO • By Variable CAT Aaaiysis dVJQ2E en of Mean F F - DF Squaras SqUares Ratia ?r• MORE Between Groups Within Sreups Total -2 .0115 ONE-WA k.)ariablP PRO By Q6&2 .%¡ Analysis Veri-ance Source Sua tf .Squares p Mean Squares Ratio e2. . Between Sroups .. • 2 . .S# - .0000